Измерение содержания негемового железа в тканях с помощью колориметрического анализа на основе батофенантролина

Резюме

Здесь представлен протокол измерения содержания негемового железа в тканях животных с использованием простого, хорошо зарекомендовавшего себя колориметрического анализа, который может быть легко реализован в большинстве лабораторий.

Аннотация

Железо является важным микроэлементом. Как перегрузка железом, так и его дефицит очень вредны для человека, а уровень железа в тканях точно регулируется. Использование экспериментальных животных моделей перегрузки или дефицита железа сыграло важную роль в углублении знаний о механизмах, участвующих в системной и клеточной регуляции гомеостаза железа. Измерение общего уровня железа в тканях животных обычно выполняется с помощью атомно-абсорбционной спектроскопии или колориметрического анализа, основанного на реакции негемового железа с батофенантроловым реагентом. В течение многих лет колориметрический анализ использовался для измерения содержания негемового железа в широком диапазоне тканей животных. В отличие от атомно-абсорбционной спектроскопии, она исключает вклад гемового железа, полученного из гемоглобина, содержащегося в эритроцитах. Кроме того, он не требует сложных аналитических навыков или дорогостоящего оборудования и, таким образом, может быть легко реализован в большинстве лабораторий. Наконец, колориметрический анализ может быть либо на основе кюветы, либо адаптирован к формату микропластины, что обеспечивает более высокую пропускную способность образца. Настоящая работа обеспечивает хорошо зарекомендовавший себя протокол, который подходит для обнаружения изменений в уровнях железа в тканях в различных экспериментальных моделях перегрузки железа или дефицита железа на животных.

Введение

Железо является важным микроэлементом, необходимым для функции белков, участвующих в важнейших биологических процессах, таких как транспорт кислорода, производство энергии или синтез ДНК. Важно отметить, что как избыток железа, так и дефицит железа наносят большой ущерб здоровью человека, а уровни железа в тканях точно регулируются. Аномальное усвоение железа с пищей, диеты с дефицитом железа, повторные переливания крови и хроническое воспаление являются распространенными причинами связанных с железом расстройств, которые затрагивают миллиарды людей во всем ^{мире1,2,3}.

Экспериментальные животные модели перегрузки или дефицита железа сыграли важную роль в продвижении наших знаний о механизмах, участвующих в системной и клеточной регуляции гомеостаза ^{железа4}. Несмотря на существенный прогресс, достигнутый за последние два десятилетия, многие ключевые аспекты остаются недостижимыми. В ближайшие годы точное измерение общего уровня железа в тканях животных останется важным шагом для продвижения исследований в области биологии железа.

Большинство лабораторий количественно оценивают тканевое железо с помощью атомно-абсорбционной спектроскопии (ААС), масс-спектрометрии плазмы с индуктивной связью (ICP-MS) или колориметрического анализа, основанного на реакции негемового железа с батофенантролиновым реагентом. Последний основан на оригинальном методе, описанном Торрансом и Ботвеллом более 50 лет ^{назад5,6}. В то время как вариация этого метода была впоследствии разработана с использованием феррозина в качестве альтернативы батофенантролину7, последний остается наиболее широко цитируемым хромогенным реагентом в литературе.

Выбор метода часто зависит от имеющихся знаний и инфраструктуры. В то время как ААС и ВЧП-МС более чувствительны, колориметрический анализ остается широко используемым, поскольку он представляет следующие важные преимущества: i) он исключает вклад гемового железа, полученного из гемоглобина, содержащегося в эритроцитах; ii) не требует сложных аналитических навыков или дорогостоящего оборудования; и iii) оригинальный анализ на основе кюветы может быть адаптирован к формату микропластины, что обеспечивает более высокую пропускную способность образца. Колориметрический подход, представленный в этой работе, обычно используется для количественной оценки изменений в тканевых негемовых уровнях железа в различных экспериментальных моделях перегрузки железа или дефицита железа на животных, от грызунов до рыб и плодовой мухи. Здесь представлен протокол измерения содержания негемового железа в тканях животных с использованием простого, хорошо зарекомендовавшего себя колориметрического анализа, который большинство лабораторий должны найти простым в реализации.

протокол

Мыши C57BL/6 были коммерчески приобретены, а мыши с гепцидиновым нулем (Hamp1^−/−) на фоне C57BL/⁶⁸ были добрым подарком от Софи Волонт (Institut Cochin, Франция). Животные были размещены на объекте для животных i3S в специфических условиях, свободных от патогенов, в среде с контролируемой температурой и светом, со свободным доступом к стандартному чау-чау и воде для грызунов. Европейский морской окунь (Dicentrarchus labrax) был куплен на коммерческой рыбной ферме и размещен на животноводческом объекте ICBAS, в среде с контролируемой температурой и светом, и ежедневно подкармливался стандартным кормом для морского окуня. Все процедуры, касающиеся позвоночных животных, были одобрены Комитетом по этике животных i3S и национальным органом Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV). Информация о коммерческих реагентах, оборудовании и животных указана в Таблице материалов.

1. Приготовление раствора

ПРИМЕЧАНИЕ: Обрабатывайте и готовьте все реагенты и растворы с помощью стеклянной посуды без железа или одноразовой пластиковой посуды. Не допускайте контакта металлических лабораторных материалов (например, шпателей из нержавеющей стали) с любым реагентом или раствором из-за риска загрязнения железом. Убедитесь, что любая многоразовая стеклянная посуда не содержит железа. Промыть материалы соответствующим лабораторным моющим средством в течение 30-60 мин, промыть деионизированной водой, замочить на ночь в 37% растворе азотной кислоты, разбавленной 1:3 деионизированной водой, снова промыть деионизированной водой и дать высохнуть.

1. Кислотная смесь: Добавьте 10 г трихлоруксусной кислоты к 82,2 мл 37% соляной кислоты в стеклянной бутылке, тщательно растворите и отрегулируйте конечный объем до 100 мл с деионизированной водой. Встряхните перед употреблением. В качестве альтернативы, используйте только 37% соляной кислоты для переваривания тканей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор стабилен в течение не менее 2 месяцев при хранении в темно-коричневых стеклянных бутылках с реагентами.
   ВНИМАНИЕ: Соляная кислота и трихлоруксусная кислота являются коррозионными, а концентрированные формы выделяют токсичные кислые пары. Всегда носите защитную одежду, химически стойкие перчатки и химические очки для брызг при работе с кислотами. Избегайте вдыхания и всегда обращайтесь с кислотами, находясь под вытяжным капюшоном.
2. Насыщенный ацетат натрия: Добавьте 228 г безводного ацетата натрия к 400 мл деионизированной воды в стеклянной бутылке и перемешайте в течение ночи при комнатной температуре. Дайте раствору отдохнуть и выпасть в осадок в течение суток. Если осадков не происходит, продолжайте добавлять небольшое количество ацетата натрия. Храните раствор в стеклянной бутылке.
3. Хромогенный реагент: Для получения 1 мл хромогенного реагента добавляют 1 мг 4,7-дифенил-1,10-фенантролиндисульфроновой кислоты динатриевой соли к 500 мкл деионизированной воды и 10 мкл концентрированной (100%) тиогликолевой кислоты и тщательно растворяют. Заполните конечный объем до 1 мл деионизированной водой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте столько хромогенного реагента, сколько необходимо. Раствор стабилен в течение 1 месяца при защите от света.
4. Рабочий хромогенный реагент (WCR): Добавьте 1 объем хромогенного реагента к 5 объемам насыщенного ацетата натрия и 5 объемам деионизированной воды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор должен быть приготовлен свежим в день использования.
5. Стандартный раствор железа: Для приготовления 20 мМ раствора железа поместите 111,5 мг порошка карбонильного железа в объемную колбу объемом 250 мл, содержащую 5 480 мкл соляной кислоты. Оставить растворяться на ночь при комнатной температуре (или инкубировать на кипящей водяной бане). Затем внесите раствор в конечный объем 100 мл деионизированной водой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартный раствор можно хранить бесконечно при хранении в плотно закрытом сосуде.
6. Стандартный раствор рабочего железа (WISS): Добавьте 13,5 мкл 37% соляной кислоты к 500 мкл деионизированной воды. Добавьте 10 мкл стандартного раствора железа и составьте конечный объем до 1 мл с деионизированной водой (11,169 мкг Fe/мл, 200 мкМ; измерено ААС).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий раствор должен быть приготовлен свежим в день использования.

2. Сушка образцов

1. Вырежьте образец ткани массой 10-100 мг лезвием скальпеля. Точно взвесьте его в аналитических/прецизионных весах над небольшим кусочком парапленки (Fresh Weight).
2. Используя пластиковый пинцет, поместите кусок ткани в 24-луночную пластину (нескользящую, чтобы обеспечить испарение воды) и дайте ей высохнуть на стандартном инкубаторе при 65 °C в течение 48 часов.
3. В качестве альтернативы можно использовать лабораторную микроволновую печь для сушки образцов тканей. Используя пластиковый пинцет, поместите взвешенный кусок ткани в безжелезненный тефлоновый стаканчик и высушите его в микроволновой печи. Установите рабочие параметры в соответствии с инструкцией прибора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве справочной информации эксплуатационные параметры для сушки образцов печени с использованием конкретной печи для сбраживания (см. Таблицу материалов) приведены в таблице 1.
4. Используя пластиковый пинцет, поместите каждый высушенный кусочек ткани на небольшой кусочек парапленки внутри аналитических / прецизионных весов и точно взвесьте его (сухой вес).

3. Образец кислотного пищеварения

1. Используя пластиковый пинцет, переместите каждый высушенный кусочек ткани в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
2. Добавьте 1 мл кислотной смеси и закройте микроцентрифужную трубку. Приготовьте кислотную заготовку таким же образом, за исключением того, что ткань опущена.
   ВНИМАНИЕ: Кислотная смесь является коррозионной и выделяет токсичные пары. Носите защитную одежду, химически стойкие перчатки и химические очки для брызг при работе с кислотной смесью. Избегайте вдыхания и всегда обращайтесь с ним, находясь под вытяжным капюшоном.
3. Переваривайте ткани путем инкубации микроцентрифужных трубок в инкубаторе при 65 °C в течение 20 ч.
4. После охлаждения до комнатной температуры переложите 500 мкл прозрачного (желтого) кислотного экстракта (супернатанта) в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл с помощью микропипетки, оснащенной пластиковыми наконечниками. Если нет возможности получить прозрачный супернатант, выполните короткий спин центрифугирования.
   ВНИМАНИЕ: Супернатант очень кислый. Носите защитную одежду, химически стойкие перчатки и химические очки для брызг при обращении со сверхнатантами. Всегда обращайтесь с ними, находясь под вытяжным капюшоном.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе кислотные экстракты могут быть немедленно использованы для колориметрического анализа или заморожены при -20 °C для последующего использования. Полностью разморозьте замороженные образцы до комнатной температуры и вращайте их перед использованием.

4. Развитие цвета

1. Готовят хромогенные реакции, как указано в таблице 2 , в микроцентрифужных трубках объемом 1,5 мл или, для более высокой пропускной способности, непосредственно в плоское дно, 96-луночные, прозрачные, необработанные полистирольные микропластины. Подготовьте все реакции (кислотная заготовка, стандарт и образец), по крайней мере, в двух экземплярах.
2. Инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин.

5. Показания поглощения

1. Измерьте поглощение образца в спектрофотометре или пластинчатом считывателе на длине волны 535 нм по отношению к деионизированному эталону воды. Пластины могут быть прочитаны без подвязки или с крышкой. В корпусе с крышкой удалите любую конденсацию, образовавшуюся из-за выделения паров кислоты из крышки непосредственно перед измерением, чтобы избежать возможных помех показаниям абсорбции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптическое поглощение кислотной заготовки, считанной по отношению к деионизированной воде (эталон), должно быть менее 0,015; оптическое поглощение эталона и образцов должно составлять от 0,100 до 1,000. Для образцов с очень высоким или очень низким содержанием железа объемы кислотного экстракта (супернатанта) и _diH2O, возможно, потребуется скорректировать (таблица 2): если поглощение превышает 1,0, используйте меньший объем образца (надподобного вещества); когда поглощение ниже 0,1, используйте больший объем супернатанта. Объем образца (_Vsmp) учитывается при расчете содержания железа в тканях каждого образца (см. шаг 6).

6. Расчет содержания железа в тканях

1. Рассчитайте содержание железа в негемовой ткани по следующему уравнению:
   Тканевое железо (мкг/г сухой ткани) =
   _AT = поглощение испытуемого образца
   _AB = поглощение кислотной заготовки
   _AS = поглощение стандарта
   _Fes = концентрация железа в WISS (мкг Fe/мл)
   W = масса сухой ткани (г)
   _Vsmp = объем образца (переменный объем супернатанта в таблице 2, преобразованный в мл)
   _Vf = конечный объем кислотной смеси после ночной инкубации при 65 °C (соответствует объему кислоты плюс объем сухой ткани в мл; если вес образца существенно не отличается, предположим постоянный объем ≈ 1 мл)
   _Vstd = стандартный объем железа (объем WISS в таблице 2, преобразованный в мл)
   _Vrv = конечный реакционный объем (Общий объем в таблице 2 в пересчете на мл)

Результаты

Сравнение микропластин кюветы и 96-луночной микропластины
Измерение тканевого негемового железа путем реакции с батофенантролиновым реагентом, первоначально описанным Торрансом и ^{Ботвеллом5,6}, основано на использовании спектрофотометра для ...

Обсуждение

Приведен протокол измерения содержания негемового железа в тканях животных с использованием адаптации колориметрического анализа на основе батофенантролина, первоначально описанного Торрансом и Ботвеллом5,6. Критическими этапами метода являются сушк...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well UV transparent plate	Sarstedt	82.1581.001
Analytical balance	Kern	ABJ 220-4M
Anhydrous sodium acetate	Merck	106268
Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid)	Sigma-Aldrich	B1375
C57BL/6 mice (Mus musculus)	Charles River Laboratories
Carbonyl iron powder, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	44890
Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA)	VWR	634-0678P
Double distilled, sterile water	B. Braun	0082479E
Fluorescence microplate reader	BioTek Instruments	FLx800
Hydrochloric acid, 37%	Sigma-Aldrich	258148
Microwave digestion oven and white teflon cups	CEM	MDS-2000
Nitric acid	Fisher Scientific	15687290
Oven	Binder	ED115
Rodent chow	Harlan Laboratories	2014S	Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron
Sea bass (Dicentrarchus labrax)	Sonrionansa
Sea bass feed	Skretting	L-2 Alterna 1P
Single beam UV-Vis spectrophotometer	Shimadzu	UV mini 1240
Thioglycolic acid	Merck	100700
Trichloroacetic acid	Merck	100807