쥐 성상 세포와 미세 아교 세포의 1 차 배양과 근 위축성 측삭 경화증 연구에서의 사용

요약

우리는 hSOD1^G93A 쥐 모델에서 근 위축성 측삭 경화증의 병태 생리학에 대한 연구를 위해 세포 내^{Ca 2+}의 타임 랩스 비디오 이미징을 위해 쥐 피질에서 신경교 세포, 성상 세포 및 미세 아교 세포의 1 차 배양을 준비하는 방법에 대한 프로토콜을 제시합니다.

초록

이 프로토콜은 Sprague Dawley 쥐의 피질에서 신경교 세포, 성상 세포 및 미세 아교 세포의 1 차 배양을 준비하는 방법과 쥐 hSOD1^G93A 모델에서 근 위축성 측삭 경화증 (ALS)의 병태 생리학을 연구 할 목적으로 이러한 세포를 사용하는 방법을 보여줍니다. 먼저, 프로토콜은 출생 후 쥐 피질에서 성상 세포와 미세 아교 세포를 분리 및 배양하는 방법을 보여 주며, 성상 세포의 신경교 섬유 산성 단백질 (GFAP) 마커와 이온화 칼슘 결합 어댑터 분자 1 (Iba1) 소교 세포 마커를 사용하여 면역 세포 화학에 의해 이러한 배양의 순도를 특성화하고 테스트하는 방법을 보여줍니다. 다음 단계에서는 배양 된 세포의 염료 로딩 (칼슘 민감성 Fluo 4-AM) 및 살아있는 세포에 대한 비디오 이미징 실험에서 Ca²⁺ 변화의 기록에 대한 방법을 설명합니다.

비디오 녹화의 예는 다음으로 구성됩니다 : (1) ALS 환자로부터 분리 된 면역 글로불린 G (IgG)에 급성으로 노출 된 배양 된 성상 세포의^{Ca 2+} 이미징 사례는 동일한 실험에서 입증 된 바와 같이 ATP에 대한 반응과 비교하여 특징적이고 특이적인 반응을 나타낸다. 예는 또한 비 형질 전환 대조군과 비교하여 hSOD1^G93A 성상 세포에서 ALS IgG에 의해 유발되는 세포 내 칼슘 농도의 더 뚜렷한 일시적인 상승을 보여줍니다. (2) 소포체^Ca2+ ATPase의 비경쟁적 억제제인 타프시가르긴(Thg)에 의한 칼슘 저장고갈 동안 배양된 성상세포의^Ca2+ 이미징, 이어서 기록 용액에 칼슘을 첨가하여 유도된 저장 작동식 칼슘 진입, 이는 hSOD1^G93A 및 비-형질전환 성상세포에서의^{Ca 2+} 저장 작업 간의 차이를 입증함; (3) 배양된 미세아교세포의 Ca2+ 영상화는 주로 ALS IgG에 대한 반응의 결여를 나타내는 반면, ATP 적용은^Ca2+ 변화를 유도하였다. 이 논문은 또한 Ca²⁺ 염료 및 염료 로딩 기술의 올바른 농도를 선택하여 중요한 세포 밀도 및 배양 순도와 관련하여 가능한 주의 사항 및 주의 사항을 강조합니다.

서문

세포 배양 기술은 건강 및 질병 분야의 다양한 세포 신경 생리학 분야에서 수많은 발전을 가져 왔습니다. 특히, 실험실 동물의 신경 조직에서 갓 분리 된 1 차 세포 배양을 통해 실험자는 다양한 생화학 적 배지 및 생리 학적 설정에서 다양한 세포의 행동을 면밀히 연구 할 수 있습니다. Ca²⁺ 민감성 염료와 같은 다양한 형광 생리학적 지표를 타임랩스 비디오 현미경과 함께 사용하면 실시간으로 세포 생물물리학 및 생화학적 과정에 대한 더 나은 통찰력을 얻을 수 있습니다.

ALS는 상부 및 하부 운동 뉴런에 영향을 미치는 치명적인 신경 퇴행성 질환입니다¹. 이 질병은 가족 유형의 복잡한 발병 기전을 가지고 있지만 대부분 산발적 인 형태 (사례의 90 %)^2. 비세포 자율 메커니즘이 ALS 병태생리학에 기여한다는 것은 잘 알려져 있으며, 이는 주로 신경^{교 세포의 필수적인} 역할 때문입니다3. ALS는 또한 염증의 체액 성 및 세포 성 요인의 침범과 함께 신경 염증성 질환으로 잘 특성화됩니다.

면역 글로불린 G는 ALS 및 기타 신경 퇴행성 질환에서 분자 마커로 널리 사용됩니다. 이 마커의 혈청 수준을 연구하면 질병 ^4,5,6에서 신경 염증의 존재와 단계를 나타낼 수 있지만 뇌척수액에 존재하면 혈액 뇌 장벽⁷의 위반을 나타낼 수 있습니다. IgGs는 또한 ALS 환자⁷의 척수 운동 뉴런에서 침착 된 것으로 확인되었습니다. 그럼에도 불구하고,이 접근법은 IgGs 수준과 질병의 단계 및 특성의 상관 관계에서 약간의 불일치를 보여 주었다⁶.

ALS 환자의 혈청에서 분리 된 IgG (ALS IgG)는 나이브 성상 세포⁸에서 칼슘 반응을 유도하고 뉴런에서 글루타메이트 방출을 유도 할 수 있으며, 이는 ALS 병리학⁹의 특징 인 흥분 독성 효과를 가리킨다. 그러나, hSOD1^G93A ALS 래트 모델 (인간 SOD1 돌연변이 10의 다중 카피 함유)에 대한 연구는 배양된 신경교세포 11, 조직 12,13,14^, 또는 살아있는 동물¹³에서 산화 스트레스의 다수의 마커를 보여주었다. ALS 래트 모델로부터 배양된 성상교세포가 비-형질전환 동료로부터의 성상아교세포보다 과산화물에 의해 유도된 산화 스트레스에 더 취약하다는 것은 주목할 만^하다1.

배양 물의 소교 세포는 덜 명백한 방식으로 ALS IgG의 영향을받습니다. 즉, BV-2 소교세포 세포주는 단지 4/11 ALS IgG 환자 샘플¹⁵의 적용에 반응하여 산화 스트레스의 형광 마커로부터의 신호의 상승을 나타냈다. 미세아교세포는 많은 신경염증성 병리에 참여하여 ALS^16,17의 비세포 자율 메커니즘에서 산화 스트레스와 후기 진행 단계를 추가하는 것으로 잘 알려져 있습니다. 그럼에도 불구하고, ALS IgGs를 사용한 데이터는 이들 세포가 ALS 염증의 이러한 체액성 인자에 대해 성상세포만큼 반응적이지 않을 수 있음을 나타내었다. ALS 쥐 모델의 1 차 성상 세포에 대한 여러 연구가 새끼뿐만 아니라 증상이있는 동물, 뇌 또는 척수^18,19,20,21에서 수행되었습니다. 이것은 소교 세포 1 차 배양에도 해당되지만, 성상 세포보다 적고 대부분 배아 단계^22,23,24의 뇌 영역에서 발생합니다.

우리는 주로 흥분 독성의 생리적 마커로서이 이온의 세포 내 과도 현상을 따르는 수단으로 배양 된 세포에 대한^Ca2+의 타임 랩스 비디오 이미징을 사용합니다. 따라서 이러한 과도 현상 (진폭, 과도 상태에서의 영역, 상승 시간, 주파수)의 생물 물리학 적 특성화를 통해 연구원은 신경 퇴행의 다양한 세포 모델에서 실험적 진단 매개 변수를 얻을 수 있습니다. 따라서이 기술은 질병 바이오 마커로서 IgGs의 정량적 생리 학적 평가의 이점을 제공합니다. ALS의 유도에서 IgGs 및^Ca2+의 역할에 관한 많은 문헌이 있다. 이들 연구의 대부분은 환자 IgG를 실험 동물^{25,26,27,28,29}에 주입하여 ALS를 유도함으로써 수행되었으며^, 이어서 세포 내^Ca2+ 상승 및 IgG 침착을 나타내었다. 일련의 연구는 시험관 내 운동 시냅스에 대한 ALS IgG의 효과를 조사했습니다. ^30,31,32. 위의 맥락에서 여기에 제시된 기술은 ALS의 비 세포 자율 메커니즘에서 중요한 역할을하는 신경교 세포에 초점을 맞추고 신경 염증의 체액 성 요인으로서 IgG에 대한 잠재적 인 흥분 독성 반응을 정량화합니다. 이 접근법은 다른 세포 배양 시스템 및 일반적인 염증의 세포 모델에서 전체 혈청, CSF 또는 사이토 카인과 같은 다른 체액 성 인자를 테스트하는 데 더 광범위하게 적용될 수 있습니다.

이 논문은 Sprague Dawley 쥐의 피질에서 신경교 세포, 성상 세포 및 미세 아교 세포의 1 차 배양을 준비하는 방법과 이러한 세포를 추가로 사용하여 환자 혈청 유래 IgG로 ALS 병태 생리학을 연구하는 방법을 설명합니다. 프로토콜은 배양된 세포의 염료 로딩(그림 1) 및 타임랩스 비디오 이미징 실험에서 Ca²⁺ 변화의 기록에 대해 자세히 설명되어 있습니다. 비디오 녹화의 예는 신경교 세포가 ATP와 비교하여 ALS IgG에 어떻게 반응하는지 보여줄 것이며, 후자는 퓨린성 막 수용체를 활성화합니다. hSOD1^G93A ALS 래트 뇌로부터 분리된 성상세포가 비-형질전환 대조군과 비교하여 ALS IgG에 대해 더 뚜렷한^{Ca 2} + 반응과 어떻게 반응하는지, 그리고 이 과정을^Ca2+ 저장 작업의 차이와 연관시키는 방법에 대한 예가 처음으로 도시되었다. 또한 ALS IgG로 심각하게 도전받는 소교 세포에서 칼슘 이미징의 예가 나와 있으며 세포 내 칼슘의 반응은 미미합니다.

프로토콜

모든 실험은 과학적 목적을위한 동물 보호에 관한 EU 지침과 베오그라드 대학교 생물학 학부 윤리위원회 (승인 번호 EK-BF-2016 / 08)의 허가를 받아 수행되었습니다. 환자 물질 (IgGs에 대한 혈청)에 관해서는 인간을 대상으로 한 실험을 위해 세계 의학 협회 윤리 강령 (헬싱키 선언)에 따라 정보에 입각 한 환자의 동의하에 일상적인 임상 검사를 위해 수집되었습니다. 이 프로토콜은 세르비아 임상 센터의 윤리위원회에서 승인되었습니다 (No. 850/6).

1. 1차 세포 배양 제제

1. 뇌 조직 분리
   알림: 얼음처럼 차가운 용액을 사용하여 얼음 위에서 격리를 수행해야 합니다.
   1. 1차 신생아 세포 배양을 위해 1-3일령의 신생아 새끼를 사용하십시오³³.
      참고: 여기에 제시된 연구를 위해, Sprague Dawley hSOD1^G93A 및 비-형질전환 쥐가 사용되었다. 유전형 분석을 위해, 쥐 꼬리는 나중에 DNA 추출 및 PCR에 사용되었다.
   2. 강아지의 머리에 70 % 에탄올을 뿌리고 즉시 가위를 사용하여 빠르게 참수하십시오.
   3. 두개골을 노출시키기 위해 작은 각도의 가위로 피부를 자릅니다. 구멍 매그넘 에서 궤도쪽으로 절단하여 두개골을 엽니 다. 다음으로 수직 정중선 절단을하십시오. 두개골에서 뇌를 제거하고 인산염 완충 식염수 (PBS)가 들어있는 페트리 접시에 넣으십시오.
      알림: 형질 전환 새끼와 비 형질 전환 강아지 사이의 교차 오염을 방지하기 위해 강아지 사이의 도구를 청소하십시오. 뇌의 나머지 부분에서 피질을 분리하는 것은 실체 현미경으로 수행해야합니다.
   4. 집게의 끝을 사용하여 두 반구 사이의 연결을 찢습니다. 그런 다음 반구를 중앙에서 옆으로 부드럽게 밀어 구부러진 집게로 반구를 분리합니다.
   5. 수막을 직선 및 곡선 집게로 조심스럽게 찢어 제거하십시오.
   6. 구부러진 집게로 꼬집어 해마를 제거하십시오. 해마를 폐기하거나 다른 세포 배양 준비에 사용하십시오.
      알림: 멸균 상태를 보장하기 위해 층류 후드 아래에서 추가 단계를 수행해야 합니다.
2. 조직 균질화 및 해리
   1. 하나의 피질을 3mL의 차가운 PBS로 채워진 15mL 튜브로 옮깁니다. 1mL 팁으로 현탁액을 위아래로 피펫팅하여 현탁액이 균질해질 때까지 10-15회 스트로크를 완료합니다.
      알림: 이 과정에서 기포가 발생하지 않도록 매우 주의하십시오.
   2. 500 ×g에서 5 분 동안 원 심 분리합니다. 상청액을 제거하고 1mL 팁으로 위아래로 피펫팅하여 3mL의 차가운 PBS에 펠릿을 재현탁합니다. 원심분리 단계를 반복합니다.
      알림: 이 시점에서 사용된 모든 용액은 37°C로 예열해야 합니다.
   3. 상청액을 버리고 10% 소 태아 혈청(FBS)과 항생제(페니실린 및 스트렙토마이신)가 보충된 완전한 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM) 2mL에 펠릿을 재현탁합니다. 균질액을 2mL 튜브로 옮깁니다.
   4. 균질 액을 21G 및 23G 바늘 (각각 3 회)에 통과시켜 단일 세포의 현탁액을 만듭니다.
      알림: 이 과정에서 기포가 발생하지 않도록 매우 주의하십시오.
3. 하나의 피질에서 준비된 세포 현탁액을 60mL의 완전한 DMEM이 들어있는 직경 3mm의 페트리 접시 또는 T25 플라스크 (부착 세포의 성장을 위해 폴리펩티드 코팅으로 전처리 된 표면)에 붓습니다. 현탁액이 균일하게 분포되도록 페트리 접시를 가볍게 흔든다.
4. 37°C에서 5%_CO2/95% 공기의 가습된 분위기에서 배양기에서 세포를 성장시킨다.
5. 분리 후 48시간 후에 배지를 교체하고 3일마다 배지를 교체하십시오.
6. 성상 세포 성장을 촉진하려면 세포가 70 % -80 % 컨플루언시에 도달하면 예열 된 PBS로 씻어 느슨하게 부착 된 신경교 세포와 배지에서 FBS의 흔적을 제거합니다.
   1. 예열 된 트립신 용액 1mL (0.25 % 트립신, PBS에서 0.02 % EDTA, 멸균 여과)를 추가하여 성상 세포의 밑에있는 층을 트립신 화합니다.
   2. 접시를 37 ° C의 인큐베이터에 2-5 분 동안 놓습니다.
   3. 현미경으로 세포를 확인하십시오. 분리되기 시작하면 4mL의 완전한 DMEM을 추가합니다.
   4. 세포 현탁액을 수집하여 15mL 튜브로 옮깁니다. 500 ×g에서 5 분 동안 원 심 분리합니다.
   5. 상청액을 버리고 펠릿을 완전한 배지 1mL에 재현탁합니다. 혈구계를 사용하여 세포를 세십시오.
   6. 세포를 5mL의 새로운 완전한 DMEM에서 10⁴ cells/^cm2 의 밀도로 재플레이트합니다.
7. 3 일마다 매체를 교체하십시오. 다른 신경교 세포 유형의 존재를 최소화하려면 성상 세포가 50 % 합류에 도달 한 후 각 배지를 교체하기 전에 완전한 DMEM으로 세포를 세척하십시오.
   1. 1mL 피펫으로 상청액 배지를 흡인하고 세포 층에 여러 번 부드럽게 분배합니다. 이 세척 단계에서 세포층의 전체 표면이 덮여 있는지 확인하십시오.
8. 세포가 80 % 합류 (보통 14 일 후)에 도달하면 1.6 단계에서 설명한대로 트립신 화 및 성상 세포 수집을 반복합니다.
9. 폴리 -L- 라이신 (50 μg / mL)으로 코팅 된 7mm 원형 유리 커버 슬립에 성상 세포 5 × 10³ 을 시드합니다. 48 시간 후에 실험에 사용하십시오.
10. 미세아교세포를 촉진시키기 위해, 단계 1.7 후에, 신경교세포가 합류층(³⁴)에 도달하도록 한다. 소교 세포가 성상 세포 층 위에 나타날 때 (10-15 일 후, 더 작고 타원형의 몸체와 더 짧은 과정으로 인식됨) 궤도 셰이커에서 페트리 접시를 220rpm에서 2 시간 동안 흔 듭니다.
11. 소교세포 분산 및 파종
    1. 1mL 피펫 팁으로 상층액을 흡인하여 분리되고 느슨하게 부착된 세포를 가볍게 씻고 세포층에 여러 번 부드럽게 분주합니다. 이 세척 단계에서 세포층의 전체 표면을 덮고 분리된 세포로 배지를 수집하여 15mL 튜브로 옮깁니다.
    2. 500 ×g에서 5 분 동안 원 심 분리합니다. 상청액을 버리고 펠릿을 1mL의 배지에 재현탁합니다.
    3. 세포 현탁액을 21 G 바늘에 통과시켜 단일 세포 현탁액을 수득한다.
       참고: 대부분의 발표된 방법은 트립신 또는 파파인을 사용하여 조직을 해리합니다. 그러나 21G 바늘은 세포의 과소화를 방지하여 더 부드러운 해리를 허용하는 장점이 있습니다.
    4. 혈구계를 사용하여 세포를 세십시오. poly-L-라이신(50μg/mL)으로 코팅된 7mm 원형 유리 커버슬립에 5 × 10³ 개의 소교세포를 시드합니다. 48 시간 후에 실험에 사용하십시오.
       참고: 희소돌기아교세포 전구체 세포와 성상세포가 실험자의 경험에 따라 여전히 다양한 수로 존재할 수 있기 때문에 흔들어서 순수한 미세아교세포 배양을 얻는 것은 어렵습니다. 신경교 배양물에서 상이한 세포 집단의 존재를 추정하기 위해 사용된 면역세포화학 프로토콜은 다른 곳에서 기술되었다³⁵.

2. 면역세포화학

1. 커버슬립에 도말된 셀을 PBS로 2 x 1분 동안 헹굽니다.
2. 실온(RT)에서 20분 동안 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정합니다.
3. PBS에서 3 x 5 분 동안 세척하십시오.
4. RT에서 10 분 동안 10 % 정상 당나귀 혈청 (NDS) / 1 % 소 혈청 알부민 (BSA) / 0.1 % Triton X-100을 함유 한 차단 용액에서 45 분 동안 배양하십시오.
   1. 10mm 직경의 커버슬립당 50μL의 블로킹 용액을 추가합니다.
5. 1차 항체를 1% NDS/1% BSA/0.1% TritonX-100으로 다음 희석하여 준비합니다: 마우스 항-GFAP 1:300, 염소 항-Iba1 1:500. 세포를 1차 항체와 함께 +4°C에서 밤새 배양합니다.
6. PBS로 3 x 10분 동안 헹굽니다.
7. 형광단과 접합된 2차 항체와 함께 인큐베이션한다: 당나귀 항-마우스 (여기 488 nm[1:200)) 또는 당나귀 항-염소 (647 nm[1:200)에서 여기). 어둠 속에서 RT에서 2 시간 동안 세포를 배양하십시오.
8. PBS에서 7 x 5 분 동안 세척하십시오.
9. 세포를 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, 1:4,000)과 함께 RT에서 10분 동안 배양합니다.
10. PBS에서 5 x 5 분 동안 세척하십시오.
11. 장착 솔루션을 사용하여 현미경 슬라이드에 커버 슬립을 장착합니다. 커버 슬립 당 한 방울을 사용하십시오.
    참고: 항체 희석액은 생산자에 따라 다를 수 있습니다. 사용자는 실험을 위한 최적의 희석액을 결정해야 합니다.

3. 타임랩스 비디오 이미징

알림: 형광 염료가 포함 된 용액은 직사광선으로부터 보호해야합니다. 이미징 실험을 시작하기 전에 관류를 켤 때 유리 커버 슬립이 움직이지 않는지 확인하십시오.

1. 용액 및 세포의 준비
   1. 이미징을 위한 세포외 용액(ECS)을 준비합니다: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCal2, 2 mM_MgCl2, 10 mM D-글루코_{스, 및} 10 mM 헤페스. pH를 7.4로 조정하십시오. 삼투압이 280-300 mOsm / kg인지 확인하고 Ca없이 ECS를 준비하십시오 2⁺ : 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 10 mM D- 포도당, 10 mM hepes 및 0.1 mM EGTA.
   2. 시험 용액을 준비하십시오 : ECS에 용해 된 100 μM ATP, Ca가없는 ECS에서 1 μM Thg 2⁺, ECS⁸에서 0.1 mg / mL ALS IgG.
   3. 커버슬립 하나를 ECS가 있는 접시에 옮겨 전체 DMEM을 씻어냅니다. 1 mM Fluo-4 AM 원액을 ECS로 희석하여 최종 농도인 5 μM Fluo-4AM이 되도록 염료 로딩 용액을 제조한다.
      1. 어두운 곳에서 RT에서 30분 동안 염료 로딩 용액에 셀이 있는 커버슬립을 놓습니다. ECS에서 세포를 20 분 동안 씻으십시오.
   4. 세포가 적절하게 로딩되지 않은 경우(즉, 기본 형광 수준이 노출 시간이 400ms 이상인 카메라 다이내믹 레인지의 5%<너무 낮은 경우) 로딩 시간을 37°C에서 최대 45분에서 1시간으로 늘립니다. 또는 ECS에서 희석하기 전에 DMSO에서 동일한 부피의 20%(w/v) 세제(플루로닉)와 Fluo-4 AM 스톡 용액을 혼합하여 최종 플루로닉 농도를 ~0.02%로 만듭니다.
      참고: 본 연구의 실험예는 앞서 기술한^바와 같이 ALS 환자의 혈청으로부터 분리된 인간 IgG 4,5,11로 수행하였다. 각 실험은 단일 환자의 IgG 샘플로 수행되었습니다.
2. 비디오 이미징
   참고: 이 프로토콜에서 비디오 이미징 시스템은 크세논 쇼트 아크 램프, 폴리크로메이터 시스템 및 물, 글리세린 및 오일 이멀젼 대물렌즈가 장착된 도립 에피형광 현미경과 결합되었습니다. 타임랩스 이미징은 디지털 카메라 시스템을 사용하여 수행되었습니다.
   1. 시스템이 작동 온도에 도달할 수 있도록 실험 15분 전에 이미징 설정의 구성 요소를 켭니다.
   2. 커버슬립을 1mL의 작업 용액(ECS 또는 Ca²⁺가 없는 ECS)과 함께 기록실에 놓습니다.
   3. 올바른 이미징 프로토콜을 선택하려면 이미징 소프트웨어를 열고 수집 패널에서 여기 파장이 480nm, 다이크로익 미러가 505nm, 방출 파장이 535nm인 Fluo4-AM의 필터 쌍을 선택합니다.
   4. 실험 전반에 걸쳐 일관된 수의 세포를 갖도록 주의하면서 시야를 선택합니다. 신호가 포화되지 않도록 노출 시간과 감지기 게인을 적절하게 조정하십시오. 획득을 위한 의사 색상 모드를 선택합니다. 자세한 지침은 제조업체에서 제공한 설명서를 참조하십시오.
   5. 샘플링 속도를 1Hz(초당 1프레임)로 조정합니다.
   6. 기준선 결정을 위해 3-5분 동안 기저 수준의 형광을 획득함으로써 이미징을 시작한다(_F0). 작업 솔루션의 일정한 흐름을 보장하십시오.
   7. 작업 용액의 흐름을 중지하고 원하는 시간 동안 테스트 용액으로 전환하십시오 (그림 2 및 그림 3의 예에서 시간 막대 참조). 각 시험 용액 사이에서 3-5 분 동안 작업 용액의 일정한 흐름으로 세포를 씻으십시오.
   8. 용액 상단에서 일정한 흡입을 배열하여 기록 챔버의 용액 부피를 ~1mL로 유지합니다( 그림 2E 참조).
      참고: 이미징된 세포에 직접 처리를 적용하기 위해 유리 피펫(내경 0.8mm)으로 만든 맞춤형 전달 시스템을 핀치 밸브 및 전자 밸브 컨트롤러가 포함된 용액 교환 시스템과 결합된 45° 각도로 ~350μm 떨어진 ~1mm 떨어진 곳에 배치했습니다( 그림 2E 참조).

4. 데이터 분석

1. 개별 셀에 해당하는 관심 영역(ROI)을 정의합니다.
   1. 신호 강도가 가장 높은 프레임을 선택하고(즉, ATP 적용에서) 응용 프로그램 다각형 도구를 사용하여 하나의 셀을 둘러쌉니다. 획득한 필드의 모든 셀에 대해 반복합니다. 서클 도구를 사용하여 백그라운드에서 5개의 ROI를 선택합니다.
   2. 단일 셀의 평균 신호 강도와 각 시간 프레임의 배경을 측정하려면 모든 ROI를 선택하고 ImageJ의 ROI Manager에서 다중 측정 명령을 사용하거나 상용 소프트웨어에서 동등한 명령을 사용합니다(재료 표 참조).
2. ROI의 평균 신호 강도 값을 스프레드시트로 내보냅니다.
3. 5개의 배경 ROI를 평균하고 동시에 획득한 프레임의 평균 ROI 강도에서 각 프레임의 평균 배경을 뺍니다.
4. 획득된 데이터를 기준선 신호로 정규화하려면 방정식 (1)을 사용하십시오.
   ΔF / F 0 = (F_- F 0) / F₀ (1)
   여기서, F는 배경 감산 후의 각 시간 프레임의 신호 강도이고,_F0 는 기준선 Fluo-4 형광이다.
   참고: 이 연구에서는 맞춤형 코드가 사용되었습니다.
5. 칼슘 활성을 분석하려면 칼슘 피크의 진폭 (ΔF / F 0), 칼슘 과도 (ΔF / F 0 × s)의 통합 변화 (시간 적분, 반응 기록 아래 표면), 자극 시작에서 최대 칼슘 과도 (s)까지의 피크 경과 시간, 자극 시작에서 ΔF / F ₀ 값까지 경과 된 상승 시간 최대 진폭 (S)의 50 % -80 %, 절반 최대 진폭 (S)에서 과도 현상의 절반 너비 전체 너비, 반복적 인 경우 응답 주파수 (Hz)에 도달합니다.

결과

배양에서 다양한 신경교 세포 유형의 특성 분석
실험을 위해 성상 세포를 생산하는 데 보통 15-21 일이 걸리는 반면, 소교 세포는 자라는 데 10-15 일이 걸립니다. 배양물의 세포 순도를 평가하기 위해 면역염색을 수행하였다. 도 1 은 각각의 배양물에서 성상세포 마커 GFAP 및 미세아교세포 마커 Iba1의 이중 표지의 발현을 나타낸 것이다.

칼슘 ...

토론

이 논문은 쥐 hSOD1^G93A 모델에서 ALS와 같은 세포(patho)생리학의 다양한 측면을 연구하기 위한 빠르고 "예산에 맞는" 도구로서 일차 세포 배양 방법을 제시합니다. 따라서이 기술은 더 높은 수준의 조직 (즉, 조직 조각 또는 살아있는 동물)에서 외삽되고 추가로 조사 될 수있는 단일 세포 수준의 연구에 적합합니다. 그러나 기술로서의 세포 배양에는 몇 가지 주의 사항이 있습니다. 얼음 위에서...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL tube	Sarstedt, Germany	62 554 502
2 mL tube	Sarstedt, Germany	72.691
21 G needle	Nipro, Japan	HN-2138-ET
23 G needle	Nipro, Japan	HN-2338-ET
5 mL syringe	Nipro, Japan	SY3-5SC-EC
6 mm circular glass coverslip	Menzel Glasser, Germany	630-2113
60 mm Petri dish	ThermoFisher Sientific, USA	130181
ATP	Sigma-Aldrich, Germany	A9062
AxioObserver A1	Carl Zeiss, Germany
Bovine serum albumine	Sigma-Aldrich, Germany	B6917
Calcium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	2110
Centrifuge	Eppendorf, Germany
DAPI	Sigma-Aldrich, Germany	10236276001
D-glucose	Sigma-Aldrich, Germany	158968
DMEM	Sigma-Aldrich, Germany	D5648
Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody	Invitrogen, USA	A-21447
Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody	Invitrogen, USA	A-21202
EDTA	Sigma-Aldrich, Germany	EDS-100G
EGTA	Sigma-Aldrich, Germany	E4378
”evolve”-EM 512 Digital Camera System	Photometrics, USA
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	10500064
Fiji ImageJ Software	Open source under the GNU General Public Licence
FITC filter set	Chroma Technology Inc., USA
Fluo-4 AM	Molecular Probes, USA	F14201
Goat anti-Iba1	Fujifilm Wako Chemicals, USA	011-27991
HEPES	Biowest, France	P5455
HighSpeed Solution Exchange System	ALA Scientific Instruments, USA
Incubator	Memmert GmbH + Co. KG, Germany
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	M2393
Matlab software	Math Works, USA
Mouse anti-GFAP	Merck Millipore, USA	MAB360
Mowiol 40-88	Sigma-Aldrich, Germany	324590
Normal donkey serum	Sigma-Aldrich, Germany	D9663
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, Germany	158127
Penicilin and Streptomycin	ThermoFisher Sientific, USA	15140122
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich, Germany	P5899
Potassium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	P5405
Potassium dihydrogen phosphate	Carlo Erba Reagents, Spain	471686
Shaker DELFIA PlateShake	PerkinElmer Life Sciencies, USA
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, Germany	S3817
Sodium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	S5886
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Carl ROTH GmbH	X987.2
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich, Germany	P5280
Thapsigargine	Tocris Bioscience, UK	1138
Triton X - 100	Sigma-Aldrich, Germany	T8787
Trypsin	Sigma-Aldrich, Germany	T4799
Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520	Wescor, ELITechGroup Inc., USA
ViiFluor Imaging System	Visitron System Gmbh, Germany
VisiChrome Polychromator System	Visitron System Gmbh, Germany
VisiView high performance setup	Visitron System Gmbh, Germany
Xenon Short Arc lamp	Ushio, Japan