JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מציגים כאן פרוטוקול כיצד להכין תרביות ראשוניות של תאי גליה, אסטרוציטים ומיקרוגליה מקליפת המוח של חולדות להדמיית וידאו בהילוך מהיר של Ca2+ תוך-תאי למחקר על פתופיזיולוגיה של טרשת אמיוטרופית צידית במודל החולדות hSOD1G93A .

Abstract

פרוטוקול זה מדגים כיצד להכין תרביות ראשוניות של תאי גליה, אסטרוציטים ומיקרוגליה מקליפת המוח של חולדות ספראג דאולי וכיצד להשתמש בתאים אלה לצורך חקר הפתופיזיולוגיה של טרשת אמיוטרופית צידית (ALS) במודל hSOD1G93A של חולדה. ראשית, הפרוטוקול מראה כיצד לבודד ולתרבת אסטרוציטים ומיקרוגליה מקליפת המוח של חולדות לאחר הלידה, ולאחר מכן כיצד לאפיין ולבדוק את הטוהר של תרביות אלה על ידי אימונוציטוכימיה באמצעות סמן החלבון החומצי הגלי (GFAP) של אסטרוציטים וסמן המתאם הקושר סידן מיונן 1 (Iba1). בשלב הבא מתוארות שיטות להעמסת צבע (Fluo 4-AM הרגיש לסידן) של תאים בתרבית והקלטות של שינויים ב-Ca2+ בניסויי הדמיית וידאו על תאים חיים.

הדוגמאות להקלטות וידאו כוללות: (1) מקרים של Ca2+ הדמיה של אסטרוציטים בתרבית שנחשפו באופן חריף לאימונוגלובולין G (IgG) שבודדו מחולי ALS, והראו תגובה אופיינית וספציפית בהשוואה לתגובה ל-ATP כפי שהודגם באותו ניסוי. דוגמאות מראות גם עלייה חולפת בולטת יותר בריכוז הסידן התוך-תאי שמעורר ALS IgG באסטרוציטים hSOD1G93A בהשוואה לבקרים שאינם מהונדסים; (2) Ca 2+ הדמיה של אסטרוציטים בתרבית במהלך דלדול מאגרי הסידן על ידי thapsigargin (Thg), מעכב לא תחרותי של הרשתית האנדופלסמית Ca 2+ ATPase, ולאחר מכן ערך סידן המופעל על ידי אחסון הנגרם על ידי הוספת סידן בתמיסת ההקלטה, המדגימה את ההבדל בין פעולת Ca 2+ בחנות hSOD1G93A ובאסטרוציטים שאינם מהונדסים; (3) Ca 2+ הדמיה של המיקרוגליה התרבית מראה בעיקר חוסר תגובה ל-ALS IgG, בעוד שיישום ATP גרם לשינוי Ca2+. מאמר זה גם מדגיש אזהרות ואזהרות אפשריות לגבי צפיפות תאים קריטית וטוהר התרביות, תוך בחירת הריכוז הנכון של טכניקות צבע Ca2+ והעמסת צבע.

Introduction

טכניקות של תרביות תאים הולידו התקדמות רבה בתחומים מגוונים של נוירופיזיולוגיה תאית בבריאות ובמחלות. במיוחד, תרביות תאים ראשוניות, שבודדו זה עתה מרקמה עצבית של חיית מעבדה, מאפשרות לנסיין לחקור מקרוב את התנהגותם של תאים מגוונים במדיות ביוכימיות שונות ובמערכים פיזיולוגיים שונים. שימוש באינדיקטורים פיזיולוגיים פלואורסצנטיים שונים כגון הצבעים הרגישים ל-Ca2+ בשילוב עם מיקרוסקופיית וידאו בהילוך מהיר מספק תובנה טובה יותר לגבי התהליכים הביופיזיים והביוכימיים של התאים בזמן אמת.

ALS היא מחלה נוירודגנרטיבית הרסנית המשפיעה על נוירונים מוטוריים עליונים ותחתונים1. למחלה יש פתוגנזה מורכבת מהסוג המשפחתי אך בעיקר של הצורה הספורדית (90% מהמקרים)2. ידוע שמנגנונים אוטונומיים שאינם תאיים תורמים לפתופיזיולוגיה של ALS, בעיקר בשל התפקיד החיוני של תאי גליה3. ALS מאופיינת היטב גם כמחלה נוירו-דלקתית עם מעורבות של גורמים הומורליים ותאיים של דלקת.

אימונוגלובולין G נמצא בשימוש נרחב כסמן מולקולרי ב- ALS ובמחלות נוירודגנרטיביות אחרות. לימוד רמת הסרום של סמן זה יכול להצביע על נוכחות ושלב של דלקת עצבית במחלה 4,5,6, בעוד נוכחותו בנוזל המוח והשדרה יכולה להצביע על הפרה של מחסום הדם במוח7. IgGs זוהו גם כמשקעים בתאי העצב המוטוריים של חוט השדרה של חולי ALS7. עם זאת, גישה זו הראתה כמה חוסר עקביות במתאם של רמת IgGs עם השלב והמאפיינים של המחלה6.

