قياس محتوى الحديد غير الهيم في الأنسجة باستخدام فحص كولوريمتري قائم على الباثوفينانثرولين

Tiago  L. Duarte; João V. Neves

doi:10.3791/63469

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

هنا ، يتم توفير بروتوكول لقياس محتوى الحديد غير الهيم في الأنسجة الحيوانية ، باستخدام اختبار لوني بسيط وراسخ يمكن تنفيذه بسهولة في معظم المختبرات.

Abstract

الحديد هو أحد المغذيات الدقيقة الأساسية. كل من الحمل الزائد للحديد ونقصه ضاران للغاية بالبشر ، ويتم تنظيم مستويات الحديد في الأنسجة بدقة. كان استخدام النماذج الحيوانية التجريبية للحمل الزائد أو نقص الحديد مفيدا لتعزيز المعرفة بالآليات التي ينطوي عليها التنظيم النظامي والخلوي لتوازن الحديد. عادة ما يتم قياس مستويات الحديد الكلية في الأنسجة الحيوانية باستخدام التحليل الطيفي للامتصاص الذري أو باستخدام فحص قياس الألوان بناء على تفاعل الحديد غير الهيم مع كاشف باثوفينانثرولين. لسنوات عديدة ، تم استخدام فحص الألوان لقياس محتوى الحديد غير الهيم في مجموعة واسعة من الأنسجة الحيوانية. على عكس التحليل الطيفي للامتصاص الذري ، فإنه يستبعد مساهمة حديد الهيم المشتق من الهيموغلوبين الموجود في خلايا الدم الحمراء. وعلاوة على ذلك، فإنه لا يتطلب مهارات تحليلية متطورة أو معدات باهظة الثمن، وبالتالي يمكن تنفيذه بسهولة في معظم المختبرات. وأخيرا، يمكن أن يكون الفحص اللوني إما قائما على كوفيت أو متكيفا مع تنسيق صفيحة صغيرة، مما يسمح بإنتاجية أعلى للعينة. يوفر هذا العمل بروتوكولا راسخا مناسبا للكشف عن التغيرات في مستويات الحديد في الأنسجة في مجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية التجريبية للحمل الزائد للحديد أو نقص الحديد.

Introduction

الحديد هو أحد المغذيات الدقيقة الأساسية ، اللازمة لوظيفة البروتينات المشاركة في العمليات البيولوجية الحاسمة مثل نقل الأكسجين أو إنتاج الطاقة أو تخليق الحمض النووي. الأهم من ذلك ، أن كل من فائض الحديد ونقص الحديد ضاران للغاية بصحة الإنسان ، ويتم تنظيم مستويات الحديد في الأنسجة بدقة. يعد امتصاص الحديد الغذائي غير الطبيعي ، والوجبات الغذائية التي تعاني من نقص الحديد ، وعمليات نقل الدم المتكررة ، والالتهابات المزمنة من الأسباب الشائعة للاضطرابات المرتبطة بالحديد التي تؤثر على مليارات الأشخاص في جميع أنحاء ^{العالم1}^،²^،³.

كانت النماذج الحيوانية التجريبية للحمل الزائد أو نقص الحديد مفيدة لتعزيز معرفتنا بالآليات التي ينطوي عليها التنظيم النظامي والخلوي لتوازن ^{الحديد4}. وعلى الرغم من التقدم الكبير المحرز خلال العقدين الماضيين، لا تزال العديد من الجوانب الرئيسية بعيدة المنال. في السنوات القادمة ، سيظل القياس الدقيق لمستويات الحديد الإجمالية في الأنسجة الحيوانية خطوة حاسمة للمضي قدما في البحث في مجال بيولوجيا الحديد.

تقوم معظم المختبرات بقياس كمية حديد الأنسجة إما باستخدام التحليل الطيفي للامتصاص الذري (AAS) أو قياس الطيف الكتلي للبلازما المقترن بالحث (ICP-MS) أو فحص الألوان بناء على تفاعل الحديد غير الهيم مع كاشف باثوفينانثرولين. يعتمد هذا الأخير على الطريقة الأصلية التي وصفها تورانس وبوثويل منذ أكثر من 50 ^عاما5,6. في حين تم تطوير شكل مختلف من هذه الطريقة في وقت لاحق باستخدام الفيروزين كبديل ل bathophenanthroline7 ، فإن هذا الأخير لا يزال الكاشف الكروموجيني الأكثر استشهادا على نطاق واسع في الأدبيات.

تعتمد طريقة الاختيار غالبا على الخبرة والبنية التحتية المتاحة. في حين أن AAS و ICP-MS أكثر حساسية ، إلا أن اختبار قياس الألوان لا يزال يستخدم على نطاق واسع لأنه يقدم المزايا الهامة التالية: أ) يستبعد مساهمة حديد الهيم المشتق من الهيموغلوبين الموجود في خلايا الدم الحمراء. ب) لا يتطلب مهارات تحليلية متطورة أو معدات باهظة الثمن ؛ و iii) يمكن تكييف الفحص الأصلي القائم على cuvette مع تنسيق microplate ، مما يسمح بإنتاجية أعلى للعينة. يستخدم نهج قياس الألوان المقدم في هذا العمل بشكل روتيني لقياس التغيرات في مستويات الحديد غير الهيم في الأنسجة في مجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية التجريبية للحمل الزائد للحديد الزائد أو نقص الحديد ، من القوارض إلى الأسماك وذبابة الفاكهة. هنا ، يتم توفير بروتوكول لقياس محتوى الحديد غير الهيم في الأنسجة الحيوانية ، باستخدام اختبار بسيط وراسخ ومقياس الألوان يجب أن تجده معظم المختبرات سهل التنفيذ.

Protocol

تم شراء الفئران C57BL/6 تجاريا وكانت الفئران الهيبسيدين الخالية (Hamp1^−/−) على خلفية C57BL/⁶⁸ هدية كريمة من صوفي فولونت (معهد كوتشين، فرنسا). تم إيواء الحيوانات في منشأة الحيوانات i3S في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض ، في بيئة يتم التحكم فيها بدرجة الحرارة والضوء ، مع حرية الوصول إلى تشاو القوارض القياسية والمياه. تم شراء قاروص البحر الأوروبي (Dicentrarchus labrax) من مزرعة سمكية تجارية وتم إيواؤه في منشأة ICBAS الحيوانية ، في بيئة يتم التحكم في درجة حرارتها وضوءها ، وتم تغذيتها يوميا بتغذية قاروص البحر القياسية. تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات الفقارية من قبل لجنة أخلاقيات الحيوانات i3S والسلطة الوطنية ، Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV). يتم سرد معلومات حول الكواشف التجارية والمعدات والحيوانات في جدول المواد.

1. إعداد الحل

ملاحظة: قم بالتعامل مع جميع الكواشف والمحاليل وإعدادها باستخدام الأواني الزجاجية الخالية من الحديد أو الأواني البلاستيكية التي تستخدم لمرة واحدة. لا تسمح للمواد المختبرية المعدنية (مثل ملاعق الفولاذ المقاوم للصدأ) بالتلامس مع أي كاشف أو محلول ، بسبب خطر تلوث الحديد. تأكد من أن أي أواني زجاجية قابلة لإعادة الاستخدام خالية من الحديد. اغسل المواد بالمنظفات المخبرية المناسبة لمدة 30-60 دقيقة ، وشطفها بالماء منزوع الأيونات ، وانقع طوال الليل في محلول حمض النيتريك بنسبة 37٪ المخفف 1: 3 بالماء منزوع الأيونات ، وشطف مرة أخرى بالماء منزوع الأيونات ، واتركه حتى يجف.

