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摘要

我们在这里提出了一个关于如何从大鼠皮质制备神经胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞的原代培养物的协议，用于细胞内 Ca2+ 的延时视频成像，用于研究 hSOD1G93A 大鼠模型中肌萎缩侧索硬化症的病理生理学。

摘要

该协议演示了如何从Sprague Dawley大鼠的皮质制备神经胶质细胞，星形胶质细胞和小胶质细胞的原代培养物，以及如何使用这些细胞来研究肌萎缩侧索硬化症（ALS）的病理生理学大鼠hSOD1G93A 模型中。首先，该协议展示了如何从出生后大鼠皮质中分离和培养星形胶质细胞和小胶质细胞，然后如何使用星形胶质细胞的神经胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）标记物和离子钙结合衔接分子1（Iba1）小胶质细胞标记物通过免疫细胞化学来表征和测试这些培养物的纯度。在下一阶段，描述了培养细胞的染料负载（钙敏感Fluo 4-AM）的方法，并在活细胞的视频成像实验中记录了Ca2+ 的变化。

视频记录的示例包括:（1）从ALS患者分离的免疫球蛋白G（IgG）急性暴露于免疫球蛋白G（IgG）的培养星形胶质细胞的Ca2+成像病例，与同一实验中证明的ATP反应相比，显示出特征性和特异性反应。示例还显示，与非转基因对照相比，hSOD1G93A 星形胶质细胞中 ALS IgG 诱发的细胞内钙浓度瞬时升高更显着;（2）在内质网Ca 2 + ATP酶的非竞争性抑制剂thapsigargin（Thg）消耗钙储存期间培养的星形胶质细胞的Ca2+成像，然后通过在记录溶液中添加钙引发的储存操作的钙进入，这证明了hSOD1G93A和非转基因星形胶质细胞中Ca2 +储存操作之间的差异;（3）培养的小胶质细胞的Ca 2+成像主要显示对ALS IgG缺乏反应，而ATP应用引起Ca2+变化。本文还强调了关于培养物的关键细胞密度和纯度、选择正确浓度的Ca2+染料和染料加载技术的可能注意事项和注意事项。

引言

细胞培养技术在健康和疾病的细胞神经生理学不同领域取得了许多进展。特别是，从实验室动物的神经元组织中新鲜分离的原代细胞培养物使实验者能够仔细研究不同生化介质和生理设置中不同细胞的行为。使用不同的荧光生理指示剂（例如Ca2+敏感染料）与延时视频显微镜相结合，可以实时更好地了解细胞的生物物理和生化过程。

ALS是一种破坏性的神经退行性疾病，影响上运动神经元和下运动神经元1。该病具有家族型的复杂发病机制，但主要是散发形式（90% 的病例）2。众所周知，非细胞自主机制有助于ALS病理生理学，主要是由于神经胶质细胞的重要作用3。ALS也被很好地描述为一种神经炎症性疾病，涉及体液和炎症的细胞因素。

免疫球蛋白G被广泛用作ALS和其他神经退行性疾病的分子标志物。研究该标志物的血清水平可以指示疾病中神经炎症的存在和阶段4，5，6，而其在脑脊液中的存在可以表明血脑屏障的破坏7。IgG也被确定为ALS患者脊髓运动神经元中的沉积物7。然而，这种方法在IgG水平与疾病分期和特征的相关性方面显示出一些不一致之处6。

从ALS患者血清中分离的IgG（ALS IgG）可以在幼稚星形胶质细胞中诱导钙反应8和神经元中的谷氨酸释放，这表明兴奋性毒性作用 - ALS病理学9的标志。然而，对hSOD1G93A ALS大鼠模型（包含人SOD1突变的多个拷贝10）的研究表明，培养的神经胶质细胞11，组织12，13，14或活体动物13中有许多氧化应激标志物。值得注意的是，从ALS大鼠模型培养的星形胶质细胞比来自非转基因同窝的星形胶质细胞更容易发生过氧化物诱导的氧化应激11。

培养中的小胶质细胞以不太明显的方式受到ALS IgG的影响。也就是说，BV-2小胶质细胞系仅响应于4/11 ALS IgG患者样本的应用，显示出来自氧化应激荧光标记物的信号升高15。众所周知，小胶质细胞参与许多神经炎症病理，增加了ALS16，17非细胞自主机制的氧化应激和晚期进展阶段。然而，ALS IgGs的数据表明，这些细胞可能不像星形胶质细胞那样对这些ALS炎症的体液因子有反应。已经对来自ALS小鼠模型的原代星形胶质细胞进行了几项研究，不仅在幼崽中，而且在有症状的动物中，无论是在大脑还是脊髓上18，19，20，21。小胶质细胞原代培养也是如此，尽管程度低于星形胶质细胞，并且主要来自胚胎阶段的大脑区域22，23，24。

我们在培养的细胞上使用Ca2+的延时视频成像，主要作为跟踪该离子的细胞内瞬变作为兴奋性毒性的生理标志物的手段。因此，通过对这些瞬变（振幅、瞬态下面积、上升时间、频率）进行生物物理表征，研究人员可以从不同的神经变性细胞模型中获得实验诊断参数。因此，该技术提供了对IgG作为疾病生物标志物进行定量生理评估的优势。有大量关于IgG和Ca2+在诱导ALS中的作用的文献。这些研究中的大多数是通过将患者IgGs注射到实验动物25，26，27，28，29中诱导ALS进行的，然后显示细胞内Ca 2+升高和IgG沉积。一系列研究探讨了ALS IgGs对体外运动突触的影响30，31，32。在上述背景下，这里介绍的技术将重点放在神经胶质细胞作为ALS非细胞自主机制的重要参与者上，并量化了它们对IgG的潜在兴奋毒性反应作为神经炎症的体液因子。这种方法在测试其他体液因子（如全血清、脑脊液或细胞因子）中可能具有更广泛的应用，这些因子在不同的细胞培养系统和一般炎症的细胞模型中。

本文描述了如何从Sprague Dawley大鼠的皮质制备神经胶质细胞，星形胶质细胞和小胶质细胞的原代培养物，以及如何进一步使用这些细胞研究患者血清来源的IgG的ALS病理生理学。详细介绍了培养细胞的染料上样（图1）和延时视频成像实验中Ca2+ 变化的记录方案。视频记录的例子将显示与ATP相比，神经胶质细胞对ALS IgG的反应，后者激活嘌呤能膜受体。首次展示了一个关于从hSOD1G93A ALS大鼠大脑中分离的星形胶质细胞如何与非转基因对照相比对ALS IgG产生更显着的Ca2+ 反应的示例，以及如何将该过程与Ca2 + 商店操作的差异联系起来。还显示了ALS IgG急性攻击的小胶质细胞中的钙成像示例，细胞内钙仅有适度反应。

研究方案

所有实验均按照欧盟关于为科学目的保护动物的指令进行，并得到贝尔格莱德大学生物学院伦理委员会的许可（批准号EK-BF-2016/08）。关于患者材料（IgG血清），根据世界医学协会道德规范（赫尔辛基宣言）收集用于常规临床检查，并征得患者同意，用于涉及人类的实验。该方案已获得塞尔维亚临床中心伦理委员会（第850/6号）的批准。

1. 原代细胞培养准备

  1. 脑组织分离
    注意:应使用冰冷溶液在冰上进行隔离。
    1. 使用1-3天大的新生幼崽进行初级新生儿细胞培养33.
      注意:对于此处介绍的研究，使用了Sprague Dawley hSOD1G93A 和非转基因大鼠。对于基因分型，大鼠尾巴用于后来的DNA提取和PCR。
    2. 在幼犬的头上撒上 70% 的乙醇，并立即用剪刀将其快速斩首。
    3. 用小角度剪刀切开皮肤，露出头骨。通过从 大孔 向眼眶切开头骨。接下来，进行垂直的中线切割。从颅骨中取出大脑并将其放入含有磷酸盐缓冲盐水（PBS）的培养皿中。
      注意:清洁幼崽之间的工具，以防止转基因和非转基因幼崽之间的交叉污染。皮质与大脑其余部分的分离应在体视显微镜下进行。
    4. 使用镊子的尖端，撕裂两个半球之间的连接。然后，用弯曲的镊子轻轻地将半球从中心推到侧面，从而分开半球。
    5. 用直而弯曲的镊子小心地撕裂脑膜，以去除脑膜。
    6. 用弯曲的镊子捏住海马体，取出海马体。丢弃海马体或将其用于另一种细胞培养制剂。
      注意:应在层流罩下执行进一步的步骤，以确保无菌条件。
  2. 组织匀浆和解离
    1. 将一个皮层转移到装有 3 mL 冷 PBS 的 15 mL 管中。用 1 mL 吸头上下移液悬浮液，完成 10-15 次冲程，直到悬浮液变得均匀。
      注意:在此过程中要非常小心，不要产生气泡。
    2. 以500× g 离心5分钟。除去上清液，用 1 mL 吸头上下移液，将沉淀重悬于 3 mL 冷 PBS 中。重复离心步骤。
      注意:从这一点开始使用的所有溶液都应预热至37°C。
    3. 弃去上清液并将沉淀重悬于补充有 10% 胎牛血清 （FBS） 和抗生素（青霉素和链霉素）的 2 mL 完全 Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM） 中。将匀浆转移到 2 mL 管中。
    4. 将匀浆通过21 G和23 G针（每次三次）制成单细胞悬浮液。
      注意:在此过程中要非常小心，不要产生气泡。
  3. 将从一个皮层制备的细胞悬液倒入含有3mL完整DMEM的60mm直径培养皿或T25烧瓶（表面预处理多肽涂层以生长贴壁细胞）。轻轻摇动培养皿，使悬浮液均匀分布。
  4. 在37°C的5%CO2 / 95%空气的潮湿气氛中培养细胞。
  5. 分离后48小时更换培养基，每3天更换一次培养基。
  6. 为了促进星形胶质细胞生长，当细胞达到70%-80%汇合时，用预热的PBS洗涤它们以去除培养基中松散附着的神经胶质细胞和痕量的FBS。
    1. 通过加入 1 mL 预热胰蛋白酶溶液（0.25% 胰蛋白酶，PBS 中的 0.02% EDTA，无菌过滤）来胰蛋白酶消化星形胶质细胞的底层。
    2. 将培养皿置于37°C的培养箱中2-5分钟。
    3. 在显微镜下检查细胞。当它们开始分离时，加入 4 mL 的完整 DMEM。
    4. 收集细胞悬液并将其转移到 15 mL 管中。以500× g 离心5分钟。
    5. 弃去上清液并将沉淀重悬于1mL完全培养基中。使用血细胞计数器计数细胞。
    6. 在 5 mL 新鲜完全 DMEM 中以 104 个细胞/cm2 的密度重新铺板细胞。
  7. 每3天更换一次培养基。为了尽量减少其他神经胶质细胞类型的存在，在星形胶质细胞达到50%汇合后，在每次培养基更换之前，用完整的DMEM洗涤细胞。
    1. 用 1 mL 移液管吸出上清液培养基，并将其轻轻分配到细胞层上数次。确保在此洗涤步骤中覆盖细胞层的整个表面。
  8. 一旦细胞达到80%汇合（通常在14天后），重复胰蛋白酶消化和星形胶质细胞的收集，如步骤1.6中所述。
  9. 在涂有聚-L-赖氨酸（50μg/ mL）的7mm圆形玻璃盖玻片上种子5×103 星形胶质细胞。48小时后在实验中使用它们。
  10. 为了促进小胶质细胞，在步骤1.7之后，允许神经胶质细胞到达汇合层34。当小胶质细胞出现在星形胶质细胞层顶部时（10-15天后，通过其更小，更椭圆形的体和更短的过程识别），在轨道振荡器上以220rpm摇动培养皿2小时。
  11. 分散和接种小胶质细胞
    1. 用 1 mL 移液器吸头吸出上清液培养基，轻轻清洗分离和松散附着的细胞，并将其轻轻分配到细胞层上数次。确保在此洗涤步骤中覆盖细胞层的整个表面，收集带有分离细胞的培养基，并将其转移到15 mL管中。
    2. 以500× g 离心5分钟。弃去上清液并将沉淀重悬于1 mL培养基中。
    3. 将细胞悬液通过21 G针以获得单细胞悬液。
      注意:大多数已发表的方法使用胰蛋白酶或木瓜蛋白酶来解离组织;然而，21 G针具有防止细胞过度消化的优点，允许更温和的解离。
    4. 使用血细胞计数器计数细胞。在涂有聚-L-赖氨酸（50μg/ mL）的7mm圆形玻璃盖玻片上接种5×103 个小胶质细胞。48小时后在实验中使用它们。
      注意:很难通过摇动获得纯小胶质细胞培养物，因为根据实验者的经验，少突胶质细胞前体细胞和星形胶质细胞可能仍以可变数量存在。用于估计神经胶质培养物中不同细胞群存在的免疫细胞化学方案已在别处描述35。

2. 免疫细胞化学

  1. 冲洗在PBS盖玻片上接种的细胞，2 x 1分钟。
  2. 在室温（RT）下将细胞固定在4%多聚甲醛中20分钟。
  3. 在PBS中洗涤3 x 5分钟。
  4. 在含有10%正常驴血清（NDS）/ 1%牛血清白蛋白（BSA）/ 0.1%Triton X-100的封闭溶液中在室温下孵育45分钟。
    1. 每 10 mm 直径盖玻片加入 50 μL 封闭溶液。
  5. 在1%NDS / 1%BSA / 0.1%TritonX-100中以以下稀释度制备一抗:小鼠抗GFAP 1:300，山羊抗Iba1 1:500。将细胞与一抗在+ 4°C孵育过夜。
  6. 在PBS中冲洗，3 x 10分钟。
  7. 与与荧光团偶联的二抗孵育:驴抗小鼠（激发488nm [1:200））或驴抗山羊（激发647nm [1:200））。将细胞在室温下在黑暗中孵育2小时。
  8. 在PBS中洗涤，7 x 5分钟。
  9. 用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，1:4，000）在室温下孵育细胞10分钟。
  10. 在PBS中洗涤5 x 5分钟。
  11. 使用安装溶液将盖玻片安装在显微镜载玻片上;每张盖玻片使用一滴。
    注意:抗体稀释度可能因生产商而异。用户必须确定其实验的最佳稀释度。

3. 延时视频成像

注意:含有荧光染料的溶液应避免直射。在开始成像实验之前，请确保打开灌注时玻璃盖玻片不会移动。

  1. 溶液和细胞的制备
    1. 准备用于成像的细胞外溶液 （ECS）:140 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCal 2、2 mM MgCl2、10 mM D-葡萄糖和 10 mM HEPES。将pH值调节至7.4。确保渗透压为 280-300 mOsm/kg，并制备不含钙2+ 的 ECS:140 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM MgCl2、10 mM D-葡萄糖、10 mM HEPES 和 0.1 mM EGTA。
    2. 准备测试溶液:100 μM ATP 溶解在 ECS 中，1 μM Thg 溶于不含Ca 2+ 的 ECS 中，0.1 mg/mL ALS IgG 溶解在 ECS8 中。
    3. 将一张盖玻片转移到装有 ECS 的培养皿中，以洗掉完整的 DMEM。通过用ECS稀释1mM的Fluo-4 AM储备溶液至5μM Fluo-4 AM的终浓度来制备染料负载溶液。
      1. 将带有细胞的盖玻片置于染料负载溶液中，在黑暗的室温下30分钟。在ECS中洗涤细胞20分钟。
    4. 如果细胞未充分加载（即，如果荧光的基础水平太低 - 曝光时间大于400ms的相机动态范围的<5%），则在37°C下将加载时间增加到45分钟至1小时。 或者，在 ECS 中稀释之前，将 Fluo-4 AM 储备溶液与等体积的 20% （w/v） 去垢剂（Pluronic）在 DMSO 中混合，使最终 Pluronic 浓度为 ~0.02%。
      注意:本研究的实验示例是用从ALS患者的血清中分离的人IgG进行的，如前所述4，5，11。每个实验都是用单个患者的IgG样本进行的。
  2. 视频成像
    注意:在该协议中，视频成像系统与氙气短弧灯，多色器系统和配备水，甘油和油浸物镜的倒落射荧光显微镜相结合。使用数码相机系统进行延时成像。
    1. 在实验前15分钟打开成像设置的组件，以使系统达到工作温度。
    2. 将盖玻片放入装有 1 mL 工作溶液（ECS 或不含 Ca2+ 的 ECS）的记录室中。
    3. 要选择正确的成像协议，请打开成像软件，然后在 采集 面板中，为激发 波长 为 480 nm、二 向色镜 为 505 nm 和 发射波长 为 535 nm 的 Fluo4-AM 选择滤光片对。
    4. 选择视野，注意在整个实验过程中具有一致数量的细胞。适当调整曝光时间和检测器增益，使信号不饱和。选择 伪彩色 模式进行采集。有关更详细的说明，请参阅制造商提供的手册。
    5. 将采样率调整为 1 Hz（每秒 1 帧）。
    6. 通过获取基础荧光水平3-5分钟开始成像以进行基线测定（F0）。确保工作溶液的恒定流量。
    7. 停止工作溶液的流动，并在所需的时间长度内切换到测试溶液（另请参阅图2和图3示例中的时间栏）。在每个测试溶液之间，用恒定流量的工作溶液洗涤细胞3-5分钟。
    8. 通过从溶液顶部安排恒定的抽吸，将记录室中的溶液体积保持在~1 mL（参见 图2E）。
      注意:为了将处理直接应用于成像细胞，由玻璃移液管（0.8 mm内径）制成的定制输送系统以45°的角度放置在~350μm远处和细胞上方~1 mm，与包含夹管阀和电子阀门控制器的溶液交换系统相结合（见 图2E）。

4. 数据分析

  1. 定义与单个像元对应的感兴趣区域 （ROI）。
    1. 选择具有最高信号强度的帧（即，来自ATP的应用），并使用应用程序 多边形工具包围一个单元格。对采集字段中的所有单元格重复此操作。使用 圆形工具在后台选择五个 ROI。
    2. 要测量单个单元格的平均信号强度和每个时间范围的背景，请选择所有ROI，并使用ImageJ中ROI管理器中的"多测量"命令或商业软件中的任何等效命令（请参阅材料表）。
  2. 将ROI的平均信号强度值导出为电子表格。
  3. 平均五个背景ROI，并从同时获取的帧的平均ROI强度中减去每帧的平均背景。
  4. 要将获得的数据归一化为基线信号，请使用公式（1）:
    ΔF/F 0 = （F- F 0）/F0 （1）
    其中F是背景减去后每个时间帧的信号强度，F0 是基线Fluo-4荧光。
    注意:本研究使用了定制的代码。
  5. 要分析钙活性，请确定几个参数4:钙峰的振幅（ΔF/F 0），钙瞬时的积分变化（时间积分，响应记录下的表面）（ΔF/F 0× s），从刺激开始到钙瞬时最大值（s）的峰值经过的时间，从刺激开始到ΔF/F 0值的上升时间 达到最大振幅（s）的50%-80%，半最大振幅（s）时瞬态的半宽全宽，如果它们是重复的响应频率（Hz）。

结果

培养中不同神经胶质细胞类型的表征
产生用于实验的星形胶质细胞通常需要15-21天，而小胶质细胞需要10-15天才能生长。进行免疫染色以评估培养物的细胞纯度。 图1 显示了星形胶质细胞标志物GFAP和小胶质细胞标志物Iba1在各自培养物中的双重标记表达。

已知钙成像可揭示健康和患病星形胶质细胞的细胞生理学差异。以前在野生型星形胶?...

讨论

本文介绍了原代细胞培养方法，作为一种快速且"预算内"的工具，用于研究大鼠hSOD1G93A 模型中的细胞（病理）生理学的不同方面，例如ALS。因此，该技术适用于单细胞水平的研究，可以在更高的组织水平（即，在组织切片或活体动物中）进行外推和进一步研究。然而，细胞培养作为一种技术有一些注意事项。最重要的是在冰上进行脑组织分离和细胞解离，并在尽可能短的时间内进行这些?...

披露声明

作者没有利益冲突需要声明。

致谢

这项工作得到了塞尔维亚共和国教育科技发展部合同编号 451-03-9/2021-14/ 200178、FENS - NENS 教育和培训集群项目"神经炎症中神经胶质细胞三边课程"和 EC H2020 MSCA RISE 赠款 #778405 的支持。我们感谢Marija Adžić和Mina Perić提供免疫组织化学图像，感谢Danijela Bataveljić帮助撰写论文。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL tubeSarstedt, Germany62 554 502
2 mL tubeSarstedt, Germany72.691
21 G needleNipro, JapanHN-2138-ET
23 G needleNipro, JapanHN-2338-ET
5 mL syringeNipro, JapanSY3-5SC-EC
6 mm circular glass coverslipMenzel Glasser, Germany630-2113
60 mm Petri dishThermoFisher Sientific, USA130181
ATPSigma-Aldrich, GermanyA9062
AxioObserver A1Carl Zeiss, Germany
Bovine serum albumineSigma-Aldrich, GermanyB6917
Calcium chlorideSigma-Aldrich, Germany2110
CentrifugeEppendorf, Germany
DAPISigma-Aldrich, Germany10236276001
D-glucoseSigma-Aldrich, Germany158968
DMEMSigma-Aldrich, GermanyD5648
Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibodyInvitrogen, USAA-21447
Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibodyInvitrogen, USAA-21202
EDTASigma-Aldrich, GermanyEDS-100G
EGTASigma-Aldrich, GermanyE4378
”evolve”-EM 512 Digital Camera SystemPhotometrics, USA
Fetal bovine serum (FBS)Gibco, ThermoFisher Scientific, USA10500064
Fiji ImageJ SoftwareOpen source under the GNU General Public Licence
FITC filter setChroma Technology Inc., USA
Fluo-4 AMMolecular Probes, USAF14201
Goat anti-Iba1Fujifilm Wako Chemicals, USA011-27991
HEPESBiowest, FranceP5455
HighSpeed Solution Exchange SystemALA Scientific Instruments, USA
IncubatorMemmert GmbH + Co. KG, Germany
Magnesium chlorideSigma-Aldrich, GermanyM2393
Matlab softwareMath Works, USA
Mouse anti-GFAPMerck Millipore, USAMAB360
Mowiol 40-88Sigma-Aldrich, Germany324590
Normal donkey serumSigma-Aldrich, GermanyD9663
ParaformaldehydeSigma-Aldrich, Germany158127
Penicilin and StreptomycinThermoFisher Sientific, USA15140122
Poly-L-lysineSigma-Aldrich, GermanyP5899
Potassium chlorideSigma-Aldrich, GermanyP5405
Potassium dihydrogen phosphateCarlo Erba Reagents, Spain471686
Shaker DELFIA PlateShakePerkinElmer Life Sciencies, USA
Sodium bicarbonateSigma-Aldrich, GermanyS3817
Sodium chlorideSigma-Aldrich, GermanyS5886
Sodium phosphate dibasic heptahydrateCarl ROTH GmbHX987.2
Sodium pyruvateSigma-Aldrich, GermanyP5280
ThapsigargineTocris Bioscience, UK1138
Triton X - 100Sigma-Aldrich, GermanyT8787
TrypsinSigma-Aldrich, GermanyT4799
Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520Wescor, ELITechGroup Inc., USA
ViiFluor Imaging SystemVisitron System Gmbh, Germany
VisiChrome Polychromator SystemVisitron System Gmbh, Germany
VisiView high performance setupVisitron System Gmbh, Germany
Xenon Short Arc lampUshio, Japan

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