IgG שבודד מהסרה של חולי ALS (ALS IgG) יכול לגרום לתגובת סידן באסטרוציטים נאיביים8 ושחרור גלוטמט בתאי עצב, מה שמצביע על אפקט אקסיטוטוקסי - סימן היכר של פתולוגיה של ALS9. עם זאת, מחקרים על מודל החולדות hSOD1G93A ALS (המכיל עותקים מרובים של מוטציית SOD1 האנושית 10) הראו מספר סמנים של עקה חמצונית בתאי נוירוגליה בתרבית 11, רקמות 12,13,14, או חיותחיות 13. ראוי לציין כי האסטרוציטים שגודלו בתרבית ממודל חולדות ה-ALS היו מועדים יותר לעקה חמצונית הנגרמת על-ידי חמצן מאשר האסטרוגליה של חברי המלטה שאינם מהונדסים11.

תאים מיקרוגליאליים בתרבית מושפעים מ-ALS IgG בצורה פחות נראית לעין. כלומר, קו תאים מיקרוגליאליים מסוג BV-2 הציג עלייה באות מסמנים פלואורסצנטיים של עקה חמצונית בתגובה ליישום של דגימות 4/11 בלבד של חולי ALS IgG15. ידוע כי מיקרוגליה משתתפת בפאתולוגיות נוירו-דלקתיות רבות, מה שמוסיף לעקה חמצונית ולשלב התקדמות מאוחר במנגנון האוטונומי הלא-תאי של ALS16,17. עם זאת, הנתונים עם ALS IgGs הצביעו על כך שתאים אלה עשויים להיות לא תגובתיים כמו אסטרוציטים לגורמים הומורליים אלה של דלקת ALS. מספר מחקרים נערכו עם אסטרוציטים ראשוניים ממודלים של ALS murine, לא רק בגורים אלא גם בבעלי חיים סימפטומטיים, על המוח או על חוט השדרה 18,19,20,21. זה נכון גם לגבי תרביות ראשוניות מיקרוגליות, אם כי במידה פחותה מאשר אסטרוציטים ובעיקר מאזורי מוח בשלב העוברי22,23,24.

אנו משתמשים בהדמיית וידאו בהילוך מהיר של Ca2+ על תאים בתרבית בעיקר כאמצעי לעקוב אחר מעברים תוך-תאיים של יון זה כסמן פיזיולוגי של אקסיטוטוקסיות. לפיכך, על ידי אפיון ביופיזי של ארעיות אלה (משרעת, שטח תחת חולף, זמן עלייה, תדירות) החוקר יכול לקבל פרמטרים אבחוניים ניסיוניים ממודלים תאיים מגוונים של ניוון עצבי. טכניקה זו מציעה אפוא יתרון של הערכה פיזיולוגית כמותית של IgGs כסמנים ביולוגיים של מחלות. יש גוף גדול של ספרות על התפקיד של IgGs ו Ca2 + באינדוקציה של ALS. רוב המחקרים הללו בוצעו על ידי גרימת ALS על ידי הזרקת IgGs של מטופלים לחיות ניסוי 25,26,27,28,29, אשר לאחר מכן הראו עלייה תוך תאית Ca 2+ ותצהירי IgG. שורה של מחקרים בחנו את ההשפעה של ALS IgGs על הסינפסה המוטורית במבחנה30,31,32. בהקשר הנ"ל, הטכניקה המוצגת כאן שמה את הדגש על תאי הגליה כשחקנים חשובים במנגנון האוטונומי הלא-תאי של ALS ומכמתת את התגובה האקסיטוטוקסית הפוטנציאלית שלהם ל- IgGs כגורמים הומוריסטיים של דלקת עצבית. לגישה זו עשוי להיות יישום רחב יותר בבדיקת גורמים הומוריסטיים אחרים כגון סרה שלמה, CSF או ציטוקינים במערכות תרביות תאים שונות ובמודלים תאיים של דלקת כללית.

מאמר זה מתאר כיצד להכין תרביות ראשוניות של תאי גליה, אסטרוציטים ומיקרוגליה מקליפת המוח של חולדות ספראג דאולי, וכיצד להמשיך להשתמש בתאים אלה כדי לחקור פתופיזיולוגיה של ALS עם IgG שמקורו בסרה. פרוטוקולים מפורטים עבור טעינת צבע של תאים בתרבית (איור 1) והקלטות של שינויים של Ca2+ בניסויי דימות וידאו בהילוך מהיר. דוגמאות להקלטות וידאו יראו כיצד תאי גליה מגיבים ל-ALS IgG בהשוואה ל-ATP, כשהאחרון מפעיל קולטני ממברנה פורינרגיים. מוצגת לראשונה דוגמה לאופן שבו אסטרוציטים שבודדו ממוח החולדה hSOD1G93A ALS מגיבים עם תגובת Ca 2+ בולטת יותר ל-ALS IgG בהשוואה לבקרות שאינן מהונדסות, וכיצד לקשר את התהליך הזה להבדלים בפעולת המאגר של Ca2+. כמו כן מוצגת דוגמה להדמיית סידן בתאים מיקרוגליאליים המאותגרים באופן חריף עם ALS IgG, עם תגובה צנועה בלבד של סידן תוך תאי.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות האיחוד האירופי להגנה על בעלי חיים למטרות מדעיות ובאישור הוועדה האתית של הפקולטה לביולוגיה, אוניברסיטת בלגרד (אישור מספר EK-BF-2016/08). לגבי חומר המטופל (sera עבור IgGs), הוא נאסף לבדיקה קלינית שגרתית בהסכמת המטופל מדעת בהתאם לקוד האתי של ההסתדרות הרפואית העולמית (הצהרת הלסינקי) לניסויים בבני אדם. הפרוטוקול אושר על ידי ועדת האתיקה של המרכז הקליני של סרביה (מס '850/6).