خليط الحمض: أضف 10 غرام من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك إلى 82.2 مل من حمض الهيدروكلوريك بنسبة 37٪ في زجاجة زجاجية ، وتذوب تماما ، وتضبط الحجم النهائي إلى 100 مل بالماء منزوع الأيونات. رجه قبل الاستخدام. بدلا من ذلك ، استخدم 37٪ فقط من حمض الهيدروكلوريك لهضم الأنسجة.
ملاحظة: الحل مستقر لمدة 2 أشهر على الأقل عند تخزينه في زجاجات كاشف زجاجية بنية داكنة.
تحذير: حمض الهيدروكلوريك وحمض ثلاثي كلورو أسيتيك مسببان للتآكل، وتطلق الأشكال المركزة أبخرة حمضية سامة. ارتد الملابس الواقية والقفازات المقاومة للمواد الكيميائية والنظارات الواقية من الرذاذ الكيميائي في جميع الأوقات عند التعامل مع الأحماض. تجنب استنشاقها وتعامل دائما مع الأحماض أثناء وجودك تحت غطاء الدخان.
خلات الصوديوم المشبعة: أضف 228 جم من خلات الصوديوم اللامائية إلى 400 مل من الماء منزوع الأيونات في زجاجة زجاجية وحرك طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. دع المحلول يرتاح ويعجل لمدة يوم. في حالة عدم حدوث هطول أمطار ، استمر في إضافة كميات صغيرة من خلات الصوديوم. تخزين الحل في زجاجة زجاجية.
كاشف كروموجين: لإعداد 1 مل من كاشف الكروموجين ، أضف 1 ملغ من 4,7-diphenyl-1,10-phenanthroline disulfonic acid disodium salt إلى 500 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات و 10 ميكرولتر من حمض الثيوغليكوليك المركز (100٪) ، ويذوب تماما. تشكل الحجم النهائي إلى 1 مل مع الماء منزوع الأيونات.
ملاحظة: قم بإعداد أكبر قدر ممكن من كاشف الكروموجين حسب الحاجة. الحل مستقر لمدة 1 شهر عند حمايته من الضوء.
كاشف كروموجين العامل (WCR): أضف 1 حجم من كاشف الكروموجين إلى 5 أحجام من خلات الصوديوم المشبعة و 5 أحجام من الماء منزوع الأيونات.
ملاحظة: يجب تحضير هذا المحلول طازجا في يوم الاستخدام.
الحل القياسي للحديد المخزون: لإعداد محلول حديد مخزون 20 ملليمتر ، ضع 111.5 ملغ من مسحوق حديد الكربونيل في قارورة حجمية سعة 250 مل تحتوي على 5480 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك بنسبة 37٪. اتركيه ليذوب طوال الليل في درجة حرارة الغرفة (أو احتضنيه في حمام مائي مغلي). ثم ، قم بتكوين المحلول إلى حجم نهائي يبلغ 100 مل بالماء منزوع الأيونات.
ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالحل القياسي إلى أجل غير مسمى عند تخزينه في وعاء مغلق بإحكام.
محلول الحديد القياسي العامل (WISS): أضف 13.5 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك بنسبة 37٪ إلى 500 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات. أضف 10 ميكرولتر من محلول ستوك الحديد القياسي وشكل الحجم النهائي إلى 1 مل بالماء منزوع الأيونات (11.169 ميكروغرام من Fe / mL ، 200 ميكرومتر ؛ مقاسة بواسطة AAS).
ملاحظة: يجب إعداد حل العمل طازجا في يوم الاستخدام.

2. تجفيف العينات

قطع عينة من الأنسجة التي تزن 10-100 ملغ باستخدام شفرة مشرط. قم بوزنه بدقة في ميزان تحليلي / دقيق على قطعة صغيرة من البارافيلم (الوزن الطازج).
باستخدام ملاقط بلاستيكية ، ضع قطعة الأنسجة في صفيحة من 24 بئرا (غير مغطاة للسماح بتبخر الماء) واتركها تجف على حاضنة قياسية عند 65 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
بدلا من ذلك ، استخدم فرن هضم الميكروويف المختبري لتجفيف عينات الأنسجة. باستخدام ملاقط بلاستيكية ، ضع قطعة الأنسجة الموزونة في كوب تفلون خال من الحديد وجففها في الميكروويف. اضبط معلمات التشغيل وفقا لدليل تعليمات الأداة.
ملاحظة: كمرجع، تظهر معلمات التشغيل لتجفيف عينات الكبد باستخدام فرن الهضم المحدد (انظر جدول المواد) في الجدول 1.
باستخدام ملاقط بلاستيكية ، ضع كل قطعة مجففة من الأنسجة فوق قطعة صغيرة من البارافيلم داخل ميزان تحليلي / دقيق وقم بوزنها بدقة (الوزن الجاف).

3. عينة الهضم الحمضي

باستخدام ملاقط بلاستيكية ، انقل كل قطعة مجففة من الأنسجة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل.
أضف 1 مل من خليط الحمض وأغلق أنبوب الطرد المركزي الدقيق. قم بإعداد حمض فارغ بنفس الطريقة ، باستثناء حذف الأنسجة.
تحذير: خليط الحمض قابل للتآكل ويطلق أبخرة سامة. ارتد ملابس واقية وقفازات مقاومة للمواد الكيميائية ونظارات رذاذ كيميائية عند التعامل مع خليط الحمض. تجنب استنشاقه وتعامل معه دائما أثناء وجوده تحت غطاء الدخان.
هضم الأنسجة عن طريق احتضان أنابيب الطرد المركزي الدقيقة في حاضنة عند 65 درجة مئوية لمدة 20 ساعة.
بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة ، انقل 500 ميكرولتر من مستخلص الحمض الصافي (الأصفر) (supernatant) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل باستخدام ماصة دقيقة مزودة بأطراف بلاستيكية. إذا لم يكن من الممكن الحصول على مادة فائقة واضحة ، فقم بإجراء دورة طرد مركزي قصيرة.
تحذير: السوبرناتانت شديد الحموضة. ارتد الملابس الواقية والقفازات المقاومة للمواد الكيميائية والنظارات الواقية من الرذاذ الكيميائي عند التعامل مع المواد الخارقة. تعامل معها دائما أثناء وجودك تحت غطاء الدخان.
ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن استخدام مستخلصات الحمض على الفور لفحص قياس الألوان أو تجميدها عند -20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا. قم بإذابة العينات المجمدة تماما إلى درجة حرارة الغرفة ودوامتها قبل الاستخدام.

4. تطوير اللون

قم بإعداد تفاعلات الكروموجين كما هو موضح في الجدول 2 في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل أو ، للحصول على إنتاجية أعلى ، مباشرة في القاع المسطح ، 96 بئرا ، واضحة ، غير معالجة صفائح البوليسترين الدقيقة. قم بإعداد جميع التفاعلات (الحمض الفارغ والقياسي والعينة) على الأقل في نسختين.
تحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

5. قراءة الامتصاص

قياس امتصاص العينة في مقياس الطيف الضوئي أو قارئ الصفائح عند طول موجي يبلغ 535 نانومتر مقابل مرجع مائي منزوع الأيونات. يمكن قراءة اللوحات بدون غطاء أو غطاء. في العلبة المغطاة ، قم بإزالة أي تكثيف يتشكل بسبب إطلاق أبخرة الحمض من الغطاء قبل القياس مباشرة لتجنب التداخل المحتمل مع قراءة الامتصاص.
ملاحظة: يجب أن يكون الامتصاص البصري للحمض الفارغ المقروء مقابل الماء منزوع الأيونات (المرجع) أقل من 0.015 ؛ يجب أن يكون الامتصاص البصري للمعيار والعينات بين 0.100 و 1.000. بالنسبة للعينات ذات المحتوى العالي جدا أو المنخفض جدا من الحديد ، قد تحتاج أحجام مستخلص الحمض (supernatant) و _diH2O إلى التعديل (الجدول 2): إذا كان الامتصاص أكبر من 1.0 ، فاستخدم حجم عينة أصغر (supernatant) ؛ عندما يكون الامتصاص أقل من 0.1 ، استخدم حجما أكبر من supernatant. يؤخذ حجم العينة (_Vsmp) في الاعتبار عند حساب محتوى الحديد في الأنسجة لكل عينة (انظر الخطوة 6).

6. حساب محتوى الحديد الأنسجة

احسب محتوى الحديد من الأنسجة غير الهيمية بالمعادلة التالية:
حديد الأنسجة (ميكروغرام / غرام من الأنسجة الجافة) =
_AT = امتصاص عينة الاختبار
_AB = امتصاص حمض فارغ
_AS = امتصاص قياسي
_{فاس =} تركيز الحديد من WISS (ميكروغرام Fe/mL)
W = وزن الأنسجة الجافة (جم)
_Vsmp = حجم العينة (حجم متغير من Supernatant في الجدول 2 المحول إلى مل)
_Vf = الحجم النهائي لخليط الحمض بعد الحضانة بين عشية وضحاها عند 65 درجة مئوية (المقابلة لحجم الحمض بالإضافة إلى حجم الأنسجة الجافة في مل ؛ إذا كانت أوزان العينة لا تختلف اختلافا كبيرا ، افترض أن الحجم الثابت ≈ 1 مل)
_Vstd = الحجم القياسي للحديد (حجم WISS في الجدول 2 المحول إلى مل)
_Vrv = حجم التفاعل النهائي (الحجم الإجمالي في الجدول 2 المحول إلى مل)

النتائج

مقارنة بين كوفيت و 96 بئرا
يعتمد قياس الحديد غير الهيمي عن طريق التفاعل مع كاشف باثوفينانثرولين الموصوف أصلا من قبل تورانس وبوثويل5^،⁶ على استخدام مقياس الطيف الضوئي لقراءة الامتصاص. وبالتالي ، فإن الأحجام المستخدمة في تفاعل الكروموجين متوافقة مع ...

Discussion

يتم توفير بروتوكول لقياس محتوى الحديد غير الهيم في الأنسجة الحيوانية ، وذلك باستخدام تكييف لفحص الألوان القائم على bathophenanthroline الذي وصفه تورانس و ^Bothwell5,6 في الأصل. الخطوات الحاسمة لهذه الطريقة هي تجفيف عينات الأنسجة. تمسخ البروتين وإطلاق الحديد غير العضوي عن...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من قبل الصناديق الوطنية من خلال FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P.، في إطار المشروع UIDB/04293/2020.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well UV transparent plate	Sarstedt	82.1581.001
Analytical balance	Kern	ABJ 220-4M
Anhydrous sodium acetate	Merck	106268
Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid)	Sigma-Aldrich	B1375
C57BL/6 mice (Mus musculus)	Charles River Laboratories
Carbonyl iron powder, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	44890
Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA)	VWR	634-0678P
Double distilled, sterile water	B. Braun	0082479E
Fluorescence microplate reader	BioTek Instruments	FLx800
Hydrochloric acid, 37%	Sigma-Aldrich	258148
Microwave digestion oven and white teflon cups	CEM	MDS-2000
Nitric acid	Fisher Scientific	15687290
Oven	Binder	ED115
Rodent chow	Harlan Laboratories	2014S	Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron
Sea bass (Dicentrarchus labrax)	Sonrionansa
Sea bass feed	Skretting	L-2 Alterna 1P
Single beam UV-Vis spectrophotometer	Shimadzu	UV mini 1240
Thioglycolic acid	Merck	100700
Trichloroacetic acid	Merck	100807

References

Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. A red carpet for iron metabolism. Cell. 168, 344-361 (2017).
Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. Hepcidin and anemia: A tight relationship. Frontiers in Physiology. 10, 1294 (2019).
Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T. Anemia of inflammation. Blood. 133 (1), 40-50 (2019).
Altamura, S., et al. Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models. Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872 (2020).
Torrance, J. D., Bothwell, T. H. A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples. South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).
Torrence, J. D., Bothwell, T. H., Cook, J. D. Tissue iron stores. Methods in Haematology. , 104-109 (1980).
Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. Microanalysis of non-heme iron in animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).
Lesbordes-Brion, J. C., et al. Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis. Blood. 108, 1402-1405 (2006).
Jumbo-Lucioni, P., et al. Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 11, 297 (2010).
Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F. Iron Absorption in Drosophila melanogaster. Nutrients. 5, 1622-1647 (2013).
Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. High-throughput non-heme iron assay for animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).
Adrian, W. J., Stevens, M. L. Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver. Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

179

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: