Messung des Gewebe-Nicht-Häm-Eisengehalts mit einem Bathophenanthrolin-basierten kolorimetrischen Assay

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Messung des Nicht-Häm-Eisengehalts in tierischen Geweben bereitgestellt, wobei ein einfacher, gut etablierter kolorimetrischer Assay verwendet wird, der in den meisten Labors leicht implementiert werden kann.

Zusammenfassung

Eisen ist ein essentieller Mikronährstoff. Sowohl Eisenüberladung als auch -mangel sind für den Menschen sehr schädlich, und der Eisenspiegel im Gewebe ist fein reguliert. Die Verwendung experimenteller Tiermodelle für Eisenüberladung oder -mangel war hilfreich, um das Wissen über die Mechanismen zu erweitern, die an der systemischen und zellulären Regulation der Eisenhomöostase beteiligt sind. Die Messung des Gesamteisengehalts in tierischen Geweben wird üblicherweise mit Atomabsorptionsspektroskopie oder mit einem kolorimetrischen Assay durchgeführt, der auf der Reaktion von Nicht-Häm-Eisen mit einem Bathophenanthrolin-Reagenz basiert. Seit vielen Jahren wird der kolorimetrische Assay zur Messung des Nicht-Häm-Eisengehalts in einer Vielzahl von tierischen Geweben eingesetzt. Im Gegensatz zur Atomabsorptionsspektroskopie schließt es den Beitrag von Häm-Eisen aus, das aus Hämoglobin gewonnen wird, das in roten Blutkörperchen enthalten ist. Darüber hinaus erfordert es keine ausgefeilten analytischen Fähigkeiten oder sehr teure Ausrüstung und kann daher in den meisten Labors leicht implementiert werden. Schließlich kann der kolorimetrische Assay entweder küvettenbasiert oder an ein Mikroplattenformat angepasst sein, was einen höheren Probendurchsatz ermöglicht. Die vorliegende Arbeit liefert ein gut etabliertes Protokoll, das für den Nachweis von Veränderungen des Eisengehalts im Gewebe in einer Vielzahl von experimentellen Tiermodellen von Eisenüberladung oder Eisenmangel geeignet ist.

Einleitung

Eisen ist ein essentieller Mikronährstoff, der für die Funktion von Proteinen benötigt wird, die an entscheidenden biologischen Prozessen wie Sauerstofftransport, Energieproduktion oder DNA-Synthese beteiligt sind. Wichtig ist, dass sowohl Eisenüberschuss als auch Eisenmangel für die menschliche Gesundheit sehr schädlich sind und der Eisenspiegel im Gewebe fein reguliert ist. Abnorme Eisenaufnahme in der Nahrung, Eisenmangel, wiederholte Bluttransfusionen und chronische Entzündungen sind häufige Ursachen für Eisen-assoziierte Erkrankungen, von denen Milliarden von Menschen weltweit betroffen ^sind1,2,3.

Experimentelle Tiermodelle der Eisenüberladung oder -mangel waren maßgeblich daran beteiligt, unser Wissen über die Mechanismen der systemischen und zellulären Regulation der Eisenhomöostase zu ^erweitern4. Trotz der erheblichen Fortschritte, die in den letzten zwei Jahrzehnten erzielt wurden, sind viele wichtige Aspekte nach wie vor schwer fassbar. In den kommenden Jahren wird die genaue Messung des Gesamteisgehalts in tierischen Geweben ein entscheidender Schritt bleiben, um die Forschung auf dem Gebiet der Eisenbiologie voranzutreiben.

Die meisten Labore quantifizieren Gewebeeisen entweder mit Atomabsorptionsspektroskopie (AAS), Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) oder einem kolorimetrischen Assay, der auf der Reaktion von Nicht-Häm-Eisen mit einem Bathophenanthrolin-Reagenz basiert. Letzteres basiert auf der ursprünglichen Methode, die Torrance und Bothwell vor über 50 Jahren beschrieben ^haben5,6. Während später eine Variation dieser Methode entwickelt wurde, bei der Ferrozin als Alternative zu Bathophenanthrolin7 verwendet wurde, bleibt letzteres das am häufigsten zitierte chromogene Reagenz in der Literatur^.

Die Methode der Wahl hängt oft vom verfügbaren Fachwissen und der Infrastruktur ab. Während AAS und ICP-MS empfindlicher sind, bleibt der kolorimetrische Assay weit verbreitet, da er die folgenden wichtigen Vorteile bietet: i) es schließt den Beitrag von Häm-Eisen aus, das aus Hämoglobin gewonnen wird, das in roten Blutkörperchen enthalten ist; ii) es erfordert keine ausgefeilten analytischen Fähigkeiten oder sehr teure Ausrüstung; und iii) der ursprüngliche Küvetten-basierte Assay kann an ein Mikroplattenformat angepasst werden, was einen höheren Probendurchsatz ermöglicht. Der kolorimetrische Ansatz, der in dieser Arbeit vorgestellt wird, wird routinemäßig verwendet, um Veränderungen des Gewebe-Nicht-Häm-Eisenspiegels in einer Vielzahl von experimentellen Tiermodellen von Eisenüberladung oder Eisenmangel, von Nagetieren bis hin zu Fischen und Fruchtfliegen, zu quantifizieren. Hier wird ein Protokoll für die Messung des Nicht-Häm-Eisengehalts in tierischem Gewebe bereitgestellt, wobei ein einfacher, gut etablierter, kolorimetrischer Assay verwendet wird, den die meisten Laboratorien leicht implementieren sollten.

Protokoll

C57BL/6 Mäuse wurden kommerziell gekauft und Hepcidin-Null (Hamp1−/−) Mäuse auf einem C57BL^/6 ^Hintergrund8 waren ein freundliches Geschenk von Sophie Vaulont (Institut Cochin, Frankreich). Die Tiere wurden in der i3S-Tieranlage unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen in einer temperatur- und lichtkontrollierten Umgebung untergebracht, mit freiem Zugang zu Standard-Nagetierfutter und Wasser. Der Europäische Wolfsbarsch (Dicentrarchus labrax) wurde von einer kommerziellen Fischfarm gekauft und in der ICBAS-Tieranlage in einer temperatur- und lichtkontrollierten Umgebung untergebracht und täglich ad libitum mit Standard-Wolfsbarschfutter gefüttert. Alle Verfahren mit Wirbeltieren wurden von der i3S-Tierethikkommission und der nationalen Behörde Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV) genehmigt. Informationen über kommerzielle Reagenzien, Geräte und Tiere sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Lösungsvorbereitung

HINWEIS: Behandeln und bereiten Sie alle Reagenzien und Lösungen mit eisenfreien Glaswaren oder Einwegplastikwaren vor. Lassen Sie metallische Labormaterialien (z. B. Edelstahlspatel) aufgrund des Risikos einer Eisenkontamination nicht mit Reagenzien oder Lösungen in Berührung kommen. Stellen Sie sicher, dass alle wiederverwendbaren Glaswaren eisenfrei sind. Waschen Sie die Materialien mit geeignetem Laborwaschmittel für 30-60 min, spülen Sie sie mit entionisiertem Wasser ab, tränken Sie sie über Nacht in einer 37% igen Salpetersäurelösung, die 1:3 mit deionisiertem Wasser verdünnt ist, spülen Sie sie erneut mit deionisiertem Wasser ab und lassen Sie sie trocknen.

1. Säuremischung: Fügen Sie 10 g Trichloressigsäure zu 82,2 ml 37% Salzsäure in einer Glasflasche hinzu, lösen Sie es gründlich auf und stellen Sie das endgültige Volumen mit entionisiertem Wasser auf 100 ml ein. Vor Gebrauch schütteln. Alternativ können Sie nur 37% Salzsäure für die Gewebeverdauung verwenden.
   HINWEIS: Die Lösung ist mindestens 2 Monate haltbar, wenn sie in dunkelbraunen Glasreagenzflaschen gelagert wird.
   ACHTUNG: Salzsäure und Trichloressigsäure sind ätzend und konzentrierte Formen setzen giftige saure Dämpfe frei. Tragen Sie beim Umgang mit Säuren jederzeit Schutzkleidung, chemikalienbeständige Handschuhe und Chemikalienspritzschutzbrillen. Vermeiden Sie es, sie einzuatmen und immer mit Säuren umzugehen, während Sie sich unter einem Abzug befinden.
2. Gesättigtes Natriumacetat: 228 g wasserfreies Natriumacetat in eine Glasflasche zu 400 ml entionisiertem Wasser geben und über Nacht bei Raumtemperatur rühren. Lassen Sie die Lösung ruhen und einen Tag lang ausfällen. Wenn kein Niederschlag auftritt, fügen Sie weiterhin kleine Mengen Natriumacetat hinzu. Lagern Sie die Lösung in einer Glasflasche.
3. Chromogen-Reagenz: Zur Herstellung von 1 ml chromogenem Reagenz 1 mg 4,7-Diphenyl-1,10-phenanthrilines Disulfonsäure-Dinatriumsalz zu 500 μL deionisiertem Wasser und 10 μL konzentrierter (100%) Thioglykolsäure und gründlich auflösen. Machen Sie das endgültige Volumen auf 1 ml mit deionisiertem Wasser aus.
   HINWEIS: Bereiten Sie so viel Chromogenreagenz wie nötig vor. Die Lösung ist 1 Monat lang stabil, wenn sie vor Licht geschützt ist.
4. Working Chromogen Reagent (WCR): Fügen Sie 1 Volumen des Chromogenreagenzes zu 5 Volumen gesättigtem Natriumacetat und 5 Volumen deionisiertem Wasser hinzu.
   HINWEIS: Diese Lösung sollte am Tag der Anwendung frisch zubereitet werden.
5. Stamm-Eisen-Standardlösung: Um eine 20 mM Stammeisenlösung herzustellen, geben Sie 111,5 mg Carbonyleisenpulver in einen 250-ml-Messkolben, der 5.480 μL 37% Salzsäure enthält. Über Nacht bei Raumtemperatur auflösen lassen (oder in einem kochenden Wasserbad inkubieren). Dann machen Sie die Lösung zu einem endgültigen Volumen von 100 ml mit deionisiertem Wasser.
   HINWEIS: Die Standardlösung kann auf unbestimmte Zeit aufbewahrt werden, wenn sie in einem dicht verschlossenen Behälter gelagert wird.
6. Working Iron Standard Solution (WISS): 13,5 μL 37% Salzsäure zu 500 μL deionisiertem Wasser hinzufügen. 10 μL der Stammeisen-Standardlösung zugeben und das Endvolumen mit deionisiertem Wasser auf 1 ml auffüllen (11,169 μg Fe/ml, 200 μM; gemessen durch AAS).
   HINWEIS: Die Arbeitslösung sollte am Tag der Anwendung frisch zubereitet werden.

2. Probentrocknung

1. Schneiden Sie eine Gewebeprobe mit einem Gewicht von 10-100 mg mit einer Skalpellklinge. Wiegen Sie es genau in einer analytischen / Präzisionswaage über einem kleinen Stück Parafilm (Fresh Weight).
2. Legen Sie das Gewebestück mit einer Kunststoffpinzette in eine 24-Well-Platte (unbedeckt, um eine Wasserverdunstung zu ermöglichen) und lassen Sie es auf einem Standard-Inkubator bei 65 ° C für 48 h trocknen.
3. Alternativ können Sie einen Mikrowellen-Aufschlussofen im Labor zum Trocknen von Gewebeproben verwenden. Legen Sie das gewogene Stück Gewebe mit einer Plastikpinzette in einen eisenfreien Teflonbecher und trocknen Sie es in der Mikrowelle. Stellen Sie die Betriebsparameter gemäß der Bedienungsanleitung des Geräts ein.
   HINWEIS: Als Referenz sind die Betriebsparameter für die Trocknung von Leberproben mit dem spezifischen Faulofen (siehe Materialtabelle) in Tabelle 1 aufgeführt.
4. Legen Sie mit einer Kunststoffpinzette jedes getrocknete Stück Gewebe über ein kleines Stück Parafilm in einer Analyse- / Präzisionswaage und wiegen Sie es genau (Trockengewicht).

3. Probe saurer Aufschluss

1. Übertragen Sie jedes getrocknete Gewebestück mit einer Kunststoffpinzette in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
2. Fügen Sie 1 ml der Säuremischung hinzu und schließen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen. Bereiten Sie einen sauren Rohling auf die gleiche Weise vor, außer dass das Gewebe weggelassen wird.
   VORSICHT: Das Säuregemisch ist ätzend und setzt giftige Dämpfe frei. Tragen Sie beim Umgang mit der Säuremischung Schutzkleidung, chemikalienbeständige Handschuhe und eine chemische Spritzschutzbrille. Vermeiden Sie es, es einzuatmen und behandeln Sie es immer unter einem Abzug.
3. Verdauen Sie das Gewebe, indem Sie die Mikrozentrifugenröhrchen in einem Inkubator bei 65 °C für 20 h inkubieren.
4. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur 500 μL des klaren (gelben) Säureextrakts (Überstand) mit einer mit Kunststoffspitzen versehenen Mikropipette in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Wenn es nicht möglich ist, einen klaren Überstand zu erhalten, führen Sie einen kurzen Zentrifugationsspin durch.
   ACHTUNG: Der Überstand ist stark sauer. Tragen Sie beim Umgang mit den Überständen Schutzkleidung, chemikalienbeständige Handschuhe und Chemikalienspritzschutzbrillen. Behandeln Sie sie immer unter einem Abzug.
   HINWEIS: An dieser Stelle können die Säureextrakte sofort für den kolorimetrischen Assay verwendet oder bei -20 °C für die spätere Verwendung eingefroren werden. Tauen Sie gefrorene Proben vollständig auf Raumtemperatur auf und wirbeln Sie sie vor der Verwendung ein.

4. Farbentwicklung

1. Chromogenreaktionen gemäß Tabelle 2 in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen oder, für höheren Durchsatz, direkt in den flachen Boden, 96-Well, klare, unbehandelte Polystyrol-Mikrotiterplatten vorbereiten. Bereiten Sie alle Reaktionen (Säurerohling, Standard und Probe) mindestens doppelt vor.
2. Bei Raumtemperatur 15 min inkubieren.

5. Absorptionsmessung

1. Messen Sie die Probenabsorption in einem Spektralphotometer oder Plattenleser bei einer Wellenlänge von 535 nm gegen eine deionisierte Wasserreferenz. Platten können unbedeckt oder deckelfrei gelesen werden. Entfernen Sie im Deckelgehäuse jegliche Kondensation, die sich aufgrund der Freisetzung von Säuredämpfen aus dem Deckel kurz vor der Messung gebildet hat, um mögliche Interferenzen mit dem Absorptionswert zu vermeiden.
   HINWEIS: Die optische Absorption des Säurerohlings gegen deionisiertes Wasser (Referenz) sollte kleiner als 0,015 sein; Die optische Absorption des Standards und der Proben sollte zwischen 0,100 und 1,000 liegen. Bei Proben mit sehr hohem oder sehr niedrigem Eisengehalt müssen die Volumina von Säureextrakt (Überstand) und _diH2O möglicherweise angepasst werden (Tabelle 2): Wenn die Absorption größer als 1,0 ist, verwenden Sie ein kleineres Probenvolumen (Überstand); Wenn die Absorption niedriger als 0,1 ist, verwenden Sie ein höheres Volumen des Überstands. Das Probenvolumen (_Vsmp) wird bei der Berechnung des Eisengehalts des Gewebes jeder Probe berücksichtigt (siehe Schritt 6).

6. Berechnung des Gewebeeisengehalts

1. Berechnen Sie den Eisengehalt an Nicht-Häm-Gewebe mit der folgenden Gleichung:
   Gewebeeisen (μg/g Trockengewebe) =
   _AT = Absorption der Probe
   _AB = Absorption von saurem Rohling
   _AS = Absorption des Standards
   _Fes = Eisenkonzentration von WISS (μg Fe/ml)
   W = Gewicht des Trockengewebes (g)
   _Vsmp = Probenvolumen (variables Volumen des Überstands in Tabelle 2 umgerechnet in ml)
   _Vf = Endvolumen der Säuremischung nach Inkubation über Nacht bei 65 °C (entspricht dem Säurevolumen plus Trockengewebevolumen in ml; wenn sich die Probengewichte nicht wesentlich unterscheiden, nehmen Sie ein konstantes Volumen ≈ 1 ml an)
   _Vstd = Eisenstandardvolumen (WISS-Volumen in Tabelle 2 umgerechnet in ml)
   _Vrv = Endreaktionsvolumen (Gesamtvolumen in Tabelle 2 umgerechnet in ml)

Ergebnisse

Vergleich von Küvette zu 96-Well-Mikrotiterplatten
Die Messung von Gewebe-Nicht-Häm-Eisen durch Reaktion mit einem ursprünglich von Torrance und ^Bothwell5,6 beschriebenen Bathophenanthrol-Reagenz beruht auf der Verwendung eines Spektralphotometers zur Absorptionsmessung. Daher sind die in der Chromogenreaktion verwendeten Volumina mit der Größe einer normalen Spektralphotometerküvette kompatibel. Die vorliegende Arbeit beschreibt eine Me...

Diskussion

Ein Protokoll zur Messung des Nicht-Häm-Eisengehalts in tierischen Geweben wird unter Verwendung einer Anpassung des ursprünglich von Torrance und Bothwell beschriebenen bathophenanthrolinbasierten kolorimetrischen Assays ^{bereitgestellt5,6}. Die kritischen Schritte der Methode sind die Trocknung von Gewebeproben; Proteindenaturierung und Freisetzung von anorganischem Eisen durch saure Hydrolyse; Reduktion von Eisen (^Fe3+) Eisen in den Eisenzustand (

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well UV transparent plate	Sarstedt	82.1581.001
Analytical balance	Kern	ABJ 220-4M
Anhydrous sodium acetate	Merck	106268
Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid)	Sigma-Aldrich	B1375
C57BL/6 mice (Mus musculus)	Charles River Laboratories
Carbonyl iron powder, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	44890
Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA)	VWR	634-0678P
Double distilled, sterile water	B. Braun	0082479E
Fluorescence microplate reader	BioTek Instruments	FLx800
Hydrochloric acid, 37%	Sigma-Aldrich	258148
Microwave digestion oven and white teflon cups	CEM	MDS-2000
Nitric acid	Fisher Scientific	15687290
Oven	Binder	ED115
Rodent chow	Harlan Laboratories	2014S	Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron
Sea bass (Dicentrarchus labrax)	Sonrionansa
Sea bass feed	Skretting	L-2 Alterna 1P
Single beam UV-Vis spectrophotometer	Shimadzu	UV mini 1240
Thioglycolic acid	Merck	100700
Trichloroacetic acid	Merck	100807