1. הכנת תרבית תאים ראשונית

  1. בידוד רקמת המוח
    הערה: בידוד צריך להתבצע על קרח, באמצעות פתרונות קרים כקרח.
    1. השתמשו בגורים שזה עתה נולדו בני 1-3 ימים לתרבית תאי יילודים ראשונית33.
      הערה: עבור המחקר המוצג כאן, Sprague Dawley hSOD1G93A וחולדות לא מהונדסות שימשו. לצורך גנוטיפ, זנבות חולדות שימשו למיצוי DNA מאוחר יותר ול-PCR.
    2. מפזרים את ראשו של הגור ב-70% אתנול ומיד מפרקים אותו במהירות באמצעות מספריים.
    3. חותכים את העור באמצעות מספריים קטנים זוויתיים כדי לחשוף את הגולגולת. פתח את הגולגולת על ידי ביצוע חתך מהפורמן מגנום לכיוון המסלולים. לאחר מכן, בצע חתך קו אמצע מאונך. הוציאו את המוח מהגולגולת והניחו אותו בצלחת פטרי המכילה תמיסת מלח עם מאגרי פוספט (PBS).
      הערה: נקו את הכלים בין גורים כדי למנוע זיהום צולב בין גורים מהונדסים לגורים שאינם מהונדסים. בידוד של קליפת המוח משאר המוח צריך להיעשות תחת סטריאומיקרוסקופ.
    4. באמצעות קצה המלקחיים, לקרוע את הקשרים בין שתי ההמיספרות. לאחר מכן, הפרד את ההמיספרות עם מלקחיים מעוקלים על ידי דחיפה עדינה של חצי הכדור מהמרכז לצד.
    5. הסר את קרומי המוח על ידי קריעתם בזהירות עם מלקחיים ישרים ומעוקלים.
    6. הסר את ההיפוקמפוס על ידי צביטה עם מלקחיים מעוקלים. השליכו את ההיפוקמפוס או השתמשו בו להכנת תרבית תאים אחרת.
      הערה: יש לבצע צעדים נוספים מתחת למכסה המנוע של הזרימה הלמינרית כדי להבטיח תנאים סטריליים.
  2. הומוגניזציה ודיסוציאציה של רקמות
    1. העבירו קליפת מוח אחת לצינור של 15 מ"ל מלא ב-3 מ"ל של PBS קר. מעכבים את המתלים למעלה ולמטה עם קצה של 1 מ"ל, ומשלימים 10-15 משיכות עד שהמתלה הופך הומוגני.
      הערה: היזהר מאוד לא לייצר בועות בתהליך זה.
    2. צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant ולהשהות את הכדור ב 3 מ"ל של PBS קר על ידי pipetting אותו למעלה ולמטה עם קצה 1 מ"ל. חזור על שלב הצנטריפוגה.
      הערה: יש לחמם מראש את כל הפתרונות המשמשים מנקודה זו ל-37 מעלות צלזיוס.
    3. יש להשליך את ה-supernatant ולהשהות את הכדור ב-2 מ"ל של ה-Modified Eagle Medium (DMEM) השלם של דולבקו, בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ואנטיביוטיקה (פניצילין וסטרפטומיצין). העבר את ההומוגנט לצינור 2 מ"ל.
    4. מעבירים את ההומוגנט דרך 21 G ו-23 G מחטים (שלוש פעמים כל אחת) כדי ליצור השעיה של תאים בודדים.
      הערה: היזהר מאוד לא לייצר בועות בתהליך זה.
  3. יוצקים את תרחיף התאים שהוכן מקליפת מוח אחת לתוך צלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ או בקבוק T25 (כאשר המשטח מטופל מראש בציפוי פוליפפטיד לצמיחת תאים דבקים) המכיל 3 מ"ל של DMEM שלם. נערו קלות את צלחת הפטרי כך שהמתלים יחולקו באופן אחיד.
  4. לגדל את התאים באינקובטור באטמוספירה לחה של 5% CO2/95% אוויר ב 37 מעלות צלזיוס.
  5. יש להחליף את המדיום 48 שעות לאחר הבידוד ולהחליף את המדיום כל 3 ימים.
  6. כדי לקדם את צמיחת האסטרוציטים, כאשר התאים מגיעים למפגש של 70%-80%, שטפו אותם עם PBS שחומם מראש כדי להסיר את תאי הגליה המחוברים באופן רופף ואת עקבות ה-FBS בתווך.
    1. טריפסין את השכבה הבסיסית של אסטרוציטים על ידי הוספת 1 מ"ל של תמיסת טריפסין שחוממה מראש (0.25% טריפסין, 0.02% EDTA ב- PBS, מסונן סטרילי).
    2. מניחים את המנה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2-5 דקות.
    3. בדוק את התאים מתחת למיקרוסקופ. כאשר הם מתחילים להתנתק, להוסיף 4 מ"ל של DMEM שלם.
    4. לאסוף את ההשעיה התא ולהעביר אותו צינור 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 5 דקות.
    5. השליכו את הסופר-נטנט והניחו מחדש את הכדור ב-1 מ"ל של מדיום שלם. לספור את התאים באמצעות hemocytometer.
    6. סידור מחדש של התאים בצפיפות של 104 תאים לס"מ2 ב-5 מ"ל של DMEM שלם טרי.
  7. שנה את המדיום כל 3 ימים. כדי למזער את נוכחותם של סוגי תאי גליה אחרים, לאחר שהאסטרוציטים מגיעים למפגש של 50% ולפני כל החלפת מדיה, שטפו את התאים ב-DMEM מלא.
    1. שאפו את המדיום העל-טבעי עם פיפטה של 1 מ"ל ופזרו אותו בעדינות על שכבת התאים מספר פעמים. ודא שכל פני השטח של שכבת התא מכוסים במהלך שלב כביסה זה.
  8. ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 80% (בדרך כלל לאחר 14 יום), חזור על הטריפסיניזציה ועל איסוף האסטרוציטים כמתואר בשלב 1.6.
  9. זרע 5 × 103 של אסטרוציטים על מכסה זכוכית עגול בקוטר 7 מ"מ המצופה בפולי-ל-ליזין (50 מיקרוגרם/מ"ל). השתמש בהם בניסויים לאחר 48 שעות.
  10. כדי לקדם מיקרוגליה, לאחר שלב 1.7, אפשרו לתאי הגליה להגיע לשכבה מקבילה34. כאשר תאים מיקרוגליאליים מופיעים על גבי שכבת האסטרוציטים (לאחר 10-15 ימים, המוכרים על ידי גופם הקטן והאליפטי יותר ותהליכים קצרים יותר), נערו את צלחת הפטרי על שייקר מסלולי במשך שעתיים ב-220 סל"ד.
  11. פיזור וזריעה של תאים מיקרוגליאליים
    1. שטפו קלות את התאים המנותקים והמחוברים באופן רופף על ידי שאיפת המדיום הסופר-נטנטי עם קצה פיפטה של 1 מ"ל ופזרו אותו בעדינות על שכבת התאים מספר פעמים. הקפד לכסות את כל פני השטח של שכבת התא במהלך שלב שטיפה זה, לאסוף את המדיום עם התאים מנותקים, ולהעביר אותו צינור 15 מ"ל.
    2. צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 5 דקות. השליכו את הסופר-נאטנט והחזירו את הכדור ב-1 מ"ל של מדיום.
    3. מעבירים את מתלה התא דרך מחט של 21 גרם כדי לקבל השעיה חד-תאית.
      הערה: רוב השיטות שפורסמו משתמשות בטריפסין או בפפאין כדי לנתק את הרקמה; עם זאת, 21 G מחטים יש את היתרון של מניעת עיכול יתר של תאים, המאפשר דיסוציאציה עדינה יותר.
    4. לספור את התאים באמצעות hemocytometer. זרעים 5 × 103 תאים מיקרוגליאליים על מכסה זכוכית עגול בקוטר 7 מ"מ המצופה בפולי-ל-ליזין (50 מיקרוגרם/מ"ל). השתמש בהם בניסויים לאחר 48 שעות.
      הערה: קשה להשיג תרבית מיקרוגליאלית טהורה על ידי טלטול, מכיוון שתאי מבשר אוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים עדיין עשויים להיות נוכחים במספר משתנה בהתאם לניסיון של הנסיין. הפרוטוקול האימונוציטוכימי המשמש להערכת נוכחותן של אוכלוסיות תאים שונות בתרביות גליה תואר במקומות אחרים35.

2. אימונוציטוכימיה

  1. שטפו את התאים המצופים על כיסויים ב-PBS, 2 x 1 דקות.
  2. תקן את התאים ב-4% פרפורמלדהיד למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  3. לשטוף PBS 3 x 5 דקות.
  4. דגירה בתמיסת חסימה המכילה 10% סרום חמור רגיל (NDS)/1% אלבומין בסרום בקר (BSA)/0.1% Triton X-100 למשך 45 דקות ב-RT.
    1. הוסף 50 μL של תמיסה חוסמת לכל מכסה בקוטר 10 מ"מ.
  5. הכן נוגדנים ראשוניים ב-1% NDS/1% BSA/0.1% TritonX-100 בדילולים הבאים: עכבר אנטי-GFAP 1:300, עז אנטי-Iba1 1:500. לדגור על התאים עם נוגדנים ראשוניים בלילה ב +4 מעלות צלזיוס.
  6. יש לשטוף ב-PBS, 3X10 דקות
  7. דגירה עם נוגדנים משניים מצומדים עם פלואורופור: חמור נגד עכבר (עירור 488 ננומטר [1:200)) או חמור נגד עז (נרגש ב 647 ננומטר [1:200)). דגירה של התאים במשך שעתיים ב-RT בחושך.
  8. לשטוף PBS, 7 x 5 דקות.
  9. דגרו על התאים עם 4',6-diamidino-2-פנילינדול (DAPI, 1:4,000) למשך 10 דקות ב-RT.
  10. לשטוף PBS 5 x 5 דקות.
  11. הרכב את הכיסויים על מגלשות מיקרוסקופ באמצעות פתרון הרכבה; יש להשתמש בטיפה אחת ממנו לכל כיסוי.
    הערה: דילולי הנוגדנים עשויים להשתנות בהתאם ליצרן. על המשתמשים לקבוע דילולים אופטימליים לניסויים שלהם.

3. הדמיית וידאו בהילוך מהיר

הערה: יש להגן על תמיסות המכילות את הצבע הפלואורסצנטי מפני אור ישיר. לפני תחילת ניסוי ההדמיה, ודא שכיסוי הזכוכית אינו זז בעת הפעלת הזילוף.

  1. הכנת פתרונות ותאים
    1. הכן תמיסה חוץ-תאית (ECS) להדמיה: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCal 2, 2 mM MgCl2, 10 mM D-גלוקוז ו-10 mM HEPES. התאם את ה- pH ל- 7.4. ודא שהאוסמולריות היא 280-300 mOsm/kg והכן ECS ללא Ca2+: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM D-גלוקוז, 10 mM HEPES ו- 0.1 mM EGTA.
    2. הכן את פתרונות הבדיקה: 100 μM ATP מומס ב- ECS, 1 μM Thg ב- ECS ללא Ca2+, ו- 0.1 מ"ג / מ"ל ALS IgG ב- ECS8.
    3. העבירו כיסוי אחד לצלחת עם ECS כדי לשטוף את ה-DMEM השלם. הכן את תמיסת טעינת הצבע על ידי דילול תמיסת מלאי של 1 mM של Fluo-4 AM עם ECS לריכוז הסופי של 5 μM Fluo-4 AM.
      1. הנח את הכיסוי עם תאים בתמיסת טעינת הצבע למשך 30 דקות ב-RT בחושך. לשטוף את התאים ב ECS במשך 20 דקות.
    4. אם התאים אינם טעונים כראוי (כלומר, אם הרמה הבסיסית של פלואורסצנציה נמוכה מדי - <5% מהטווח הדינמי של המצלמה עם זמן חשיפה גדול מ-400 אלפיות השנייה), הגדל את זמן הטעינה לעד 45 דקות עד שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס. לחלופין, ערבבו את תמיסת המלאי Fluo-4 AM עם נפח שווה של 20% (w/v) דטרגנט (פלורוני) ב-DMSO לפני דילול ב-ECS, מה שהופך את הריכוז הפלאורוני הסופי ~ 0.02%.
      הערה: הדוגמאות הניסיוניות של מחקר זה בוצעו עם IgG אנושי מבודד מדם סרה של חולי ALS כפי שתואר קודם לכן 4,5,11. כל ניסוי בוצע עם דגימות IgG של חולה יחיד.
  2. הדמיית וידאו
    הערה: בפרוטוקול זה, מערכת הדמיית הווידאו שולבה עם מנורת קשת קצרה של קסנון, מערכת פוליכרומטורים ומיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך המצויד במטרה לטבול מים, גליצרין ושמן. ההדמיה בהילוך מהיר בוצעה באמצעות מערכת מצלמות דיגיטליות.
    1. הפעל את רכיבי מערך ההדמיה 15 דקות לפני הניסוי כדי לאפשר למערכת להגיע לטמפרטורת העבודה.
    2. הנח את הכיסוי בתא ההקלטה עם 1 מ"ל של תמיסת עבודה (ECS או ECS ללא Ca2+).
    3. כדי לבחור את פרוטוקול ההדמיה הנכון, פתח את תוכנת ההדמיה ובחלונית Acquisition בחר את זוגות המסננים עבור Fluo4-AM עם אורך גל עירור ב-480 ננומטר, מראה דיכרואית באורך 505 ננומטר ואורך גל פליטה ב-535 ננומטר.
    4. בחר את שדה הראייה תוך הקפדה על מספר עקבי של תאים לאורך כל הניסוי. כוונן את זמן החשיפה ואת רווח הגלאי כראוי, באופן שהאות אינו רווי. בחר את מצב פסאודו-צבע לרכישה. לקבלת הוראות מפורטות יותר, עיין במדריך שסופק על-ידי היצרן.
    5. התאם את קצב הדגימה ל- 1 הרץ (פריים אחד לשנייה).
    6. התחל את ההדמיה על ידי רכישת הרמה הבסיסית של פלואורסצנציה למשך 3-5 דקות לקביעת קו הבסיס (F0). ודא זרימה קבועה של פתרון העבודה.
    7. עצרו את זרימת התמיסה העובדת ועברו לתמיסת הבדיקה למשך הזמן הרצוי (ראו גם סרגלי זמן בדוגמאות של איור 2 ואיור 3). בין כל תמיסת בדיקה, לשטוף את התאים עם זרימה קבועה של פתרון עובד במשך 3-5 דקות.
    8. שמור על עוצמת הקול של התמיסה בתא ההקלטה על ~1 מ"ל על-ידי סידור יניקה קבועה מראש התמיסה (ראה איור 2E).
      הערה: כדי להחיל את הטיפול ישירות על התאים המצולמים, מערכת אספקה מותאמת אישית העשויה מפיפטה זכוכית (קוטר פנימי של 0.8 מ"מ) הוצבה במרחק של ~ 350 מיקרומטר ו~ 1 מ"מ מעל התאים, בזווית של 45° בשילוב עם מערכת חילופי התמיסה המכילה שסתומי כיווץ ובקר שסתום אלקטרוני (ראה איור 2E).

4. ניתוח נתונים

  1. הגדר אזור עניין (ROI) המתאים לתא הבודד.
    1. בחר את המסגרת עם עוצמת האות הגבוהה ביותר (כלומר, מהיישום של ATP) והקף תא אחד באמצעות הכלי המצולע של היישום. חזור על הפעולה עבור כל התאים בשדה הנרכש. בחר חמישה ROIs ברקע באמצעות כלי העיגול.
    2. כדי למדוד את עוצמת האות הממוצעת של תא בודד ואת הרקע עבור כל מסגרת זמן, בחר את כל ה- ROIs והשתמש בפקודה Multi Measure ב- ROI Manager ב- ImageJ או בכל פקודה מקבילה בתוכנה מסחרית (ראה טבלת חומרים).
  2. ייצא את ערכי עוצמת האות הממוצע של ה- ROIs כגיליון אלקטרוני.
  3. ממוצע של חמישה ROI ברקע והפחת את הרקע הממוצע של כל מסגרת מעוצמת ההחזר הממוצעת על ההשקעה של המסגרת שנרכשה בו-זמנית.
  4. כדי לנרמל את הנתונים המתקבלים לאות הבסיסי, השתמש במשוואה (1):
    ΔF/F 0 = (F - F 0)/F0 (1)
    כאשר F היא עוצמת האות של כל מסגרת זמן לאחר חיסור הרקע, ו- F0 הוא פלואורסצנציית Fluo-4 הבסיסית.
    הערה: במחקר זה נעשה שימוש בקוד מותאם אישית.
  5. כדי לנתח את פעילות הסידן, קבעו מספר פרמטרים4: המשרעת של שיא הסידן (ΔF/F 0), השינוי המשולב (אינטגרל זמן, משטח מתחת לרישום התגובה) של טרנזיט הסידן (ΔF/F 0 × שניות), זמן שחלף מזמן עד שיא מתחילת הגירוי ועד למקסימום של סידן חולף (s), זמן עלייה שחלף מתחילת הגירוי לערך של ΔF/F 0 שמגיע ל-50%-80% מהמשרעת המקסימלית (s), לרוחב חצי רוחב-מלא של ארעי במשרעת חצי מקסימלית (s), תדירות התגובות אם הן חוזרות על עצמן (Hz).

תוצאות

אפיון סוגי תאי גליה שונים בתרבית
בדרך כלל לוקח 15-21 ימים לייצר אסטרוציטים לניסויים, בעוד שלתאים מיקרוגליאליים לוקח 10-15 ימים לגדול. החיסון בוצע כדי להעריך את טוהר התאים של התרבית. איור 1 מראה את הביטוי של תיוג כפול של הסמן האסטרוציטי GFAP והסמן המיקרוגליאלי Iba1 בתרבוי?...

Discussion

מאמר זה מציג את השיטה של גידול תאים ראשוניים ככלי מהיר ו"על התקציב" לחקר היבטים שונים של פיזיולוגיה של התא (פתו) כגון ALS במודל hSOD1G93A של חולדה. לפיכך, הטכניקה מתאימה למחקרים ברמת התא הבודד שניתן לבצע אקסטרפולציה ולחקור אותם ברמת ארגון גבוהה יותר (כלומר, בפרוסות רקמה או בחיה חיה). עם זאת, ל?...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי משרד החינוך מדע ופיתוח טכנולוגי הרפובליקה של סרביה חוזה מס '451-03-9/2021-14 / 200178, FENS - NENS חינוך והכשרה אשכול הפרויקט "קורס משולש על גליה בדלקת עצבית", ואת EC H2020 MSCA RISE מענק #778405. אנו מודים למריה אדז'יץ' ומינה פריץ' על אספקת תמונות האימונוהיסטוכימיה ולדניאלה באטאבליץ' על העזרה בכתיבת נייר.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL tubeSarstedt, Germany62 554 502
2 mL tubeSarstedt, Germany72.691
21 G needleNipro, JapanHN-2138-ET
23 G needleNipro, JapanHN-2338-ET
5 mL syringeNipro, JapanSY3-5SC-EC
6 mm circular glass coverslipMenzel Glasser, Germany630-2113
60 mm Petri dishThermoFisher Sientific, USA130181
ATPSigma-Aldrich, GermanyA9062
AxioObserver A1Carl Zeiss, Germany
Bovine serum albumineSigma-Aldrich, GermanyB6917
Calcium chlorideSigma-Aldrich, Germany2110
CentrifugeEppendorf, Germany
DAPISigma-Aldrich, Germany10236276001
D-glucoseSigma-Aldrich, Germany158968
DMEMSigma-Aldrich, GermanyD5648
Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibodyInvitrogen, USAA-21447
Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibodyInvitrogen, USAA-21202
EDTASigma-Aldrich, GermanyEDS-100G
EGTASigma-Aldrich, GermanyE4378
”evolve”-EM 512 Digital Camera SystemPhotometrics, USA
Fetal bovine serum (FBS)Gibco, ThermoFisher Scientific, USA10500064
Fiji ImageJ SoftwareOpen source under the GNU General Public Licence
FITC filter setChroma Technology Inc., USA
Fluo-4 AMMolecular Probes, USAF14201
Goat anti-Iba1Fujifilm Wako Chemicals, USA011-27991
HEPESBiowest, FranceP5455
HighSpeed Solution Exchange SystemALA Scientific Instruments, USA
IncubatorMemmert GmbH + Co. KG, Germany
Magnesium chlorideSigma-Aldrich, GermanyM2393
Matlab softwareMath Works, USA
Mouse anti-GFAPMerck Millipore, USAMAB360
Mowiol 40-88Sigma-Aldrich, Germany324590
Normal donkey serumSigma-Aldrich, GermanyD9663
ParaformaldehydeSigma-Aldrich, Germany158127
Penicilin and StreptomycinThermoFisher Sientific, USA15140122
Poly-L-lysineSigma-Aldrich, GermanyP5899
Potassium chlorideSigma-Aldrich, GermanyP5405
Potassium dihydrogen phosphateCarlo Erba Reagents, Spain471686
Shaker DELFIA PlateShakePerkinElmer Life Sciencies, USA
Sodium bicarbonateSigma-Aldrich, GermanyS3817
Sodium chlorideSigma-Aldrich, GermanyS5886
Sodium phosphate dibasic heptahydrateCarl ROTH GmbHX987.2
Sodium pyruvateSigma-Aldrich, GermanyP5280
ThapsigargineTocris Bioscience, UK1138
Triton X - 100Sigma-Aldrich, GermanyT8787
TrypsinSigma-Aldrich, GermanyT4799
Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520Wescor, ELITechGroup Inc., USA
ViiFluor Imaging SystemVisitron System Gmbh, Germany
VisiChrome Polychromator SystemVisitron System Gmbh, Germany
VisiView high performance setupVisitron System Gmbh, Germany
Xenon Short Arc lampUshio, Japan

References

  1. Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
  2. Taylor, J. P., Brown, R. H. J., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
  3. Gleichman, A. J., Carmichael, S. T. Glia in neurodegeneration: Drivers of disease or along for the ride. Neurobiology of Disease. 142, 104957 (2022).
  4. Zhang, R., et al. Evidence for systemic immune system alterations in sporadic amyotrophic lateral sclerosis (sALS). Journal of Neuroimmunology. 159 (1-2), 215-224 (2005).
  5. Saleh, I. A., et al. Evaluation of humoral immune response in adaptive immunity in ALS patients during disease progression. Journal of Neuroimmunology. 215 (1-2), 6 (2009).
  6. Wang, M., et al. Evaluation of Peripheral Immune Activation in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Frontiers in Neurology. 12, 628710 (2021).
  7. Li, J. -. Y., et al. Blood-brain barrier dysfunction and myelin basic protein in survival of amyotrophic lateral sclerosis with or without frontotemporal dementia. Neurological Sciences. 43 (5), 3201-3210 (2022).
  8. Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis affects cytosolic Ca2+ homeostasis in cultured rat astrocytes. Cell Calcium. 54 (1), 17-25 (2013).
  9. Andjus, P. R., Stevic-Marinkovic, Z., Cherubini, E. Immunoglobulins from motoneurone disease patients enhance glutamate release from rat hippocampal neurones in culture. Journal of Physiology. 504, 103-112 (1997).
  10. Howland, D. S., et al. Focal loss of the glutamate transporter EAAT2 in a transgenic rat model of SOD1 mutant-mediated amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (3), 1604-1609 (2002).
  11. Dučić, T., Stamenković, S., Lai, B., Andjus, P., Lučić, V. Multimodal synchrotron radiation microscopy of intact astrocytes from the hSOD1 G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Analytical Chemistry. 91 (2), 1460-1471 (2019).
  12. Popović-Bijelić, A., et al. Iron-sulfur cluster damage by the superoxide radical in neural tissues of the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 96, 313-322 (2016).
  13. Stamenković, S., et al. In vivo EPR pharmacokinetic evaluation of the redox status and the blood brain barrier permeability in the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 108, 258-269 (2017).
  14. Stamenković, S., Dučić, T., Stamenković, V., Kranz, A., Andjus, P. R. Imaging of glial cell morphology, SOD1 distribution and elemental composition in the brainstem and hippocampus of the ALS hSOD1(G93A) rat. Neuroscience. 357, 37-55 (2017).
  15. Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from sera of amyotrophic lateral sclerosis patients induce oxidative stress and upregulation of antioxidative system in BV-2 microglial cell line. Frontiers in Immunology. 8, 1619 (2017).
  16. Boillée, S., Cleveland, D. W. Revisiting oxidative damage in ALS: microglia, Nox, and mutant SOD1. Journal of Clinical Investigation. 118 (2), 474-478 (2008).
  17. Boillée, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
  18. Martínez-Palma, L., et al. Mitochondrial modulation by dichloroacetate reduces toxicity of aberrant glial cells and gliosis in the SOD1G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Journal of American Society for Experimental Neurotherapeutics. 16 (1), 203-215 (2019).
  19. Díaz-Amarilla, P., et al. Phenotypically aberrant astrocytes that promote motoneuron damage in a model of inherited amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), 18126-18131 (2011).
  20. Barbosa, M., et al. Recovery of depleted miR-146a in ALS cortical astrocytes reverts cell aberrancies and prevents paracrine pathogenicity on microglia and motor neurons. Frontiers in Cell Developmental Biology. 9, 634355 (2021).
  21. Gomes, C., et al. Astrocyte regional diversity in ALS includes distinct aberrant phenotypes with common and causal pathological processes. Experimental Cell Research. 395 (2), 112209 (2020).
  22. Kovacs, M., et al. CD34 identifies a subset of proliferating microglial cells associated with degenerating motor neurons in ALS. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 3880 (2019).
  23. Komiya, H., et al. Ablation of interleukin-19 improves motor function in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Molecular Brain. 14 (1), 1-13 (2021).
  24. Trias, E., et al. Emergence of microglia bearing senescence markers during paralysis progression in a rat model of inherited ALS. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 1-14 (2019).
  25. Pullen, A. H., Demestre, M., Howard, R. S., Orrell, R. W. Passive transfer of purified IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis to mice results in degeneration of motor neurons accompanied by Ca2+ enhancement. Acta Neuropatholgica. 107 (1), 35-46 (2004).
  26. Obál, I., et al. Intraperitoneally administered IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis or from an immune-mediated goat model increase the levels of TNF-α, IL-10 in the spinal cord and serum of mice. Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 121 (2016).
  27. Obál, I., et al. Experimental motor neuron disease induced in mice with long-term repeated intraperitoneal injections of serum from ALS patients. International Journal of Molecular Sciences. 20 (10), 2573 (2019).
  28. Mohamed, H. A., et al. Immunoglobulin Fc gamma receptor promotes immunoglobulin uptake, immunoglobulin-mediated calcium increase, and neurotransmitter release in motor neurons. Journal of Neuroscience Research. 69 (1), 110-116 (2002).
  29. Engelhardt, J. I., Siklos, L., Appel, S. H. Altered calcium homeostasis and ultrastructure in motoneurons of mice caused by passively transferred anti-motoneuronal IgG. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 56 (1), 21-39 (1997).
  30. Pagani, M. R., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Calcium signaling pathways mediating synaptic potentiation triggered by amyotrophic lateral sclerosis IgG in motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2661-2672 (2006).
  31. Carter, J. R., Mynlieff, M. Amyotrophic lateral sclerosis patient IgG alters voltage dependence of Ca2+ channels in dissociated rat motoneurons. Neuroscience Letters. 353 (3), 221-225 (2003).
  32. Fratantoni, S. A., Weisz, G., Pardal, A. M., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Amyotrophic lateral sclerosis IgG-treated neuromuscular junctions develop sensitivity to L-type calcium channel blocker. Muscle & Nerve. 23 (4), 543-550 (2000).
  33. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
  34. Vay, S. U., et al. The impact of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) and voltage-gated potassium KCNQ/Kv7 channels on primary microglia function. Journl of Neuroinflammation. 17 (1), 100 (2020).
  35. Bijelić, D. D., et al. Central nervous system-infiltrated immune cells induce calcium increase in astrocytes via astroglial purinergic signaling. Journal of Neuroscience Research. 98 (11), 2317-2332 (2020).
  36. Kawamata, H., et al. Abnormal intracellular calcium signaling and SNARE-dependent exocytosis contributes to SOD1G93A astrocyte-mediated toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2331-2348 (2014).
  37. Nims, R. W., Price, P. J. Best practices for detecting and mitigating the risk of cell culture contaminants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 53 (10), 872-879 (2017).
  38. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
  39. Adzic, M., et al. Extracellular ATP induces graded reactive response of astrocytes and strengthens their antioxidative defense in vitro. Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1053-1066 (2017).
  40. Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 198 (2020).
  41. Butovsky, O., et al. Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia. Nature Neuroscince. 17 (1), 131-143 (2014).
  42. Vankriekelsvenne, E., et al. Transmembrane protein 119 is neither a specific nor a reliable marker for microglia. Glia. 70 (6), 1170-1190 (2022).
  43. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved