大鼠星形胶质细胞和小胶质细胞的原代培养及其在肌萎缩侧索硬化症研究中的应用

摘要

我们在这里提出了一个关于如何从大鼠皮质制备神经胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞的原代培养物的协议，用于细胞内 Ca²⁺ 的延时视频成像，用于研究 hSOD1^G93A 大鼠模型中肌萎缩侧索硬化症的病理生理学。

摘要

该协议演示了如何从Sprague Dawley大鼠的皮质制备神经胶质细胞，星形胶质细胞和小胶质细胞的原代培养物，以及如何使用这些细胞来研究肌萎缩侧索硬化症（ALS）的病理生理学大鼠hSOD1^G93A 模型中。首先，该协议展示了如何从出生后大鼠皮质中分离和培养星形胶质细胞和小胶质细胞，然后如何使用星形胶质细胞的神经胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）标记物和离子钙结合衔接分子1（Iba1）小胶质细胞标记物通过免疫细胞化学来表征和测试这些培养物的纯度。在下一阶段，描述了培养细胞的染料负载（钙敏感Fluo 4-AM）的方法，并在活细胞的视频成像实验中记录了Ca²⁺ 的变化。

视频记录的示例包括：（1）从ALS患者分离的免疫球蛋白G（IgG）急性暴露于免疫球蛋白G（IgG）的培养星形胶质细胞的Ca²⁺成像病例，与同一实验中证明的ATP反应相比，显示出特征性和特异性反应。示例还显示，与非转基因对照相比，hSOD1^G93A 星形胶质细胞中 ALS IgG 诱发的细胞内钙浓度瞬时升高更显着;（2）在内质网Ca 2 + ATP酶的非竞争性抑制剂thapsigargin（Thg）消耗钙储存期间培养的星形胶质细胞的Ca²⁺成像，然后通过在记录溶液中添加钙引发的储存操作的钙进入，这证明了hSOD1^G93A和非转基因星形胶质细胞中Ca^{2 +}储存操作之间的差异;（3）培养的小胶质细胞的Ca 2+成像主要显示对ALS IgG缺乏反应，而ATP应用引起Ca²⁺变化。本文还强调了关于培养物的关键细胞密度和纯度、选择正确浓度的Ca²⁺染料和染料加载技术的可能注意事项和注意事项。

引言

细胞培养技术在健康和疾病的细胞神经生理学不同领域取得了许多进展。特别是，从实验室动物的神经元组织中新鲜分离的原代细胞培养物使实验者能够仔细研究不同生化介质和生理设置中不同细胞的行为。使用不同的荧光生理指示剂（例如Ca²⁺敏感染料）与延时视频显微镜相结合，可以实时更好地了解细胞的生物物理和生化过程。

ALS是一种破坏性的神经退行性疾病，影响上运动神经元和下运动神经元¹。该病具有家族型的复杂发病机制，但主要是散发形式（90% 的病例）²。众所周知，非细胞自主机制有助于ALS病理生理学，主要是由于神经胶质细胞的重要作用³。ALS也被很好地描述为一种神经炎症性疾病，涉及体液和炎症的细胞因素。

免疫球蛋白G被广泛用作ALS和其他神经退行性疾病的分子标志物。研究该标志物的血清水平可以指示疾病^中神经炎症的存在和阶段4，⁵，6^，而其在脑脊液中的存在可以表明血^脑屏障的破坏7。IgG也被确定为ALS患者脊髓运动神经元中的沉积物

研究方案

所有实验均按照欧盟关于为科学目的保护动物的指令进行，并得到贝尔格莱德大学生物学院伦理委员会的许可（批准号EK-BF-2016/08）。关于患者材料（IgG血清），根据世界医学协会道德规范（赫尔辛基宣言）收集用于常规临床检查，并征得患者同意，用于涉及人类的实验。该方案已获得塞尔维亚临床中心伦理委员会（第850/6号）的批准。

1. 原代细胞培养准备

1. 脑组织分离
   注意：应使用冰冷溶液在冰上进行隔离。
   1. 使用1-3天大的新生幼崽进行初级新生儿细胞培养³³.
      注意：对于此处介绍的研究，使用了Sprague Dawley hSOD1^G93A 和非转基因大鼠。对于基因分型，大鼠尾巴用于后来的DNA提取和PCR。
   2. 在幼犬的头上撒上 70% 的乙醇，并立即用剪刀将其快速斩首。
   3. 用小角度剪刀切开皮肤，露出头骨。通过从 大孔 向眼眶切开头骨。接下来，进行垂直的中线切割。从颅骨中取出大脑并将其放入含有磷酸盐缓冲盐水（PBS）的培养皿中。
      注意：清洁幼崽之间的工具，以防止转基因和非转基因幼崽之间的交叉污染。皮质与大脑其余部分的分离应在体视显微镜下进行。
   4. 使用镊子的尖端，撕裂两个半球之间的连接。然后，用弯曲的镊子轻轻地将半球从中心推到侧面，从而分开半球。
   ....

结果

培养中不同神经胶质细胞类型的表征
产生用于实验的星形胶质细胞通常需要15-21天，而小胶质细胞需要10-15天才能生长。进行免疫染色以评估培养物的细胞纯度。 图1 显示了星形胶质细胞标志物GFAP和小胶质细胞标志物Iba1在各自培养物中的双重标记表达。

已知钙成像可揭示健康和患病星形胶质细胞的细胞生理学差异。以前在野生型星形胶?.......

讨论

本文介绍了原代细胞培养方法，作为一种快速且“预算内”的工具，用于研究大鼠hSOD1^G93A 模型中的细胞（病理）生理学的不同方面，例如ALS。因此，该技术适用于单细胞水平的研究，可以在更高的组织水平（即，在组织切片或活体动物中）进行外推和进一步研究。然而，细胞培养作为一种技术有一些注意事项。最重要的是在冰上进行脑组织分离和细胞解离，并在尽可能短的时间内进行这?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL tube	Sarstedt, Germany	62 554 502
2 mL tube	Sarstedt, Germany	72.691
21 G needle	Nipro, Japan	HN-2138-ET
23 G needle	Nipro, Japan	HN-2338-ET
5 mL syringe	Nipro, Japan	SY3-5SC-EC
6 mm circular glass coverslip	Menzel Glasser, Germany	630-2113
60 mm Petri dish	ThermoFisher Sientific, USA	130181
ATP	Sigma-Aldrich, Germany	A9062
AxioObserver A1	Carl Zeiss, Germany
Bovine serum albumine	Sigma-Aldrich, Germany	B6917
Calcium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	2110
Centrifuge	Eppendorf, Germany
DAPI	Sigma-Aldrich, Germany	10236276001
D-glucose	Sigma-Aldrich, Germany	158968
DMEM	Sigma-Aldrich, Germany	D5648
Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody	Invitrogen, USA	A-21447
Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody	Invitrogen, USA	A-21202
EDTA	Sigma-Aldrich, Germany	EDS-100G
EGTA	Sigma-Aldrich, Germany	E4378
”evolve”-EM 512 Digital Camera System	Photometrics, USA
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	10500064
Fiji ImageJ Software	Open source under the GNU General Public Licence
FITC filter set	Chroma Technology Inc., USA
Fluo-4 AM	Molecular Probes, USA	F14201
Goat anti-Iba1	Fujifilm Wako Chemicals, USA	011-27991
HEPES	Biowest, France	P5455
HighSpeed Solution Exchange System	ALA Scientific Instruments, USA
Incubator	Memmert GmbH + Co. KG, Germany
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	M2393
Matlab software	Math Works, USA
Mouse anti-GFAP	Merck Millipore, USA	MAB360
Mowiol 40-88	Sigma-Aldrich, Germany	324590
Normal donkey serum	Sigma-Aldrich, Germany	D9663
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, Germany	158127
Penicilin and Streptomycin	ThermoFisher Sientific, USA	15140122
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich, Germany	P5899
Potassium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	P5405
Potassium dihydrogen phosphate	Carlo Erba Reagents, Spain	471686
Shaker DELFIA PlateShake	PerkinElmer Life Sciencies, USA
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, Germany	S3817
Sodium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	S5886
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Carl ROTH GmbH	X987.2
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich, Germany	P5280
Thapsigargine	Tocris Bioscience, UK	1138
Triton X - 100	Sigma-Aldrich, Germany	T8787
Trypsin	Sigma-Aldrich, Germany	T4799
Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520	Wescor, ELITechGroup Inc., USA
ViiFluor Imaging System	Visitron System Gmbh, Germany
VisiChrome Polychromator System	Visitron System Gmbh, Germany
VisiView high performance setup	Visitron System Gmbh, Germany
Xenon Short Arc lamp	Ushio, Japan