Mesure de la teneur en fer non hémique des tissus à l’aide d’un test colorimétrique à base de bathophénanthroline

Résumé

Ici, un protocole pour la mesure de la teneur en fer non hémique dans les tissus animaux est fourni, en utilisant un test colorimétrique simple et bien établi qui peut être facilement mis en œuvre dans la plupart des laboratoires.

Résumé

Le fer est un micronutriment essentiel. La surcharge et la carence en fer sont très préjudiciables aux humains, et les niveaux de fer dans les tissus sont finement régulés. L’utilisation de modèles animaux expérimentaux de surcharge ou de carence en fer a été déterminante pour faire progresser les connaissances sur les mécanismes impliqués dans la régulation systémique et cellulaire de l’homéostasie du fer. La mesure des niveaux de fer total dans les tissus animaux est généralement effectuée par spectroscopie d’absorption atomique ou avec un test colorimétrique basé sur la réaction du fer non hémique avec un réactif bathophénanthroline. Depuis de nombreuses années, le test colorimétrique est utilisé pour mesurer la teneur en fer non hémique dans un large éventail de tissus animaux. Contrairement à la spectroscopie d’absorption atomique, elle exclut la contribution du fer hémique dérivé de l’hémoglobine contenue dans les globules rouges. De plus, il ne nécessite pas de compétences analytiques sophistiquées ou d’équipements très coûteux, et peut donc être facilement mis en œuvre dans la plupart des laboratoires. Enfin, le test colorimétrique peut être basé sur une cuvette ou adapté à un format de microplaque, ce qui permet un débit d’échantillon plus élevé. Le présent travail fournit un protocole bien établi qui convient à la détection d’altérations des niveaux de fer tissulaire dans une variété de modèles animaux expérimentaux de surcharge en fer ou de carence en fer.

Introduction

Le fer est un micronutriment essentiel, nécessaire à la fonction des protéines impliquées dans des processus biologiques cruciaux tels que le transport de l’oxygène, la production d’énergie ou la synthèse de l’ADN. Il est important de noter que l’excès de fer et la carence en fer sont très préjudiciables à la santé humaine, et les niveaux de fer dans les tissus sont finement régulés. L’absorption anormale du fer alimentaire, les régimes alimentaires déficients en fer, les transfusions sanguines répétées et l’inflammation chronique sont des causes courantes de troubles associés au fer qui affectent des milliards de personnes dans le ^monde1,2,3.

Des modèles animaux expérimentaux de surcharge ou de carence en fer ont joué un rôle déterminant dans la progression de nos connaissances sur les mécanismes impliqués dans la régulation systémique et cellulaire de l’homéostasie du ^fer4. Malgré les progrès substantiels réalisés au cours des deux dernières décennies, de nombreux aspects clés restent insaisissables. Dans les années à venir, la mesure précise des niveaux totaux de fer dans les tissus animaux restera une étape cruciale pour faire progresser la recherche dans le domaine de la biologie du fer.

La plupart des laboratoires quantifient le fer tissulaire avec la spectroscopie d’absorption atomique (SAA), la spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS) ou un test colorimétrique basé sur la réaction du fer non hémique avec un réactif bathophtrophrolique. Ce dernier est basé sur la méthode originale décrite par Torrance et Bothwell il y a plus de 50 ^ans5,6. Bien qu’une variante de cette méthode ait ensuite été développée en utilisant la ferrozine comme alternative à la bathophénanthroline7, cette dernière reste le réactif chromogène le plus largement cité dans la littérature.

La méthode de choix dépend souvent de l’expertise et de l’infrastructure disponibles. Bien que l’AAS et l’ICP-MS soient plus sensibles, le test colorimétrique reste largement utilisé car il présente les avantages importants suivants: i) il exclut la contribution du fer hémique dérivé de l’hémoglobine contenue dans les globules rouges; ii) il ne nécessite pas de compétences analytiques sophistiquées ou d’équipement très coûteux; et iii) le test original à base de cuvette peut être adapté à un format de microplaque, ce qui permet un débit d’échantillon plus élevé. L’approche colorimétrique présentée dans ce travail est couramment utilisée pour quantifier les altérations des niveaux de fer non hémique dans les tissus dans une variété de modèles animaux expérimentaux de surcharge en fer ou de carence en fer, des rongeurs aux poissons et à la mouche des fruits. Ici, un protocole pour la mesure de la teneur en fer non hémique dans les tissus animaux est fourni, en utilisant un test colorimétrique simple et bien établi que la plupart des laboratoires devraient trouver facile à mettre en œuvre.

Protocole

Des souris C57BL/6 ont été achetées dans le commerce et des souris hepcidine-nulle (Hamp1^−/−) sur fond C57BL/⁶⁸ ont été un cadeau aimable de Sophie Vaulont (Institut Cochin, France). Les animaux ont été hébergés dans l’installation pour animaux i3S dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes, dans un environnement à température et à lumière contrôlées, avec un accès libre au chow et à l’eau standard des rongeurs. Le bar européen (Dicentrarchus labrax) a été acheté dans une ferme piscicole commerciale et logé à l’installation pour animaux ICBAS, dans un environnement à température et à lumière contrôlées, et nourri quotidiennement ad libitum avec des aliments standard pour le bar. Toutes les procédures impliquant des animaux vertébrés ont été approuvées par le comité d’éthique animale i3S et l’autorité nationale, Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV). Les renseignements sur les réactifs commerciaux, l’équipement et les animaux sont énumérés dans le Tableau des matériaux.

1. Préparation de la solution

REMARQUE: Manipulez et préparez tous les réactifs et solutions avec de la verrerie sans fer ou de la plastique jetable. Ne laissez pas les matériaux de laboratoire métalliques (p. ex. spatules en acier inoxydable) entrer en contact avec un réactif ou une solution, en raison du risque de contamination par le fer. Assurez-vous que toute verrerie réutilisable est sans fer. Laver les matériaux avec un détergent de laboratoire approprié pendant 30 à 60 min, rincer à l’eau désionisée, faire tremper toute la nuit dans une solution d’acide nitrique à 37% diluée 1:3 avec de l’eau désionisée, rincer à nouveau à l’eau désionisée et laisser sécher.

1. Mélange acide : Ajouter 10 g d’acide trichloroacétique à 82,2 mL d’acide chlorhydrique à 37 % dans une bouteille en verre, bien dissoudre et ajuster le volume final à 100 mL avec de l’eau désionisée. Agiter avant utilisation. Alternativement, utilisez seulement 37% d’acide chlorhydrique pour la digestion des tissus.
   REMARQUE: La solution est stable pendant au moins 2 mois lorsqu’elle est stockée dans des bouteilles de réactif en verre brun foncé.
   ATTENTION : L’acide chlorhydrique et l’acide trichloroacétique sont corrosifs et les formes concentrées libèrent des vapeurs acides toxiques. Portez des vêtements de protection, des gants résistants aux produits chimiques et des lunettes anti-éclaboussures chimiques en tout temps lorsque vous manipulez des acides. Évitez de les respirer et manipulez toujours les acides sous une hotte aspirante.
2. Acétate de sodium saturé : Ajouter 228 g d’acétate de sodium anhydre à 400 mL d’eau désionisée dans une bouteille en verre et agiter pendant la nuit à température ambiante. Laissez la solution reposer et précipiter pendant une journée. Si aucune précipitation ne se produit, continuez d’ajouter de petites quantités d’acétate de sodium. Conservez la solution dans une bouteille en verre.
3. Réactif chromogène: Pour préparer 1 mL de réactif chromogène, ajoutez 1 mg de sel disodique d’acide disulfonique de 4,7-diphényl-1,10-phénanthroline à 500 μL d’eau désionisée et 10 μL d’acide thioglycolique concentré (100%) et dissolvez-le complètement. Porter le volume final à 1 mL avec de l’eau désionisée.
   REMARQUE: Préparez autant de réactif chromogène que nécessaire. La solution est stable pendant 1 mois lorsqu’elle est protégée de la lumière.
4. Réactif chromogène de travail (WCR): Ajouter 1 volume du réactif chromogène à 5 volumes d’acétate de sodium saturé et à 5 volumes d’eau désionisée.
   REMARQUE: Cette solution doit être préparée fraîchement le jour de l’utilisation.
5. Solution étalon de fer mère : Pour préparer une solution de fer mère de 20 mM, placer 111,5 mg de poudre de fer carbonyle dans une fiole jaugée de 250 mL contenant 5 480 μL d’acide chlorhydrique à 37 %. Laisser dissoudre toute la nuit à température ambiante (ou incuber dans un bain-marie bouillant). Ensuite, composez la solution à un volume final de 100 mL avec de l’eau désionisée.
   REMARQUE: La solution standard peut être conservée indéfiniment lorsqu’elle est stockée dans un récipient hermétiquement fermé.
6. Solution étalon de fer de travail (WISS) : Ajouter 13,5 μL d’acide chlorhydrique à 37 % à 500 μL d’eau désionisée. Ajouter 10 μL de la solution étalon de fer mère et porter le volume final à 1 mL avec de l’eau désionisée (11,169 μg de Fe/mL, 200 μM; mesuré par AAS).
   REMARQUE: La solution de travail doit être préparée fraîchement le jour de l’utilisation.

2. Séchage de l’échantillon

1. Couper un échantillon de tissu pesant 10-100 mg avec une lame de scalpel. Pesez-le avec précision dans une balance analytique / précision sur un petit morceau de parafilm (Fresh Weight).
2. À l’aide d’une pince à épiler en plastique, placez le morceau de tissu dans une plaque de 24 puits (non glissée pour permettre l’évaporation de l’eau) et laissez-le sécher sur un incubateur standard à 65 °C pendant 48 h.
3. Vous pouvez également utiliser un four de digestion par micro-ondes de laboratoire pour sécher des échantillons de tissus. À l’aide d’une pince à épiler en plastique, placez le morceau de tissu pesé dans une tasse en téflon sans fer et séchez-le au micro-ondes. Réglez les paramètres de fonctionnement conformément au manuel d’instructions de l’instrument.
   REMARQUE: À titre de référence, les paramètres de fonctionnement pour le séchage des échantillons de foie à l’aide du four de digestion spécifique (voir tableau des matériaux) sont indiqués dans le tableau 1.
4. À l’aide d’une pince à épiler en plastique, placez chaque morceau de tissu séché sur un petit morceau de parafilm à l’intérieur d’une balance analytique / de précision et pesez-le avec précision (poids sec).

3. Échantillon de digestion acide

1. À l’aide d’une pince à épiler en plastique, transférer chaque morceau de tissu séché dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
2. Ajouter 1 mL du mélange acide et fermer le tube de microcentrifugation. Préparez un blanc acide de la même manière, sauf que le tissu est omis.
   ATTENTION : Le mélange acide est corrosif et libère des vapeurs toxiques. Portez des vêtements de protection, des gants résistants aux produits chimiques et des lunettes anti-éclaboussures chimiques lorsque vous manipulez le mélange acide. Évitez de l’inhaler et manipulez-le toujours sous une hotte aspirante.
3. Digérer les tissus en incubant les tubes de microcentrifugation dans un incubateur à 65 °C pendant 20 h.
4. Après refroidissement à température ambiante, transférer 500 μL de l’extrait acide clair (jaune) (surnageant) dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL à l’aide d’une micropipette équipée de pointes en plastique. S’il n’est pas possible d’obtenir un surnageant clair, effectuez un court spin de centrifugation.
   ATTENTION : Le surnageant est très acide. Portez des vêtements de protection, des gants résistants aux produits chimiques et des lunettes anti-éclaboussures chimiques lorsque vous manipulez les surnageants. Manipulez-les toujours sous une hotte.
   REMARQUE: À ce stade, les extraits acides peuvent être immédiatement utilisés pour le test colorimétrique ou congelés à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. Décongeler complètement les échantillons congelés à température ambiante et les vortexer avant utilisation.

4. Développement des couleurs

1. Préparer les réactions chromogènes comme indiqué dans le tableau 2 dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL ou, pour un débit plus élevé, directement dans le fond plat, des microplaques de polystyrène transparentes et non traitées à fond plat. Préparer toutes les réactions (blanc acide, étalon et échantillon) au moins en double exemplaire.
2. Incuber à température ambiante pendant 15 min.

5. Lecture de l’absorbance

1. Mesurer l’absorbance de l’échantillon dans un spectrophotomètre ou un lecteur de plaques à une longueur d’onde de 535 nm par rapport à une référence d’eau désionisée. Les plaques peuvent être lues non glissées ou avec couvercle. Dans le boîtier à couvercle, éliminez toute condensation formée par la libération de vapeurs acides du couvercle juste avant la mesure afin d’éviter toute interférence possible avec la lecture de l’absorbance.
   REMARQUE: L’absorbance optique de l’acide à blanc lu par rapport à l’eau désionisée (référence) doit être inférieure à 0,015; l’absorbance optique de l’étalon et des échantillons doit être comprise entre 0,100 et 1,000. Pour les échantillons à très ou très faible teneur en fer, les volumes d’extrait acide (surnageant) et de _diH2O peuvent devoir être ajustés (tableau 2): si l’absorbance est supérieure à 1,0, utilisez un volume d’échantillon plus petit (surnageant); lorsque l’absorbance est inférieure à 0,1, utilisez un volume plus élevé du surnageant. Le volume de l’échantillon (_Vsmp) est pris en compte lors du calcul de la teneur en fer tissulaire de chaque échantillon (voir étape 6).

6. Calcul de la teneur en fer tissulaire

1. Calculez la teneur en fer des tissus non hémiques à l’aide de l’équation suivante :
   Fer tissulaire (μg/g de tissu sec) =
   _AT = absorbance de l’échantillon d’essai
   _AB = absorbance de l’ébauche acide
   _AS = absorbance de l’étalon
   _Fes = concentration en fer du WISS (μg Fe/mL)
   W = poids des tissus secs (g)
   _Vsmp = volume de l’échantillon (volume variable de surnageant dans le tableau 2 converti en mL)
   _Vf = volume final du mélange acide après incubation nocturne à 65 °C (correspondant au volume acide plus volume de tissu sec en mL; si les poids de l’échantillon ne diffèrent pas de manière significative, supposons un volume constant ≈ 1 mL)
   _Vstd = volume standard de fer (volume de WISS dans le tableau 2 converti en mL)
   _Vrv = volume de réaction final (volume total du tableau 2 converti en mL)

Résultats

Comparaison entre la cuvette et la microplaque à 96 puits
La mesure du fer non hémique tissulaire par réaction avec un réactif bathophénanthroline décrit à l’origine par Torrance et ^Bothwell5,6 repose sur l’utilisation d’un spectrophotomètre pour la lecture de l’absorbance. Par conséquent, les volumes utilisés dans la réaction chromogène sont compatibles avec la taille d’une cuvette spectrophotomètre régulière. Le pré...

Discussion

Un protocole pour la mesure de la teneur en fer non hémique dans les tissus animaux est fourni, en utilisant une adaptation du dosage colorimétrique à base de bathophénanthroline décrit à l’origine par Torrance et ^Bothwell5,6. Les étapes critiques de la méthode sont le séchage des échantillons de tissus; dénaturation des protéines et libération de fer inorganique par hydrolyse acide; réduction du fer ferrique (^Fe3+) à l’état ferreux...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well UV transparent plate	Sarstedt	82.1581.001
Analytical balance	Kern	ABJ 220-4M
Anhydrous sodium acetate	Merck	106268
Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid)	Sigma-Aldrich	B1375
C57BL/6 mice (Mus musculus)	Charles River Laboratories
Carbonyl iron powder, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	44890
Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA)	VWR	634-0678P
Double distilled, sterile water	B. Braun	0082479E
Fluorescence microplate reader	BioTek Instruments	FLx800
Hydrochloric acid, 37%	Sigma-Aldrich	258148
Microwave digestion oven and white teflon cups	CEM	MDS-2000
Nitric acid	Fisher Scientific	15687290
Oven	Binder	ED115
Rodent chow	Harlan Laboratories	2014S	Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron
Sea bass (Dicentrarchus labrax)	Sonrionansa
Sea bass feed	Skretting	L-2 Alterna 1P
Single beam UV-Vis spectrophotometer	Shimadzu	UV mini 1240
Thioglycolic acid	Merck	100700
Trichloroacetic acid	Merck	100807