Batofenantropin Bazlı Kolorimetrik Tahlil Kullanılarak Doku Non-Heme Demir İçeriğinin Ölçülmesi

Özet

Burada, hayvan dokularındaki heme olmayan demir içeriğinin ölçümü için, çoğu laboratuvarda kolayca uygulanabilen basit, köklü bir kolorimetrik test kullanılarak bir protokol sağlanmaktadır.

Özet

Demir önemli bir mikro besindir. Hem aşırı demir yükü hem de eksikliği insanlar için oldukça zararlıdır ve doku demir seviyeleri ince bir şekilde düzenlenir. Demir yükü veya eksikliğinin deneysel hayvan modellerinin kullanılması, demir homeostazının sistemik ve hücresel düzenlenmesinde rol oynayan mekanizmaların bilgisini ilerletmek için etkili olmuştur. Hayvan dokularındaki toplam demir seviyelerinin ölçümü genellikle atomik absorpsiyon spektroskopisi veya heme olmayan demirin bir batofenantrolin reaktifi ile reaksiyonuna dayanan kolorimetrik bir tahlil ile gerçekleştirilir. Uzun yıllar boyunca, kolorimetrik tahlil, çok çeşitli hayvan dokularında heme olmayan demir içeriğinin ölçümü için kullanılmıştır. Atomik absorpsiyon spektroskopisinden farklı olarak, kırmızı kan hücrelerinde bulunan hemoglobinden türetilen heme demirinin katkısını dışlar. Dahası, sofistike analitik beceriler veya çok pahalı ekipmanlar gerektirmez ve bu nedenle çoğu laboratuvarda kolayca uygulanabilir. Son olarak, kolorimetrik tahlil küvet bazlı olabilir veya daha yüksek numune verimi sağlayan bir mikroplaka formatına uyarlanabilir. Bu çalışma, aşırı demir yükü veya demir eksikliğinin çeşitli deneysel hayvan modellerinde doku demir seviyelerindeki değişikliklerin tespiti için uygun olan iyi kurulmuş bir protokol sunmaktadır.

Giriş

Demir, oksijen taşınması, enerji üretimi veya DNA sentezi gibi önemli biyolojik işlemlerde yer alan proteinlerin işlevi için gerekli olan temel bir mikro besindir. Önemli olarak, hem demir fazlalığı hem de demir eksikliği insan sağlığına oldukça zararlıdır ve doku demir seviyeleri ince bir şekilde düzenlenir. Anormal diyet demir emilimi, demir eksikliği olan diyetler, tekrarlanan kan transfüzyonları ve kronik inflamasyon, dünya çapında milyarlarca insanı etkileyen demir ile ilişkili bozuklukların yaygın nedenleridir1,2,3.

Aşırı demir yükü veya eksikliğinin deneysel hayvan modelleri, demir homeostazının sistemik ve hücresel regülasyonunda yer alan mekanizmalar hakkındaki bilgimizi ilerletmek için etkili ^olmuştur4. Son yirmi yılda kaydedilen önemli ilerlemelere rağmen, birçok kilit husus belirsizliğini korumaktadır. Önümüzdeki yıllarda, hayvan dokularındaki toplam demir seviyelerinin doğru ölçümü, demir biyolojisi alanındaki araştırmaları ilerletmek için kritik bir adım olmaya devam edecektir.

Çoğu laboratuvar, doku demirini atomik absorpsiyon spektroskopisi (AAS), endüktif olarak eşleşmiş plazma kütle spektrometresi (ICP-MS) veya heme olmayan demirin bir batofenantrolin reaktifi ile reaksiyonuna dayanan kolorimetrik bir tahlil ile ölçer. Sonuncusu, Torrance ve Bothwell tarafından 50 yıl önce tanımlanan orijinal yönteme ^{dayanmaktadır5,6}. Bu yöntemin bir varyasyonu daha sonra batofenantropin7'ye alternatif olarak ferrozin kullanılarak geliştirilmiş olsa da, ikincisi literatürde en çok atıfta bulunulan kromojenik reaktif olmaya devam etmektedir.

Tercih edilen yöntem genellikle mevcut uzmanlığa ve altyapıya bağlıdır. AAS ve ICP-MS daha hassas olsa da, kolorimetrik tahlil aşağıdaki önemli avantajları sunduğu için yaygın olarak kullanılmaya devam etmektedir: i) kırmızı kan hücrelerinde bulunan hemoglobinden elde edilen heme demirinin katkısını dışlar; ii) sofistike analitik beceriler veya çok pahalı ekipmanlar gerektirmez; ve iii) orijinal küvet bazlı tahlil, daha yüksek numune verimi sağlayan bir mikroplaka formatına uyarlanabilir. Bu çalışmada sunulan kolorimetrik yaklaşım, kemirgenlerden balıklara ve meyve sineklerine kadar çeşitli deneysel hayvan modellerinde aşırı demir yükü veya demir eksikliği olan doku non-heme demir seviyelerindeki değişiklikleri ölçmek için rutin olarak kullanılmaktadır. Burada, hayvan dokularındaki heme olmayan demir içeriğinin ölçümü için, çoğu laboratuvarın uygulamayı kolay bulması gereken basit, iyi kurulmuş, kolorimetrik bir tahlil kullanılarak bir protokol sağlanmaktadır.

Protokol

C57BL/6 fareler ticari olarak satın alındı ve C57BL/6 arka planındaki hepcidin-null (Hamp1^{−/-) fareler8} Sophie Vaulont'un (Institut Cochin, Fransa) nazik bir hediyesiydi. Hayvanlar, i3S hayvan tesisinde belirli patojensiz koşullar altında, sıcaklık ve ışık kontrollü bir ortamda, standart kemirgen chow ve suya serbest erişime sahip olarak barındırıldı. Avrupa levreği (Dicentrarchus labrax) ticari bir balık çiftliğinden satın alındı ve ICBAS hayvan tesisinde, sıcaklık ve ışık kontrollü bir ortamda barındırıldı ve günlük ad libitum'u standart levrek yemi ile besledi. Omurgalı hayvanları içeren tüm prosedürler i3S Hayvan Etik Komitesi ve ulusal otorite Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV) tarafından onaylanmıştır. Ticari reaktifler, ekipmanlar ve hayvanlar hakkındaki bilgiler Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Çözelti hazırlama

NOT: Tüm reaktifleri ve çözeltileri demir içermeyen cam eşyalarla veya tek kullanımlık plastik eşyalarla işleyin ve hazırlayın. Demir kontaminasyonu riski nedeniyle metalik laboratuvar malzemelerinin (örneğin paslanmaz çelik spatulalar) herhangi bir reaktif veya çözelti ile temas etmesine izin vermeyin. Yeniden kullanılabilir cam eşyaların demir içermediğinden emin olun. Malzemeleri 30-60 dakika boyunca uygun laboratuvar deterjanı ile yıkayın, deiyonize suyla durulayın, deiyonize su ile 1:3 seyreltilmiş% 37'lik bir nitrik asit çözeltisinde gece boyunca bekletin, tekrar deiyonize suyla durulayın ve kurumaya bırakın.

1. Asit karışımı: Bir cam şişede 82.2 mL% 37 hidroklorik aside 10 g trikloroasetik asit ekleyin, iyice çözün ve son hacmi deiyonize su ile 100 mL'ye ayarlayın. Kullanmadan önce çalkalayın. Alternatif olarak, doku sindirimi için sadece% 37 hidroklorik asit kullanın.
   NOT: Çözelti, koyu kahverengi cam reaktif şişelerinde saklandığında en az 2 ay boyunca stabildir.
   DİKKAT: Hidroklorik asit ve trikloroasetik asit aşındırıcıdır ve konsantre formlar toksik asidik buharları serbest bırakır. Asitleri kullanırken her zaman koruyucu giysiler, kimyasallara dayanıklı eldivenler ve kimyasal sıçrama gözlükleri kullanın. Onları solumaktan kaçının ve her zaman bir duman başlığının altındayken asitleri kullanın.
2. Doymuş sodyum asetat: Bir cam şişede 400 mL deiyonize suya 228 g susuz sodyum asetat ekleyin ve oda sıcaklığında gece boyunca çalkalayın. Çözeltinin dinlenmesine ve bir gün boyunca çökelmesine izin verin. Yağış olmazsa, az miktarda sodyum asetat eklemeye devam edin. Çözeltiyi bir cam şişede saklayın.
3. Kromojen Reaktif: 1 mL kromojen reaktif hazırlamak için, 500 μL deiyonize suya ve 10 μL konsantre (% 100) tiyoglikolik aside 1 mg 4,7-difenil-1,10-fenantropin disülfonik asit disodyum tuzu ekleyin ve iyice çözün. Son hacmi deiyonize su ile 1 mL'ye kadar yapın.
   NOT: Gerektiği kadar kromojen reaktif hazırlayın. Çözelti, ışıktan korunduğunda 1 ay boyunca kararlıdır.
4. Çalışma Kromojen Reaktifi (WCR): 5 hacim doymuş sodyum asetat ve 5 hacim deiyonize suya 1 hacim Kromojen Reaktifi ekleyin.
   NOT: Bu çözelti kullanım gününde taze olarak hazırlanmalıdır.
5. Stok Demir Standart Çözeltisi: 20 mM'lik bir stok demir çözeltisi hazırlamak için, 5.480 μL% 37 hidroklorik asit içeren 250 mL hacimsel şişeye 111.5 mg karbonil demir tozu yerleştirin. Oda sıcaklığında gece boyunca çözünmeye bırakın (veya kaynar su banyosunda inkübe edin). Daha sonra, çözeltiyi deiyonize su ile 100 mL'lik son bir hacme kadar hazırlayın.
   NOT: Standart çözelti, sıkıca kapatılmış bir kapta saklandığında süresiz olarak saklanabilir.
6. Çalışma Demiri Standart Çözeltisi (WISS): 500 μL deiyonize suya 13,5 μL% 37 hidroklorik asit ekleyin. Stok Demir Standart Çözeltisinden 10 μL ekleyin ve deiyonize su ile 1 mL'ye kadar son hacmi oluşturun (11.169 μg Fe / mL, 200 μM; AAS ile ölçülür).
   NOT: Çalışma çözeltisi kullanım gününde taze olarak hazırlanmalıdır.

2. Numune kurutma

1. Bir neşter bıçağı ile 10-100 mg ağırlığındaki bir doku örneğini kesin. Analitik/hassas terazide küçük bir parafilm parçası (Taze Ağırlık) üzerinde doğru şekilde tartın.
2. Plastik cımbız kullanarak, doku parçasını 24 delikli bir plakaya (suyun buharlaşmasına izin vermek için kapaksız) yerleştirin ve 48 saat boyunca 65 ° C'de standart bir inkübatörde kurumasını bekleyin.
3. Alternatif olarak, doku örneklerini kurutmak için bir laboratuvar mikrodalga sindirim fırını kullanın. Plastik cımbız kullanarak, tartılan doku parçasını demir içermeyen bir Teflon bardağa yerleştirin ve mikrodalgada kurutun. Çalışma parametrelerini cihazın kullanım kılavuzuna göre ayarlayın.
   NOT: Referans olarak, spesifik çürütme fırını kullanılarak karaciğer numunelerinin kurutulması için çalışma parametreleri (bkz. Malzeme Tablosu) Tablo 1'de gösterilmiştir.
4. Plastik cımbız kullanarak, her kurumuş doku parçasını analitik/hassas bir terazinin içindeki küçük bir parafilm parçasının üzerine yerleştirin ve doğru şekilde tartın (Kuru Ağırlık).

3. Asidik sindirimi örnekleyin

1. Plastik cımbız kullanarak, her kurutulmuş doku parçasını 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
2. 1 mL asit karışımı ekleyin ve mikrosantrifüj tüpünü kapatın. Dokunun ihmal edilmesi dışında, aynı şekilde bir asit boşluğu hazırlayın.
   DİKKAT: Asit karışımı aşındırıcıdır ve toksik buharlar salgılar. Asit karışımını kullanırken koruyucu giysiler, kimyasallara dayanıklı eldivenler ve kimyasal sıçrama gözlükleri takın. Nefes almaktan kaçının ve her zaman bir duman başlığının altındayken kullanın.
3. Mikrosantrifüj tüplerini bir inkübatörde 20 saat boyunca 65 ° C'de inkübe ederek dokuları sindirin.
4. Oda sıcaklığına soğuduktan sonra, şeffaf (sarı) asit ekstraktının (süpernatant) 500 μL'sini, plastik uçlarla donatılmış bir mikropipet kullanarak yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Net bir süpernatan elde etmek mümkün değilse, kısa bir santrifüjleme spini gerçekleştirin.
   DİKKAT: Süpernatant oldukça asidiktir. Süper nantantları kullanırken koruyucu giysiler, kimyasallara dayanıklı eldivenler ve kimyasal sıçrama gözlükleri giyin. Her zaman bir duman başlığının altındayken onları kullanın.
   NOT: Bu noktada, asit ekstraktları kolorimetrik tahlil için hemen kullanılabilir veya daha sonra kullanmak üzere -20 ° C'de dondurulabilir. Dondurulmuş numuneleri oda sıcaklığına tamamen çözün ve kullanmadan önce vorteksleyin.

4. Renk gelişimi

1. Tablo 2'de belirtildiği gibi 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinde veya daha yüksek verim için doğrudan düz tabanlı, 96 delikli, berrak, işlenmemiş polistiren mikroplakalara kromojen reaksiyonları hazırlayın. Tüm reaksiyonları (asit boşluğu, standart ve numune) en azından kopya halinde hazırlayın.
2. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.

5. Absorbans okuma

1. Bir spektrofotometrede veya plaka okuyucuda 535 nm dalga boyundaki numune emiciliğini deiyonize su referansına karşı ölçün. Plakalar kapaksız veya kapaklı olarak okunabilir. Kapaklı kasada, absorbans okumasına olası paraziti önlemek için ölçüm öncesinde kapaktan asit buharlarının salınması nedeniyle oluşan yoğuşmaları giderin.
   NOT: Deiyonize suya karşı okunan asit boşluğunun optik emilimi (referans) 0,015'ten az olmalıdır; standardın ve numunelerin optik absorbansı 0.100 ile 1.000 arasında olmalıdır. Çok yüksek veya çok düşük demir içeriğine sahip numuneler için, asit ekstraktı (süpernatant) ve _diH2O hacimlerinin ayarlanması gerekebilir (Tablo 2): absorbans 1.0'dan büyükse, daha küçük bir numune (süpernatant) hacmi kullanın; absorbans 0.1'den düşük olduğunda, süpernatanın daha yüksek bir hacmini kullanın. Her numunenin doku demir içeriği hesaplanırken numune hacmi (_Vsmp) dikkate alınır (bkz. adım 6).

6. Doku demir içeriğinin hesaplanması

1. Aşağıdaki denklemle heme olmayan doku demir içeriğini hesaplayın:
   Doku demiri (μg/g kuru doku) =
   _AT = test numunesinin emilmesi
   _AB = asit boşluğunun emilmesi
   _AS = standardın absorbansı
   _Fes = WISS'nin demir konsantrasyonu (μg Fe/mL)
   W = kuru mendilin ağırlığı (g)
   _Vsmp = numune hacmi (Tablo 2'deki değişken Supernatant hacmi mL'ye dönüştürülür)
   _Vf = 65 ° C'de gece inkübasyonundan sonra asit karışımının son hacmi (mL cinsinden asit hacmine artı kuru doku hacmine karşılık gelir; numune ağırlıkları önemli ölçüde farklılık göstermiyorsa, sabit bir hacim ≈ 1 mL varsayalım)
   _Vstd = demir standart hacmi (Tablo 2'deki WISS hacmi mL'ye dönüştürülmüştür)
   _Vrv = nihai reaksiyon hacmi (Tablo 2'deki toplam hacim mL'ye dönüştürülür)

Sonuçlar

Cuvette ile 96 kuyucuklu mikro plaka karşılaştırması
Doku heme olmayan demirin, orijinal olarak Torrance ve Bothwell tarafından tanımlanan bir batofenantropin reaktifi ile reaksiyona girerek ^{ölçülmesi5,6,} absorbans okuması için bir spektrofotometrenin kullanılmasına dayanır. Bu nedenle, kromojen reaksiyonunda kullanılan hacimler, normal bir spektrofotometre küvetinin boyutuyla uyumludur. Bu çalışma, kromojen reaksiyonların...

Tartışmalar

Hayvan dokularındaki heme olmayan demir içeriğinin ölçümü için, başlangıçta Torrance ve Bothwell tarafından tanımlanan batofenantrolin bazlı kolorimetrik tahlilin adaptasyonu kullanılarak bir protokol ^{sağlanmıştır5,6}. Yöntemin kritik adımları doku numunesi kurutma; protein denatürasyonu ve asit hidrolizi ile inorganik demir salınması; indirgeyici ajan tiyoglikolik asit varlığında ferrik (^Fe3+) demirin demir durumuna (^Fe...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well UV transparent plate	Sarstedt	82.1581.001
Analytical balance	Kern	ABJ 220-4M
Anhydrous sodium acetate	Merck	106268
Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid)	Sigma-Aldrich	B1375
C57BL/6 mice (Mus musculus)	Charles River Laboratories
Carbonyl iron powder, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	44890
Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA)	VWR	634-0678P
Double distilled, sterile water	B. Braun	0082479E
Fluorescence microplate reader	BioTek Instruments	FLx800
Hydrochloric acid, 37%	Sigma-Aldrich	258148
Microwave digestion oven and white teflon cups	CEM	MDS-2000
Nitric acid	Fisher Scientific	15687290
Oven	Binder	ED115
Rodent chow	Harlan Laboratories	2014S	Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron
Sea bass (Dicentrarchus labrax)	Sonrionansa
Sea bass feed	Skretting	L-2 Alterna 1P
Single beam UV-Vis spectrophotometer	Shimadzu	UV mini 1240
Thioglycolic acid	Merck	100700
Trichloroacetic acid	Merck	100807