JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا بروتوكولا حول كيفية تحضير الثقافات الأولية للخلايا الدبقية والخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة من قشرة الفئران لتصوير فيديو الفاصل الزمني ل Ca2+ داخل الخلايا للبحث في الفيزيولوجيا المرضية للتصلب الجانبي الضموري في نموذج الفئران hSOD1G93A .

Abstract

يوضح هذا البروتوكول كيفية تحضير الثقافات الأولية للخلايا الدبقية والخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة من قشرة فئران Sprague Dawley وكيفية استخدام هذه الخلايا لغرض دراسة الفيزيولوجيا المرضية للتصلب الجانبي الضموري (ALS) في نموذج الفئران hSOD1G93A . أولا ، يوضح البروتوكول كيفية عزل وزراعة الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة من قشرة الفئران بعد الولادة ، ثم كيفية توصيف واختبار هذه الثقافات من أجل النقاء عن طريق الكيمياء المناعية باستخدام علامة البروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) للخلايا النجمية وجزيء محول الكالسيوم المتأين 1 (Iba1) علامة الخلايا الدبقية الصغيرة. في المرحلة التالية ، يتم وصف طرق تحميل الصبغة (Fluo 4-AM الحساسة للكالسيوم) للخلايا المستزرعة وتسجيلات تغييرات Ca2+ في تجارب تصوير الفيديو على الخلايا الحية.

تتكون أمثلة تسجيلات الفيديو من: (1) حالات تصوير Ca2+ للخلايا النجمية المستزرعة المعرضة بشكل حاد للغلوبولين المناعي G (IgG) المعزول من مرضى ALS ، مما يدل على استجابة مميزة ومحددة مقارنة بالاستجابة ل ATP كما هو موضح في نفس التجربة. تظهر الأمثلة أيضا ارتفاعا عابرا أكثر وضوحا في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا الذي يثيره ALS IgG في الخلايا النجمية hSOD1G93A مقارنة بالضوابط غير المعدلة وراثيا. (2) تصوير Ca 2+ للخلايا النجمية المستزرعة أثناء استنفاد مخازن الكالسيوم بواسطة thapsigargin (Thg) ، وهو مثبط غير تنافسي للشبكة الإندوبلازمية Ca 2+ ATPase ، متبوعا بدخول الكالسيوم الذي يتم تشغيله في المتجر الناتج عن إضافة الكالسيوم في محلول التسجيل ، مما يوضح الفرق بين تشغيل مخزن Ca 2+ في hSOD1G93A وفي الخلايا النجمية غير المعدلة وراثيا ؛ (3) تصوير Ca2+ للخلايا الدبقية الصغيرة المستزرعة يظهر في الغالب عدم الاستجابة ل ALS IgG ، في حين أن تطبيق ATP أثار تغيير Ca2 +. تؤكد هذه الورقة أيضا على المحاذير والتحذيرات المحتملة فيما يتعلق بكثافة الخلايا الحرجة ونقاء الثقافات ، واختيار التركيز الصحيح لصبغة Ca2+ وتقنيات تحميل الصبغة.

Introduction

أدت تقنيات زراعة الخلايا إلى العديد من التطورات في مجالات متنوعة من الفيزيولوجيا العصبية الخلوية في الصحة والمرض. على وجه الخصوص ، تسمح مزارع الخلايا الأولية ، المعزولة حديثا من الأنسجة العصبية لحيوان المختبر ، للمجرب بدراسة سلوك الخلايا المتنوعة عن كثب في وسائط كيميائية حيوية وإعدادات فسيولوجية مختلفة. يوفر استخدام مؤشرات فسيولوجية فلورية مختلفة مثل الأصباغ الحساسة ل Ca2+ مع الفحص المجهري بالفيديو بفاصل زمني رؤية أفضل للعمليات الفيزيائية الحيوية والكيميائية الحيوية الخلوية في الوقت الفعلي.

ALS هو مرض تنكسي عصبي مدمر يؤثر على الخلايا العصبية الحركية العلوية والسفلية1. هذا المرض لديه إمراض معقد من النوع العائلي ولكن في الغالب من شكل متقطع (90 ٪ من الحالات)2. من المعروف أن الآليات المستقلة غير الخلوية تساهم في الفيزيولوجيا المرضية لمرض التصلب الجانبي الضموري ، ويرجع ذلك أساسا إلى الدور الأساسي للخلايا الدبقية3. كما يتميز مرض التصلب الجانبي الضموري بأنه مرض التهابي عصبي مع تورط عوامل الالتهاب الخلطية والخلوية.

يستخدم الغلوبولين المناعي G على نطاق واسع كعلامة جزيئية في ALS والأمراض التنكسية العصبية الأخرى. يمكن أن تشير دراسة مستوى مصل هذه العلامة إلى وجود ومرحلة الالتهاب العصبي في المرض4،5،6 ، في حين أن وجودها في السائل النخاعي يمكن أن يشير إلى خرق حاجز الدم في الدماغ7. تم تحديد IgGs أيضا كرواسب في الخلايا العصبية الحركية للحبل الشوكي لمرضى ALS7. ومع ذلك ، فقد أظهر هذا النهج بعض التناقضات في ارتباط مستوى IgGs بمرحلة وخصائص المرض6.

يمكن أن يؤدي IgG المعزول من أمصال مرضى ALS (ALS IgG) إلى استجابة الكالسيوم في الخلايا النجمية الساذجة8 وإطلاق الغلوتامات في الخلايا العصبية ، مما يشير إلى تأثير السمية المثيرة - وهي السمة المميزة لعلم أمراض ALS9. ومع ذلك ، أظهرت الدراسات التي أجريت على نموذج الفئران hSOD1G93A ALS (الذي يحتوي على نسخ متعددة من طفرة SOD1 البشرية10) عددا من علامات الإجهاد التأكسدي في الخلايا العصبية المستزرعة 11 ، أو الأنسجة 12،13،14 ، أو الحيوانات الحية 13. من الجدير بالذكر أن الخلايا النجمية المستزرعة من نموذج الفئران ALS كانت أكثر عرضة للإجهاد التأكسدي الناجم عن البيروكسيد من الخلايا النجمية من فضلات القمامة غير المعدلة وراثيا11.

تتأثر الخلايا الدبقية الصغيرة في المزرعة ب ALS IgG بطريقة أقل وضوحا. وبالتحديد ، أظهر خط الخلايا الدبقية الصغيرة BV-2 ارتفاعا في الإشارة من علامات الفلورسنت للإجهاد التأكسدي استجابة لتطبيق عينات مرضى 4/11 ALS IgG فقط15. من المعروف أن الخلايا الدبقية الصغيرة تشارك في العديد من الأمراض الالتهابية العصبية ، مما يزيد من الإجهاد التأكسدي ومرحلة التقدم المتأخر في آلية مستقلة غير خلية من ALS16،17. ومع ذلك ، أشارت البيانات مع ALS IgGs إلى أن هذه الخلايا قد لا تكون متفاعلة مثل الخلايا النجمية لهذه العوامل الخلطية لالتهاب ALS. تم إجراء العديد من الدراسات مع الخلايا النجمية الأولية من نماذج ALS الفئران ، ليس فقط في الجراء ولكن أيضا في الحيوانات التي تظهر عليها أعراض ، إما على الدماغ أو على الحبل الشوكي18،19،20،21. وينطبق هذا أيضا على الثقافات الأولية الدبقية الصغيرة ، وإن كان بدرجة أقل من الخلايا النجمية ومعظمها من مناطق الدماغ في المرحلة الجنينية22،23،24.

نحن نستخدم تصوير فيديو الفاصل الزمني ل Ca2+ على الخلايا في الثقافة في المقام الأول كوسيلة لمتابعة العابرين داخل الخلايا لهذا الأيون كعلامة فسيولوجية للسمية الإثارة. وبالتالي ، من خلال التوصيف الفيزيائي الحيوي لهذه العابرين (السعة ، المنطقة تحت الزوال ، وقت الارتفاع ، التردد) يمكن للباحث الحصول على معلمات تشخيصية تجريبية من نماذج خلوية متنوعة للتنكس العصبي. وبالتالي ، توفر هذه التقنية ميزة التقييم الفسيولوجي الكمي ل IgGs كمؤشرات حيوية للمرض. هناك مجموعة كبيرة من الأدبيات حول دور IgGs و Ca2+ في تحريض ALS. تم إجراء معظم هذه الدراسات عن طريق تحفيز ALS عن طريق حقن المريض IgGs في التجارب25،26،27،28،29 ، والتي أظهرت بعد ذلك ارتفاع Ca 2+ داخل الخلايا وترسبات IgG. استكشفت مجموعة من الدراسات تأثير ALS IgGs على المشبك الحركي في المختبر30،31،32. في السياق أعلاه ، تركز التقنية المقدمة هنا على الخلايا الدبقية كلاعبين مهمين في الآلية المستقلة غير الخلوية ل ALS وتحدد استجابتها السمية المحتملة ل IgGs كعوامل خلطية للالتهاب العصبي. قد يكون لهذا النهج تطبيق أوسع في اختبار العوامل الخلطية الأخرى مثل الأمصال الكاملة أو السائل الدماغي الشوكي أو السيتوكينات في أنظمة زراعة الخلايا المختلفة وفي النماذج الخلوية للالتهاب العام.

تصف هذه الورقة كيفية تحضير الثقافات الأولية للخلايا الدبقية والخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة من قشرة فئران Sprague Dawley وكيفية استخدام هذه الخلايا بشكل أكبر لدراسة الفيزيولوجيا المرضية ALS باستخدام IgG المشتق من الأمصال للمريض. تم تفصيل البروتوكولات لتحميل صبغ الخلايا المستزرعة (الشكل 1) وتسجيلات تغييرات Ca2+ في تجارب تصوير الفيديو بفاصل زمني. ستوضح أمثلة تسجيلات الفيديو كيف تتفاعل الخلايا الدبقية مع ALS IgG مقارنة ب ATP ، حيث يقوم الأخير بتنشيط مستقبلات الغشاء البيورينجي. يظهر لأول مرة مثال على كيفية تفاعل الخلايا النجمية المعزولة من دماغ الفئران hSOD1G93A ALS مع استجابة Ca 2+ أكثر وضوحا ل ALS IgG مقارنة بالضوابط غير المعدلة وراثيا وكيفية ربط هذه العملية بالاختلافات في تشغيل متجر Ca2+. يظهر أيضا مثال على تصوير الكالسيوم في الخلايا الدبقية الصغيرة التي تواجه تحديا حادا مع ALS IgG ، مع استجابة متواضعة فقط من الكالسيوم داخل الخلايا.

Protocol

تم إجراء جميع التجارب وفقا لتوجيهات الاتحاد الأوروبي بشأن حماية الحيوانات للأغراض العلمية وبإذن من اللجنة الأخلاقية لكلية الأحياء بجامعة بلغراد (رقم الموافقة EK-BF-2016/08). فيما يتعلق بمواد المريض (الأمصال ل IgGs) ، تم جمعها للفحص السريري الروتيني بموافقة المريض المستنيرة وفقا لمدونة أخلاقيات الجمعية الطبية العالمية (إعلان هلسنكي) للتجارب التي تشمل البشر. تمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة الأخلاقيات التابعة للمركز السريري في صربيا (رقم 850/6).

1. إعداد زراعة الخلايا الأولية

  1. عزل أنسجة المخ
    ملاحظة: يجب إجراء العزل على الجليد باستخدام محاليل الثلج الباردة.
    1. استخدم الجراء حديثي الولادة بعمر 1-3 أيام لزراعة الخلايا الأولية لحديثي الولادة33.
      ملاحظة: بالنسبة للدراسة المقدمة هنا ، تم استخدام Sprague Dawley hSOD1G93A والفئران غير المعدلة وراثيا. بالنسبة للتنميط الجيني ، تم استخدام ذيول الفئران لاستخراج الحمض النووي لاحقا وتفاعل البوليميراز المتسلسل.
    2. يرش رأس الجرو بنسبة 70٪ من الإيثانول ويقطع رأسه على الفور بسرعة باستخدام المقص.
    3. افتح الجلد باستخدام مقص صغير الزاوية لفضح الجمجمة. افتح الجمجمة عن طريق عمل قطع من الثقبة العظمى باتجاه المدارات. بعد ذلك ، قم بعمل قطع خط الوسط العمودي. أخرج الدماغ من الجمجمة وضعه في طبق بتري يحتوي على محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
      ملاحظة: نظف الأدوات بين الجراء لمنع التلوث المتبادل بين الجراء المعدلة وراثيا وغير المعدلة وراثيا. يجب أن يتم عزل القشرة عن بقية الدماغ تحت المجهر المجسم.
    4. باستخدام طرف الملقط ، قم بتمزيق الروابط بين نصفي الكرة الأرضية. بعد ذلك ، افصل نصفي الكرة الأرضية بالملقط المنحني عن طريق دفع نصف الكرة برفق من المركز إلى الجانب.
    5. إزالة السحايا عن طريق تمزيقها بعناية مع ملقط مستقيم ومنحني.
    6. قم بإزالة الحصين عن طريق قرصه بملقط منحني. تخلص من الحصين أو استخدمه لإعداد مزرعة خلية أخرى.
      ملاحظة: يجب تنفيذ المزيد من الخطوات تحت غطاء التدفق الصفحي لضمان ظروف معقمة.
  2. تجانس الأنسجة وتفككها
    1. انقل قشرة واحدة إلى أنبوب سعة 15 مل مملوء ب 3 مل من برنامج تلفزيوني بارد. قم بلف التعليق لأعلى ولأسفل بطرف 1 مل ، وأكمل 10-15 ضربة حتى يصبح التعليق متجانسا.
      ملاحظة: كن حذرا جدا حتى لا تنتج فقاعات في هذه العملية.
    2. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 3 مل من PBS البارد عن طريق سحبها لأعلى ولأسفل بطرف 1 مل. كرر خطوة الطرد المركزي.
      ملاحظة: يجب تسخين جميع المحاليل المستخدمة من هذه النقطة إلى 37 درجة مئوية.
    3. تخلصي من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 2 مل من وسط النسر المعدل الكامل من Dulbecco (DMEM) المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) والمضادات الحيوية (البنسلين والستربتومايسين). انقل التجانس إلى أنبوب سعة 2 مل.
    4. مرر التجانس من خلال إبر 21 جم و 23 جم (ثلاث مرات لكل منهما) لتعليق الخلايا المفردة.
      ملاحظة: كن حذرا جدا حتى لا تنتج فقاعات في هذه العملية.
  3. صب معلق الخلية المحضر من قشرة واحدة في طبق بتري بقطر 60 مم أو دورق T25 (مع معالجة السطح مسبقا بطبقة بولي ببتيد لنمو الخلايا الملتصقة) تحتوي على 3 مل من DMEM الكامل. هز طبق بتري برفق بحيث يتم توزيع التعليق بشكل موحد.
  4. تنمو الخلايا في الحاضنة في جو مرطب من 5٪ CO2/95٪ هواء عند 37 درجة مئوية.
  5. قم بتغيير الوسيط بعد 48 ساعة من العزل واستبدل الوسيط كل 3 أيام.
  6. لتعزيز نمو الخلايا النجمية ، عندما تصل الخلايا إلى 70٪ -80٪ من الالتقاء ، اغسلها باستخدام PBS مسبق التسخين لإزالة الخلايا الدبقية المرتبطة بشكل فضفاض وآثار FBS في الوسط.
    1. التربسين الطبقة الأساسية من الخلايا النجمية عن طريق إضافة 1 مل من محلول التربسين قبل التسخين (0.25٪ تربسين ، 0.02٪ EDTA في PBS ، مصفى معقمة).
    2. ضع الطبق في الحاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 2-5 دقائق.
    3. تحقق من الخلايا تحت المجهر. عندما يبدأون في الانفصال ، أضف 4 مل من DMEM الكامل.
    4. اجمع معلق الخلية وانقله إلى أنبوب سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق.
    5. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من الوسط الكامل. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
    6. أعد طلاء الخلايا بكثافة 104 خلايا / سم2 في 5 مل من DMEM الكامل الطازج.
  7. تغيير الوسيط كل 3 أيام. لتقليل وجود أنواع الخلايا الدبقية الأخرى ، بعد أن تصل الخلايا النجمية إلى التقاء 50٪ وقبل كل استبدال للوسائط ، اغسل الخلايا باستخدام DMEM الكامل.
    1. قم بشفط الوسط الطافي باستخدام ماصة سعة 1 مل وقم بتوزيعه برفق على طبقة الخلايا عدة مرات. تأكد من تغطية سطح طبقة الخلية بالكامل أثناء خطوة الغسيل هذه.
  8. بمجرد أن تصل الخلايا إلى 80٪ التقاء (عادة بعد 14 يوما) ، كرر التربسين وجمع الخلايا النجمية كما هو موضح في الخطوة 1.6.
  9. البذور 5 × 103 من الخلايا النجمية على غطاء زجاجي دائري 7 مم مغطى ببولي-L-ليسين (50 ميكروغرام / مل). استخدامها في التجارب بعد 48 ساعة.
  10. لتعزيز الخلايا الدبقية الصغيرة ، بعد الخطوة 1.7 ، اسمح للخلايا الدبقية بالوصول إلى طبقة متقاربة34. عندما تظهر الخلايا الدبقية الصغيرة أعلى طبقة الخلايا النجمية (بعد 10-15 يوما ، يتم التعرف عليها من خلال أجسامها الأصغر والأكثر بيضاوية وعملياتها الأقصر) ، هز طبق بتري على شاكر مداري لمدة 2 ساعة عند 220 دورة في الدقيقة.
  11. تشتيت وبذر الخلايا الدبقية الصغيرة
    1. اغسل الخلايا المنفصلة والملتصقة بشكل غير محكم برفق عن طريق استنشاق الوسط الطافي بطرف ماصة سعة 1 مل ووزعه برفق على طبقة الخلايا عدة مرات. تأكد من تغطية كامل سطح طبقة الخلية أثناء خطوة الغسيل هذه ، وجمع الوسط مع الخلايا المنفصلة ، ونقله إلى أنبوب سعة 15 مل.
    2. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من المتوسط.
    3. مرر معلق الخلية من خلال إبرة 21 G للحصول على تعليق أحادي الخلية.
      ملاحظة: تستخدم معظم الطرق المنشورة التربسين أو غراء لفصل الأنسجة. ومع ذلك ، فإن إبر 21 G لها ميزة منع الإفراط في هضم الخلايا ، مما يسمح بتفكك ألطف.
    4. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم. البذور 5 × 103 خلايا دبقية صغيرة على غطاء زجاجي دائري 7 مم مطلي ببولي L-ليسين (50 ميكروغرام / مل). استخدامها في التجارب بعد 48 ساعة.
      ملاحظة: من الصعب الحصول على مزرعة دبقية صغيرة نقية عن طريق الهز ، لأن الخلايا السلائف oligodendrocyte والخلايا النجمية قد تظل موجودة في عدد متغير اعتمادا على تجربة المجرب. تم وصف البروتوكول الكيميائي المناعي المستخدم لتقدير وجود مجموعات خلايا مختلفة في الثقافات الدبقية في مكان آخر35.

2. الكيمياء المناعية

  1. شطف الخلايا مطلية على أغطية في PBS ، 2 × 1 دقيقة.
  2. ثبت الخلايا في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  3. يغسل في PBS 3 × 5 دقائق.
  4. احتضن في محلول مانع يحتوي على 10٪ مصل حمار طبيعي (NDS) / 1٪ ألبومين مصل بقري (BSA) / 0.1٪ Triton X-100 لمدة 45 دقيقة في RT.
    1. أضف 50 ميكرولتر من محلول الحجب لكل غطاء بقطر 10 مم.
  5. تحضير الأجسام المضادة الأولية في 1٪ NDS / 1٪ BSA / 0.1٪ TritonX-100 في التخفيفات التالية: الفأر المضاد GFAP 1: 300 ، الماعز المضاد Iba1 1: 500. احتضان الخلايا بالأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند +4 درجة مئوية.
  6. شطف في برنامج تلفزيوني ، 3 × 10 دقائق.
  7. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع الفلوروفور: حمار مضاد للفأر (إثارة 488 نانومتر [1:200)) أو حمار مضاد للماعز (متحمس عند 647 نانومتر [1:200)). احتضان الخلايا لمدة 2 ساعة في RT في الظلام.
  8. يغسل في برنامج تلفزيوني ، 7 × 5 دقائق.
  9. احتضان الخلايا ب 4',6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI، 1:4,000) لمدة 10 دقائق في RT.
  10. يغسل في PBS 5 × 5 دقائق.
  11. قم بتركيب أغطية الأغطية على شرائح المجهر باستخدام محلول تركيب ؛ استخدم قطرة واحدة منه لكل غطاء غطاء.
    ملاحظة: قد تختلف تخفيفات الأجسام المضادة حسب المنتج. يجب على المستخدمين تحديد التخفيفات المثلى لتجاربهم.

3. تصوير فيديو الفاصل الزمني

ملاحظة: يجب حماية المحاليل التي تحتوي على صبغة الفلورسنت من الضوء المباشر. قبل البدء في تجربة التصوير ، تأكد من أن الغطاء الزجاجي لا يتحرك عند تشغيل التروية.

  1. تحضير المحاليل والخلايا
    1. تحضير محلول خارج الخلية (ECS) للتصوير: 140 mM NaCl ، 5 mM KCl ، 2 mM CaCal 2 ، 2 mM MgCl2 ، 10 mM D-glucose ، و 10 mM HEPES. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4. تأكد من أن الأسمولية هي 280-300 مللي أسم / كجم وقم بإعداد ECS بدون الكالسيوم2+: 140 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 5 مللي مول KCl ، 2 مللي مول MgCl2 ، 10 مللي مول D-glucose ، 10 mM HEPES ، و 0.1 mM EGTA.
    2. تحضير حلول الاختبار: 100 ميكرومتر ATP مذاب في ECS ، 1 ميكرومتر Thg في ECS بدون Ca2+ ، و 0.1 مجم / مل ALS IgG في ECS8.
    3. انقل غطاء غطاء واحد إلى طبق مع ECS لغسل DMEM بالكامل. قم بإعداد محلول تحميل الصبغة عن طريق تخفيف محلول مخزون 1 مللي مول من Fluo-4 AM مع ECS إلى التركيز النهائي البالغ 5 ميكرومتر Fluo-4 AM.
      1. ضع الغطاء مع الخلايا في محلول تحميل الصبغة لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام. اغسل الخلايا في ECS لمدة 20 دقيقة.
    4. إذا لم يتم تحميل الخلايا بشكل كاف (على سبيل المثال ، إذا كان المستوى الأساسي للتألق منخفضا جدا - <5٪ من النطاق الديناميكي للكاميرا مع وقت تعريض أكبر من 400 مللي ثانية) ، فقم بزيادة وقت التحميل إلى ما يصل إلى 45 دقيقة إلى 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. بدلا من ذلك ، امزج محلول مخزون Fluo-4 AM بحجم متساو من 20٪ (وزن / حجم) منظف (Pluronic) في DMSO قبل التخفيف في ECS ، مما يجعل تركيز Pluronic النهائي ~ 0.02٪.
      ملاحظة: تم إجراء الأمثلة التجريبية لهذه الدراسة باستخدام IgG البشري المعزول من الأمصال الدموية لمرضى ALS كما هو موضح سابقا4،5،11. تم إجراء كل تجربة مع عينات IgG لمريض واحد.
  2. تصوير الفيديو
    ملاحظة: في هذا البروتوكول ، تم دمج نظام التصوير بالفيديو مع مصباح قوس قصير زينون ، ونظام متعدد الألوان ، ومجهر فوق مضان مقلوب مجهز بالماء والجلسرين وهدف الغمر بالزيت. تم إجراء التصوير بفاصل زمني باستخدام نظام الكاميرا الرقمية.
    1. قم بتشغيل مكونات إعداد التصوير قبل 15 دقيقة من التجربة للسماح للنظام بالوصول إلى درجة حرارة العمل.
    2. ضع غطاء الغطاء في غرفة التسجيل مع 1 مل من محلول العمل (ECS أو ECS بدون Ca2+).
    3. لاختيار بروتوكول التصوير الصحيح ، افتح برنامج التصوير وفي لوحة الاستحواذ ، اختر أزواج المرشح ل Fluo4-AM بطول موجة إثارة عند 480 نانومتر ، ومرآة ثنائية اللون عند 505 نانومتر ، وطول موجة انبعاث عند 535 نانومتر.
    4. اختر مجال الرؤية مع الحرص على الحصول على عدد ثابت من الخلايا طوال التجربة. اضبط وقت التعرض وكسب الكاشف بشكل مناسب ، بحيث لا تكون الإشارة مشبعة. اختر وضع اللون الزائف للاكتساب. للحصول على إرشادات أكثر تفصيلا ، راجع الدليل المقدم من الشركة المصنعة.
    5. اضبط معدل أخذ العينات على 1 هرتز (إطار واحد في الثانية).
    6. ابدأ التصوير بالحصول على المستوى الأساسي للتألق لمدة 3-5 دقائق لتحديد خط الأساس (F0). ضمان التدفق المستمر لحل العمل.
    7. أوقف تدفق حل العمل وانتقل إلى حل الاختبار للمدة الزمنية المطلوبة (انظر أيضا أشرطة الوقت في أمثلة الشكل 2 والشكل 3). بين كل محلول اختبار ، اغسل الخلايا بتدفق مستمر من محلول العمل لمدة 3-5 دقائق.
    8. حافظ على حجم المحلول في غرفة التسجيل عند ~ 1 مل عن طريق ترتيب شفط مستمر من أعلى المحلول (انظر الشكل 2E).
      ملاحظة: لتطبيق العلاج مباشرة على الخلايا المصورة ، تم وضع نظام توصيل مخصص مصنوع من ماصة زجاجية (قطر داخلي 0.8 مم) ~ 350 ميكرومتر و ~ 1 مم فوق الخلايا ، بزاوية 45 درجة جنبا إلى جنب مع نظام تبادل المحلول الذي يحتوي على صمامات قرصة ووحدة تحكم إلكترونية في الصمام (انظر الشكل 2E).

4. تحليل البيانات

  1. حدد منطقة الاهتمام (ROI) التي تتوافق مع الخلية الفردية.
    1. اختر الإطار ذو أعلى كثافة إشارة (أي من تطبيق ATP) وقم بتطويق خلية واحدة باستخدام تطبيق الأداة المضلعة. كرر لجميع الخلايا في الحقل المكتسب. اختر خمسة عائد استثمار في الخلفية باستخدام أداة الدائرة.
    2. لقياس متوسط شدة الإشارة لخلية واحدة والخلفية لكل إطار زمني، حدد جميع عائد الاستثمار واستخدم الأمر Multi Measure في ROI Manager في ImageJ أو أي أمر مكافئ في البرامج التجارية (راجع جدول المواد).
  2. قم بتصدير متوسط قيم كثافة الإشارة لعائد الاستثمار كجدول بيانات.
  3. متوسط خمسة عائد استثمار في الخلفية وطرح متوسط الخلفية لكل إطار من متوسط كثافة عائد الاستثمار للإطار المكتسب في نفس الوقت.
  4. لتطبيع البيانات التي تم الحصول عليها مع إشارة خط الأساس ، استخدم المعادلة (1):
    ΔF / F 0 = (F - F 0) / F0 (1)
    حيث F هي شدة الإشارة لكل إطار زمني بعد طرح الخلفية ، و F0 هي مضان Fluo-4 الأساسي.
    ملاحظة: تم استخدام رمز مخصص في هذه الدراسة.
  5. لتحليل نشاط الكالسيوم ، حدد عدة معلمات4: سعة ذروة الكالسيوم (ΔF / F 0) ، التغيير المتكامل (تكامل الوقت ، السطح تحت تسجيل الاستجابة) لعابر الكالسيوم (ΔF / F 0 × s) ، الوقت المنقضي من وقت الذروة إلى بداية التحفيز إلى الحد الأقصى من الكالسيوم العابر (ق) ، ارتفاع الوقت المنقضي من بداية التحفيز إلى قيمة ΔF / F 0 التي تصل إلى 50٪ -80٪ من السعة القصوى (s) ، والعرض نصف العرض الكامل للعابر عند نصف السعة القصوى (s) ، وتكرار الاستجابات إذا كانت متكررة (هرتز).

النتائج

توصيف أنواع الخلايا الدبقية المختلفة في الثقافة
عادة ما يستغرق إنتاج الخلايا النجمية للتجارب من 15 إلى 21 يوما ، بينما تستغرق الخلايا الدبقية الصغيرة من 10 إلى 15 يوما لتنمو. تم إجراء التلوين المناعي لتقييم نقاء الخلايا في الثقافة. يوضح الشكل 1 التعبير عن وضع العلام?...

Discussion

يقدم هذا البحث طريقة زراعة الخلايا الأولية كأداة سريعة و "على الميزانية" لدراسة الجوانب المختلفة لفسيولوجيا الخلية (المرضية) مثل ALS في نموذج الفئران hSOD1G93A . وبالتالي فإن هذه التقنية مناسبة للدراسات على مستوى الخلية الواحدة التي يمكن استقرائها والتحقيق فيها بشكل أكبر على مستوى أعلى م?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح يعلنونه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل وزارة التعليم والعلوم والتنمية التكنولوجية في جمهورية صربيا رقم العقد رقم 451-03-9 / 2021-14 / 200178 ، ومشروع مجموعة التعليم والتدريب FENS - NENS "الدورة الثلاثية حول الخلايا الدبقية في الالتهاب العصبي" ، ومنحة EC H2020 MSCA RISE #778405. نشكر ماريا أدزيتش ومينا بيريتش على تزويدهما بصور الكيمياء الهيستولوجية المناعية ودانييلا باتافيليتش للمساعدة في الكتابة الورقية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL tubeSarstedt, Germany62 554 502
2 mL tubeSarstedt, Germany72.691
21 G needleNipro, JapanHN-2138-ET
23 G needleNipro, JapanHN-2338-ET
5 mL syringeNipro, JapanSY3-5SC-EC
6 mm circular glass coverslipMenzel Glasser, Germany630-2113
60 mm Petri dishThermoFisher Sientific, USA130181
ATPSigma-Aldrich, GermanyA9062
AxioObserver A1Carl Zeiss, Germany
Bovine serum albumineSigma-Aldrich, GermanyB6917
Calcium chlorideSigma-Aldrich, Germany2110
CentrifugeEppendorf, Germany
DAPISigma-Aldrich, Germany10236276001
D-glucoseSigma-Aldrich, Germany158968
DMEMSigma-Aldrich, GermanyD5648
Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibodyInvitrogen, USAA-21447
Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibodyInvitrogen, USAA-21202
EDTASigma-Aldrich, GermanyEDS-100G
EGTASigma-Aldrich, GermanyE4378
”evolve”-EM 512 Digital Camera SystemPhotometrics, USA
Fetal bovine serum (FBS)Gibco, ThermoFisher Scientific, USA10500064
Fiji ImageJ SoftwareOpen source under the GNU General Public Licence
FITC filter setChroma Technology Inc., USA
Fluo-4 AMMolecular Probes, USAF14201
Goat anti-Iba1Fujifilm Wako Chemicals, USA011-27991
HEPESBiowest, FranceP5455
HighSpeed Solution Exchange SystemALA Scientific Instruments, USA
IncubatorMemmert GmbH + Co. KG, Germany
Magnesium chlorideSigma-Aldrich, GermanyM2393
Matlab softwareMath Works, USA
Mouse anti-GFAPMerck Millipore, USAMAB360
Mowiol 40-88Sigma-Aldrich, Germany324590
Normal donkey serumSigma-Aldrich, GermanyD9663
ParaformaldehydeSigma-Aldrich, Germany158127
Penicilin and StreptomycinThermoFisher Sientific, USA15140122
Poly-L-lysineSigma-Aldrich, GermanyP5899
Potassium chlorideSigma-Aldrich, GermanyP5405
Potassium dihydrogen phosphateCarlo Erba Reagents, Spain471686
Shaker DELFIA PlateShakePerkinElmer Life Sciencies, USA
Sodium bicarbonateSigma-Aldrich, GermanyS3817
Sodium chlorideSigma-Aldrich, GermanyS5886
Sodium phosphate dibasic heptahydrateCarl ROTH GmbHX987.2
Sodium pyruvateSigma-Aldrich, GermanyP5280
ThapsigargineTocris Bioscience, UK1138
Triton X - 100Sigma-Aldrich, GermanyT8787
TrypsinSigma-Aldrich, GermanyT4799
Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520Wescor, ELITechGroup Inc., USA
ViiFluor Imaging SystemVisitron System Gmbh, Germany
VisiChrome Polychromator SystemVisitron System Gmbh, Germany
VisiView high performance setupVisitron System Gmbh, Germany
Xenon Short Arc lampUshio, Japan

References

  1. Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
  2. Taylor, J. P., Brown, R. H. J., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
  3. Gleichman, A. J., Carmichael, S. T. Glia in neurodegeneration: Drivers of disease or along for the ride. Neurobiology of Disease. 142, 104957 (2022).
  4. Zhang, R., et al. Evidence for systemic immune system alterations in sporadic amyotrophic lateral sclerosis (sALS). Journal of Neuroimmunology. 159 (1-2), 215-224 (2005).
  5. Saleh, I. A., et al. Evaluation of humoral immune response in adaptive immunity in ALS patients during disease progression. Journal of Neuroimmunology. 215 (1-2), 6 (2009).
  6. Wang, M., et al. Evaluation of Peripheral Immune Activation in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Frontiers in Neurology. 12, 628710 (2021).
  7. Li, J. -. Y., et al. Blood-brain barrier dysfunction and myelin basic protein in survival of amyotrophic lateral sclerosis with or without frontotemporal dementia. Neurological Sciences. 43 (5), 3201-3210 (2022).
  8. Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis affects cytosolic Ca2+ homeostasis in cultured rat astrocytes. Cell Calcium. 54 (1), 17-25 (2013).
  9. Andjus, P. R., Stevic-Marinkovic, Z., Cherubini, E. Immunoglobulins from motoneurone disease patients enhance glutamate release from rat hippocampal neurones in culture. Journal of Physiology. 504, 103-112 (1997).
  10. Howland, D. S., et al. Focal loss of the glutamate transporter EAAT2 in a transgenic rat model of SOD1 mutant-mediated amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (3), 1604-1609 (2002).
  11. Dučić, T., Stamenković, S., Lai, B., Andjus, P., Lučić, V. Multimodal synchrotron radiation microscopy of intact astrocytes from the hSOD1 G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Analytical Chemistry. 91 (2), 1460-1471 (2019).
  12. Popović-Bijelić, A., et al. Iron-sulfur cluster damage by the superoxide radical in neural tissues of the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 96, 313-322 (2016).
  13. Stamenković, S., et al. In vivo EPR pharmacokinetic evaluation of the redox status and the blood brain barrier permeability in the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 108, 258-269 (2017).
  14. Stamenković, S., Dučić, T., Stamenković, V., Kranz, A., Andjus, P. R. Imaging of glial cell morphology, SOD1 distribution and elemental composition in the brainstem and hippocampus of the ALS hSOD1(G93A) rat. Neuroscience. 357, 37-55 (2017).
  15. Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from sera of amyotrophic lateral sclerosis patients induce oxidative stress and upregulation of antioxidative system in BV-2 microglial cell line. Frontiers in Immunology. 8, 1619 (2017).
  16. Boillée, S., Cleveland, D. W. Revisiting oxidative damage in ALS: microglia, Nox, and mutant SOD1. Journal of Clinical Investigation. 118 (2), 474-478 (2008).
  17. Boillée, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
  18. Martínez-Palma, L., et al. Mitochondrial modulation by dichloroacetate reduces toxicity of aberrant glial cells and gliosis in the SOD1G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Journal of American Society for Experimental Neurotherapeutics. 16 (1), 203-215 (2019).
  19. Díaz-Amarilla, P., et al. Phenotypically aberrant astrocytes that promote motoneuron damage in a model of inherited amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), 18126-18131 (2011).
  20. Barbosa, M., et al. Recovery of depleted miR-146a in ALS cortical astrocytes reverts cell aberrancies and prevents paracrine pathogenicity on microglia and motor neurons. Frontiers in Cell Developmental Biology. 9, 634355 (2021).
  21. Gomes, C., et al. Astrocyte regional diversity in ALS includes distinct aberrant phenotypes with common and causal pathological processes. Experimental Cell Research. 395 (2), 112209 (2020).
  22. Kovacs, M., et al. CD34 identifies a subset of proliferating microglial cells associated with degenerating motor neurons in ALS. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 3880 (2019).
  23. Komiya, H., et al. Ablation of interleukin-19 improves motor function in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Molecular Brain. 14 (1), 1-13 (2021).
  24. Trias, E., et al. Emergence of microglia bearing senescence markers during paralysis progression in a rat model of inherited ALS. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 1-14 (2019).
  25. Pullen, A. H., Demestre, M., Howard, R. S., Orrell, R. W. Passive transfer of purified IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis to mice results in degeneration of motor neurons accompanied by Ca2+ enhancement. Acta Neuropatholgica. 107 (1), 35-46 (2004).
  26. Obál, I., et al. Intraperitoneally administered IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis or from an immune-mediated goat model increase the levels of TNF-α, IL-10 in the spinal cord and serum of mice. Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 121 (2016).
  27. Obál, I., et al. Experimental motor neuron disease induced in mice with long-term repeated intraperitoneal injections of serum from ALS patients. International Journal of Molecular Sciences. 20 (10), 2573 (2019).
  28. Mohamed, H. A., et al. Immunoglobulin Fc gamma receptor promotes immunoglobulin uptake, immunoglobulin-mediated calcium increase, and neurotransmitter release in motor neurons. Journal of Neuroscience Research. 69 (1), 110-116 (2002).
  29. Engelhardt, J. I., Siklos, L., Appel, S. H. Altered calcium homeostasis and ultrastructure in motoneurons of mice caused by passively transferred anti-motoneuronal IgG. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 56 (1), 21-39 (1997).
  30. Pagani, M. R., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Calcium signaling pathways mediating synaptic potentiation triggered by amyotrophic lateral sclerosis IgG in motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2661-2672 (2006).
  31. Carter, J. R., Mynlieff, M. Amyotrophic lateral sclerosis patient IgG alters voltage dependence of Ca2+ channels in dissociated rat motoneurons. Neuroscience Letters. 353 (3), 221-225 (2003).
  32. Fratantoni, S. A., Weisz, G., Pardal, A. M., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Amyotrophic lateral sclerosis IgG-treated neuromuscular junctions develop sensitivity to L-type calcium channel blocker. Muscle & Nerve. 23 (4), 543-550 (2000).
  33. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
  34. Vay, S. U., et al. The impact of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) and voltage-gated potassium KCNQ/Kv7 channels on primary microglia function. Journl of Neuroinflammation. 17 (1), 100 (2020).
  35. Bijelić, D. D., et al. Central nervous system-infiltrated immune cells induce calcium increase in astrocytes via astroglial purinergic signaling. Journal of Neuroscience Research. 98 (11), 2317-2332 (2020).
  36. Kawamata, H., et al. Abnormal intracellular calcium signaling and SNARE-dependent exocytosis contributes to SOD1G93A astrocyte-mediated toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2331-2348 (2014).
  37. Nims, R. W., Price, P. J. Best practices for detecting and mitigating the risk of cell culture contaminants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 53 (10), 872-879 (2017).
  38. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
  39. Adzic, M., et al. Extracellular ATP induces graded reactive response of astrocytes and strengthens their antioxidative defense in vitro. Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1053-1066 (2017).
  40. Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 198 (2020).
  41. Butovsky, O., et al. Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia. Nature Neuroscince. 17 (1), 131-143 (2014).
  42. Vankriekelsvenne, E., et al. Transmembrane protein 119 is neither a specific nor a reliable marker for microglia. Glia. 70 (6), 1170-1190 (2022).
  43. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved