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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir präsentieren hier ein Protokoll zur Vorbereitung von Primärkulturen von Gliazellen, Astrozyten und Mikroglia aus Rattenkortices für die Zeitraffer-Videobildgebung von intrazellulärem Ca2+ für die Erforschung der Pathophysiologie der amyotrophen Lateralsklerose im hSOD1G93A-Rattenmodell .

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zeigt, wie Primärkulturen von Gliazellen, Astrozyten und Mikroglia aus den Kortices von Sprague Dawley-Ratten hergestellt werden und wie diese Zellen zur Untersuchung der Pathophysiologie der amyotrophen Lateralsklerose (ALS) im hSOD1G93A-Modell der Ratte verwendet werden können. Zuerst zeigt das Protokoll, wie Astrozyten und Mikroglia aus postnatalen Rattenkortikern isoliert und kultiviert werden, und dann, wie diese Kulturen durch Immunzytochemie unter Verwendung des Gliafibrillär-sauren Proteins (GFAP) -Markers von Astrozyten und des ionisierten Calcium-bindenden Adaptermoleküls 1 (Iba1) Mikrogliamarkers charakterisiert und getestet werden. Im nächsten Schritt werden Methoden zur Farbstoffbeladung (calciumsensitives Fluo 4-AM) von kultivierten Zellen und die Aufzeichnung von Ca2+ Veränderungen in Videobildgebungsexperimenten an lebenden Zellen beschrieben.

Die Beispiele für Videoaufnahmen bestehen aus: (1) Fällen von Ca2+-Bildgebung von kultivierten Astrozyten, die akut Immunglobulin G (IgG) ausgesetzt waren, das von ALS-Patienten isoliert wurde und eine charakteristische und spezifische Reaktion im Vergleich zur Reaktion auf ATP zeigte, wie im selben Experiment gezeigt. Beispiele zeigen auch einen ausgeprägteren vorübergehenden Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration, hervorgerufen durch ALS-IgG in hSOD1G93A-Astrozyten im Vergleich zu nicht-transgenen Kontrollen; (2) Ca 2+ Bildgebung von kultivierten Astrozyten während einer Erschöpfung der Calciumspeicher durch Thapsigargin (Thg), einem nicht-kompetitiven Inhibitor des endoplasmatischen Retikulums Ca 2+ ATPase, gefolgt von einem speicherbetriebenen Calciumeintritt, der durch die Zugabe von Calcium in der Aufnahmelösung hervorgerufen wird, was den Unterschied zwischen dem Ca 2+-Speicherbetrieb in hSOD1G93A und in nicht-transgenen Astrozyten zeigt; (3) Ca 2+-Bildgebung der kultivierten Mikroglia zeigte überwiegend eine mangelnde Reaktion auf ALS-IgG, während die ATP-Anwendung eine Ca2+-Veränderung hervorrief. Dieses Papier betont auch mögliche Vorbehalte und Vorsichtsmaßnahmen in Bezug auf kritische Zelldichte und Reinheit von Kulturen, indem die richtige Konzentration des Ca2+ Farbstoffs und der Farbstoffladetechniken gewählt wird.

Einleitung

Zellkulturtechniken haben zu zahlreichen Fortschritten in verschiedenen Bereichen der zellulären Neurophysiologie in Gesundheit und Krankheit geführt. Insbesondere primäre Zellkulturen, frisch isoliert aus dem neuronalen Gewebe eines Labortieres, ermöglichen es dem Experimentator, das Verhalten verschiedener Zellen in verschiedenen biochemischen Medien und physiologischen Setups genau zu untersuchen. Die Verwendung verschiedener fluoreszierender physiologischer Indikatoren wie der Ca2+-sensitiven Farbstoffe in Kombination mit der Zeitraffer-Videomikroskopie ermöglicht einen besseren Einblick in die zellulären biophysikalischen und biochemischen Prozesse in Echtzeit.

ALS ist eine verheerende neurodegenerative Erkrankung, die obere und untere Motoneuronen betrifft1. Die Krankheit hat eine komplexe Pathogenese des familiären Typs, aber meist der sporadischen Form (90% der Fälle)2. Es ist bekannt, dass nicht-zellautonome Mechanismen zur ALS-Pathophysiologie beitragen, vor allem aufgrund der essentiellen Rolle von Gliazellen3. ALS ist auch gut als neuroinflammatorische Erkrankung mit Beteiligung von humoralen und zellulären Faktoren der Entzündung charakterisiert.

Immunglobulin G wird häufig als molekularer Marker bei ALS und anderen neurodegenerativen Erkrankungen verwendet. Die Untersuchung des Serumspiegels dieses Markers kann auf das Vorhandensein und Stadium der Neuroinflammation bei der Krankheit 4,5,6 hinweisen, während seine Anwesenheit in der Zerebrospinalflüssigkeit auf eine Verletzung der Blut-Hirn-Schranke 7 hinweisen kann. IgGs wurden auch als Ablagerungen in den Rückenmarks-Motoneuronen von ALS-Patienten identifiziert7. Dennoch hat dieser Ansatz einige Inkonsistenzen in der Korrelation des IgG-Spiegels mit dem Stadium und den Merkmalen der Krankheit gezeigt6.

Aus den Seren von ALS-Patienten isoliertes IgG (ALS-IgG) kann eine Kalziumreaktion in naiven Astrozyten8 und eine Glutamatfreisetzung in Neuronen induzieren, was auf eine exzitotoxische Wirkung hinweist - ein Kennzeichen der ALS-Pathologie9. Studien am HSOD1G93A ALS-Rattenmodell (das mehrere Kopien der menschlichen SOD1-Mutation10 enthielt) zeigten jedoch eine Reihe von Markern für oxidativen Stress in kultivierten Neurogliazellen11, Geweben 12,13,14 oder lebenden Tieren 13. Es ist bemerkenswert, dass die aus dem ALS-Rattenmodell gezüchteten Astrozyten anfälliger für oxidativen Stress waren, der durch Peroxid induziert wurde, als die Astroglia aus nicht-transgenen Wurfgeschwistern11.

Mikrogliazellen in Kultur sind weniger offensichtlich von ALS-IgG betroffen. Eine BV-2-Mikrogliazelllinie zeigte nämlich einen Anstieg des Signals von fluoreszierenden Markern für oxidativen Stress als Reaktion auf die Anwendung von nur 4/11 ALS-IgG-Patientenproben15. Es ist bekannt, dass Mikroglia an vielen neuroinflammatorischen Pathologien beteiligt sind, was zu oxidativem Stress und der späten Progressionsphase im nicht-zellautonomen Mechanismus von ALS16,17 beiträgt. Dennoch zeigten die Daten mit ALS-IgGs, dass diese Zellen möglicherweise nicht so reaktiv sind wie Astrozyten auf diese humoralen Faktoren der ALS-Entzündung. Mehrere Studien wurden mit primären Astrozyten aus ALS-Mausmodellen durchgeführt, nicht nur bei Welpen, sondern auch bei symptomatischen Tieren, entweder am Gehirn oder am Rückenmark 18,19,20,21. Dies gilt auch für mikrogliale Primärkulturen, wenn auch in geringerem Maße als Astrozyten und meist aus Hirnregionen im embryonalen Stadium22,23,24.

Wir verwenden Zeitraffer-Videoaufnahmen von Ca2+ auf Zellen in Kultur hauptsächlich als Mittel, um intrazelluläre Transienten dieses Ions als physiologischen Marker für Exzitotoxizität zu verfolgen. So kann der Forscher durch biophysikalische Charakterisierung dieser Transienten (Amplitude, Fläche unter Transienten, Anstiegszeit, Frequenz) experimentelle diagnostische Parameter aus verschiedenen zellulären Modellen der Neurodegeneration erhalten. Diese Technik bietet somit den Vorteil einer quantitativen physiologischen Bewertung von IgGs als Krankheitsbiomarker. Es gibt eine große Menge an Literatur über die Rolle von IgGs und Ca2+ bei der Induktion von ALS. Die meisten dieser Studien wurden durchgeführt, indem ALS induziert wurde, indem Patienten-IgGs in Versuchstiere injiziert wurden 25,26,27,28,29, die dann intrazelluläre Ca 2+-Erhöhung und IgG-Ablagerungen zeigten. Eine Reihe von Studien untersuchte die Wirkung von ALS-IgGs auf die motorische Synapse in vitro30,31,32. Im obigen Kontext legt die hier vorgestellte Technik den Fokus auf die Gliazellen als wichtige Akteure im nicht-zellautonomen Mechanismus der ALS und quantifiziert ihre mögliche exzitotoxische Reaktion auf IgGs als humorale Faktoren der Neuroinflammation. Dieser Ansatz kann eine breitere Anwendung beim Testen anderer humoraler Faktoren wie ganze Seren, Liquor oder Zytokine in verschiedenen Zellkultursystemen und in zellulären Modellen allgemeiner Entzündungen haben.

Dieser Artikel beschreibt, wie Primärkulturen von Gliazellen, Astrozyten und Mikroglia aus den Kortices von Sprague Dawley-Ratten hergestellt werden können und wie diese Zellen weiter verwendet werden können, um die ALS-Pathophysiologie mit Patienten-Seren-abgeleitetem IgG zu untersuchen. Protokolle sind detailliert für die Farbstoffbeladung von kultivierten Zellen (Abbildung 1) und die Aufzeichnungen von Ca2+ Änderungen in Zeitraffer-Video-Imaging-Experimenten. Beispiele für Videoaufnahmen zeigen, wie Gliazellen auf ALS-IgG im Vergleich zu ATP reagieren, wobei letzteres purinerge Membranrezeptoren aktiviert. Zum ersten Mal wird ein Beispiel gezeigt, wie aus dem HSOD1G93A ALS-Rattengehirn isolierte Astrozyten im Vergleich zu nicht-transgenen Kontrollen mit einer ausgeprägteren Ca 2+-Reaktion auf ALS-IgG reagieren und wie dieser Prozess mit den Unterschieden im Ca2+-Speicherbetrieb in Beziehung gesetzt werden kann. Ebenfalls gezeigt wird ein Beispiel für die Kalziumbildgebung in Mikrogliazellen, die akut mit ALS IgG herausgefordert wurden, mit nur einer bescheidenen Reaktion von intrazellulärem Kalzium.

Protokoll

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den EU-Richtlinien zum Schutz von Tieren für wissenschaftliche Zwecke und mit Genehmigung der Ethikkommission der Fakultät für Biologie der Universität Belgrad (Zulassungsnummer EK-BF-2016/08) durchgeführt. Das Patientenmaterial (Seren für IgGs) wurde für die routinemäßige klinische Untersuchung mit informierter Zustimmung des Patienten gemäß dem Ethikkodex des Weltärztebundes (Deklaration von Helsinki) für Experimente am Menschen gesammelt. Das Protokoll wurde von der Ethikkommission des Klinischen Zentrums Serbiens genehmigt (Nr. 850/6).

1. Vorbereitung der primären Zellkultur

  1. Isolierung von Hirngewebe
    HINWEIS: Die Isolierung sollte auf Eis mit eiskalten Lösungen durchgeführt werden.
    1. Verwenden Sie neugeborene Welpen im Alter von 1-3 Tagen für die primäre neonatale Zellkultur33.
      HINWEIS: Für die hier vorgestellte Studie wurden Sprague Dawley hSOD1G93A und nicht-transgene Ratten verwendet. Für die Genotypisierung wurden Rattenschwänze für die spätere DNA-Extraktion und PCR verwendet.
    2. Bestreuen Sie den Kopf des Welpen mit 70% Ethanol und enthaupten Sie ihn sofort schnell mit einer Schere.
    3. Schneiden Sie die Haut mit einer kleinen Schere auf, um den Schädel freizulegen. Öffnen Sie den Schädel, indem Sie einen Schnitt vom Foramen magnum in Richtung der Orbita machen. Als nächstes machen Sie einen senkrechten Mittellinienschnitt. Entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel und legen Sie es in eine Petrischale, die phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) enthält.
      HINWEIS: Reinigen Sie die Werkzeuge zwischen den Welpen, um eine Kreuzkontamination zwischen transgenen und nicht-transgenen Welpen zu vermeiden. Die Isolierung der Kortices vom Rest des Gehirns sollte unter einem Stereomikroskop erfolgen.
    4. Reißen Sie mit der Spitze der Pinzette die Verbindungen zwischen beiden Hemisphären. Trennen Sie dann die Hemisphären mit einer gekrümmten Pinzette, indem Sie eine Halbkugel vorsichtig von der Mitte zur Seite schieben.
    5. Entfernen Sie die Hirnhäute, indem Sie sie vorsichtig mit geraden und gebogenen Pinzetten zerreißen.
    6. Entfernen Sie den Hippocampus, indem Sie ihn mit einer gebogenen Pinzette kneifen. Verwerfen Sie den Hippocampus oder verwenden Sie ihn für ein anderes Zellkulturpräparat.
      HINWEIS: Weitere Schritte sollten unter der Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden, um sterile Bedingungen zu gewährleisten.
  2. Gewebehomogenisierung und Dissoziation
    1. Übertragen Sie einen Kortex in eine 15-ml-Röhre, die mit 3 ml kaltem PBS gefüllt ist. Pipeten Sie die Aufhängung mit einer 1-ml-Spitze auf und ab und absolvieren Sie 10-15 Hübe, bis die Aufhängung homogen wird.
      HINWEIS: Seien Sie sehr vorsichtig, um in diesem Prozess keine Blasen zu erzeugen.
    2. Bei 500 × g 5 min zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 3 ml kaltem PBS, indem Sie es mit einer 1-ml-Spitze auf und ab pipettieren. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt.
      HINWEIS: Alle ab diesem Zeitpunkt verwendeten Lösungen sollten auf 37 °C vorgewärmt werden.
    3. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 2 ml komplettem Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und Antibiotika (Penicillin und Streptomycin). Das Homogenat in ein 2 mL Röhrchen überführen.
    4. Führen Sie das Homogenat durch 21 G und 23 G Nadeln (jeweils dreimal), um eine Suspension aus einzelnen Zellen herzustellen.
      HINWEIS: Seien Sie sehr vorsichtig, um in diesem Prozess keine Blasen zu erzeugen.
  3. Gießen Sie die aus einem Kortex hergestellte Zellsuspension in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 60 mm oder einen T25-Kolben (wobei die Oberfläche mit einer Polypeptidbeschichtung für das Wachstum adhärenter Zellen vorbehandelt ist), die 3 ml vollständiges DMEM enthält. Die Petrischale leicht schütteln, damit die Suspension gleichmäßig verteilt ist.
  4. Züchten Sie die Zellen im Inkubator in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO2/95% Luft bei 37 °C.
  5. Wechseln Sie das Medium 48 h nach der Isolierung und ersetzen Sie das Medium alle 3 Tage.
  6. Um das Wachstum von Astrozyten zu fördern, waschen Sie sie, wenn Zellen eine Konfluenz von 70% -80% erreichen, mit vorgewärmtem PBS, um die lose anhaftenden Gliazellen und Spuren von FBS im Medium zu entfernen.
    1. Trypsinisieren Sie die darunter liegende Schicht von Astrozyten durch Zugabe von 1 ml vorgewärmter Trypsinlösung (0,25% Trypsin, 0,02% EDTA in PBS, steril gefiltert).
    2. Die Schale bei 37 °C für 2-5 min in den Inkubator stellen.
    3. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop. Wenn sie sich zu lösen beginnen, fügen Sie 4 ml vollständiges DMEM hinzu.
    4. Sammeln Sie die Zellsuspension und geben Sie sie in ein 15-ml-Röhrchen. Bei 500 × g 5 min zentrifugieren.
    5. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml vollständigem Medium. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
    6. Replaten Sie die Zellen bei einer Dichte von 104 Zellen /cm2 in 5 ml frischem komplettem DMEM.
  7. Wechseln Sie das Medium alle 3 Tage. Um das Vorhandensein anderer Gliazelltypen zu minimieren, waschen Sie die Zellen nach Erreichen von 50% Konfluenz und vor jedem Medienaustausch mit vollständigem DMEM.
    1. Das überstehende Medium mit einer 1 ml Pipette absaugen und mehrmals vorsichtig auf die Zellschicht dosieren. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Oberfläche der Zellschicht während dieses Waschschritts bedeckt ist.
  8. Sobald die Zellen einen Zusammenfluss von 80% erreicht haben (normalerweise nach 14 Tagen), wiederholen Sie die Trypsinisierung und die Entnahme von Astrozyten wie in Schritt 1.6 beschrieben.
  9. Samen 5 × 103 von Astrozyten auf einem 7 mm kreisförmigen Glasdeckglas, beschichtet mit Poly-L-Lysin (50 μg/ml). Verwenden Sie sie in Experimenten nach 48 h.
  10. Um Mikroglia zu fördern, lassen Sie nach Schritt 1.7 die Gliazellen eine konfluente Schicht34 erreichen. Wenn Mikrogliazellen auf der Astrozytenschicht erscheinen (nach 10-15 Tagen, erkennbar an ihren kleineren, ovaleren Körpern und kürzeren Prozessen), schütteln Sie die Petrischale auf einem Orbitalschüttler für 2 h bei 220 U / min.
  11. Dispergieren und Aussaaten von Mikrogliazellen
    1. Waschen Sie die abgelösten und lose anhaftenden Zellen leicht, indem Sie das überstehende Medium mit einer 1-ml-Pipettenspitze ansaugen und mehrmals vorsichtig auf die Zellschicht aufsaugen. Achten Sie darauf, während dieses Waschschritts die gesamte Oberfläche der Zellschicht zu bedecken, das Medium mit den abgelösten Zellen zu sammeln und in ein 15-ml-Röhrchen zu überführen.
    2. Bei 500 × g 5 min zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml Medium.
    3. Führen Sie die Zellsuspension durch eine 21-G-Nadel, um eine einzellige Suspension zu erhalten.
      HINWEIS: Die meisten veröffentlichten Methoden verwenden Trypsin oder Papain, um das Gewebe zu dissoziieren; 21 G-Nadeln haben jedoch den Vorteil, dass sie die Überverdauung von Zellen verhindern und eine sanftere Dissoziation ermöglichen.
    4. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Seed 5 × 103 Mikrogliazellen auf einem 7 mm großen kreisförmigen Glasdeckglas, beschichtet mit Poly-L-Lysin (50 μg/ml). Verwenden Sie sie in Experimenten nach 48 h.
      HINWEIS: Es ist schwierig, eine reine Mikrogliakultur durch Schütteln zu erhalten, da die Oligodendrozyten-Vorläuferzellen und Astrozyten je nach Erfahrung des Experimentators noch in variabler Anzahl vorhanden sein können. Das immunzytochemische Protokoll, das zur Abschätzung des Vorhandenseins verschiedener Zellpopulationen in Gliakulturen verwendet wird, wurde an anderer Stelle beschrieben35.

2. Immunzytochemie

  1. Spülen Sie die auf Deckgläsern plattierten Zellen in PBS, 2 x 1 min.
  2. Fixieren Sie die Zellen in 4% Paraformaldehyd für 20 min bei Raumtemperatur (RT).
  3. Waschen in PBS 3 x 5 min.
  4. Inkubieren Sie in einer Blocklösung, die 10% normales Eselserum (NDS)/1% Rinderserumalbumin (BSA)/0,1% Triton X-100 für 45 min bei RT enthält.
    1. Fügen Sie 50 μL einer Blocklösung pro Deckglas mit einem Durchmesser von 10 mm hinzu.
  5. Primäre Antikörper in 1% NDS/1% BSA/0,1% TritonX-100 in den folgenden Verdünnungen herstellen: Maus-Anti-GFAP 1:300, Ziegen-Anti-Iba1 1:500. Inkubieren Sie die Zellen mit primären Antikörpern über Nacht bei +4 °C.
  6. Spülen in PBS, 3 x 10 Min.
  7. Inkubieren Sie mit den sekundären Antikörpern, die mit einem Fluorophor konjugiert sind: Esel-Anti-Maus (Anregung 488 nm [1:200])) oder Esel-Anti-Ziege (angeregt bei 647 nm [1:200)). Inkubieren Sie die Zellen für 2 h bei RT im Dunkeln.
  8. Waschen in PBS, 7 x 5 Min.
  9. Inkubieren Sie die Zellen mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, 1:4.000) für 10 min bei RT.
  10. Waschen in PBS 5 x 5 min.
  11. Montieren Sie die Deckgläser mit einer Montagelösung auf Objektträgern; Verwenden Sie einen Tropfen davon pro Deckglas.
    HINWEIS: Antikörperverdünnungen können je nach Hersteller variieren. Anwender müssen optimale Verdünnungen für ihre Experimente bestimmen.

3. Zeitraffer-Video-Imaging

HINWEIS: Lösungen, die den Fluoreszenzfarbstoff enthalten, sollten vor direktem Licht geschützt werden. Bevor Sie mit dem bildgebenden Experiment beginnen, stellen Sie sicher, dass sich das Glasdeckglas beim Einschalten der Perfusion nicht bewegt.

  1. Herstellung von Lösungen und Zellen
    1. Extrazelluläre Lösung (ECS) für die Bildgebung vorbereiten: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCal 2, 2 mM MgCl2, 10 mM D-Glucose und 10 mM HEPES. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein. Stellen Sie sicher, dass die Osmolarität 280-300 mOsm/kg beträgt und bereiten Sie ECS ohne Ca2+ vor: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM D-Glucose, 10 mM HEPES und 0,1 mM EGTA.
    2. Bereiten Sie die Testlösungen vor: 100 μM ATP gelöst in ECS, 1 μM Thg in ECS ohne Ca2+ und 0,1 mg/ml ALS IgG in ECS8.
    3. Ein Deckglas mit ECS in eine Schale geben, um das komplette DMEM auszuwaschen. Die Farbstoffbeladungslösung wird hergestellt, indem 1 mM Stammlösung von Fluo-4 AM mit ECS auf die Endkonzentration von 5 μM Fluo-4 AM verdünnt wird.
      1. Legen Sie das Deckglas mit Zellen für 30 min bei RT im Dunkeln in die Farbstoffladelösung. Waschen Sie die Zellen 20 min in ECS.
    4. Wenn die Zellen nicht ausreichend belastet sind (d. h. wenn der basale Fluoreszenzpegel zu niedrig ist <5% des Dynamikumfangs der Kamera bei einer Belichtungszeit von mehr als 400 ms), erhöhen Sie die Ladezeit auf bis zu 45 min bis 1 h bei 37 °C. Alternativ kann die Fluo-4 AM-Stammlösung mit einem gleichen Volumen von 20% (w/v) Reinigungsmittel (Pluronic) in DMSO gemischt werden, bevor sie in ECS verdünnt wird, wobei die endgültige Pluronic-Konzentration ~0,02% beträgt.
      HINWEIS: Die experimentellen Beispiele dieser Studie wurden mit humanem IgG durchgeführt, das aus Blutseren von ALS-Patienten isoliert wurde, wie zuvorbeschrieben 4,5,11. Jedes Experiment wurde mit IgG-Proben eines einzelnen Patienten durchgeführt.
  2. Video-Imaging
    HINWEIS: In diesem Protokoll wurde das Video-Imaging-System mit einer Xenon-Kurzbogenlampe, einem Polychromatorsystem und einem inversen Epifluoreszenzmikroskop kombiniert, das mit Wasser-, Glycerin- und Ölimmersionsobjektiv ausgestattet ist. Die Zeitrafferaufnahmen wurden mit einem Digitalkamerasystem durchgeführt.
    1. Schalten Sie die Komponenten des Bildgebungsaufbaus 15 Minuten vor dem Experiment ein, damit das System die Arbeitstemperatur erreichen kann.
    2. Legen Sie das Deckglas mit 1 mL Arbeitslösung (ECS oder ECS ohne Ca2+) in die Aufnahmekammer.
    3. Um das richtige Bildgebungsprotokoll auszuwählen, öffnen Sie die Bildgebungssoftware und wählen Sie im Erfassungsbereich die Filterpaare für Fluo4-AM mit einer Anregungswellenlänge bei 480 nm, einem dichroitischen Spiegel bei 505 nm und einer Emissionswellenlänge bei 535 nm aus.
    4. Wählen Sie das Sichtfeld und achten Sie darauf, dass während des gesamten Experiments eine konsistente Anzahl von Zellen vorhanden ist. Stellen Sie die Belichtungszeit und die Detektorverstärkung entsprechend ein, so dass das Signal nicht gesättigt wird. Wählen Sie den Pseudofarbmodus für die Erfassung. Ausführlichere Anweisungen finden Sie im Handbuch des Herstellers.
    5. Stellen Sie die Abtastrate auf 1 Hz (1 Bild pro Sekunde) ein.
    6. Beginnen Sie die Bildgebung, indem Sie den basalen Fluoreszenzspiegel für 3-5 min für die Baseline-Bestimmung (F0) erfassen. Stellen Sie einen konstanten Fluss der Arbeitslösung sicher.
    7. Stoppen Sie den Fluss der Arbeitslösung und wechseln Sie für die gewünschte Zeit zur Testlösung (siehe auch Zeitbalken in den Beispielen von Abbildung 2 und Abbildung 3). Zwischen den einzelnen Testlösungen die Zellen mit einem konstanten Fluss der Arbeitslösung für 3-5 min waschen.
    8. Halten Sie das Lösungsvolumen in der Aufnahmekammer bei ~1 ml, indem Sie eine konstante Absaugung von der Oberseite der Lösung veranlassen (siehe Abbildung 2E).
      HINWEIS: Um die Behandlung direkt auf die abgebildeten Zellen anzuwenden, wurde ein kundenspezifisches Abgabesystem aus einer Glaspipette (0,8 mm Innendurchmesser) ~350 μm entfernt und ~1 mm über den Zellen in einem Winkel von 45° positioniert, kombiniert mit dem Lösungsaustauschsystem mit Quetschventilen und einer elektronischen Ventilsteuerung (siehe Abbildung 2E).

4. Datenanalyse

  1. Definieren Sie eine Region of Interest (ROI), die der einzelnen Zelle entspricht.
    1. Wählen Sie den Rahmen mit der höchsten Signalintensität (d. h. aus der Anwendung von ATP) und umgeben Sie eine Zelle mit dem Polygonal Tool. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Zellen im erfassten Feld. Wählen Sie mit dem Kreiswerkzeug fünf ROIs im Hintergrund aus.
    2. Um die mittlere Signalintensität einer einzelnen Zelle und den Hintergrund für jeden Zeitraum zu messen, wählen Sie alle ROIs aus und verwenden Sie den Befehl Multi Measure im ROI Manager in ImageJ oder einen gleichwertigen Befehl in kommerzieller Software (siehe Materialtabelle).
  2. Exportieren Sie die mittleren Signalintensitätswerte der ROIs als Tabelle.
  3. Durchschnittlich fünf Hintergrund-ROIs und subtrahieren Sie den gemittelten Hintergrund jedes Frames von der mittleren ROI-Intensität des gleichzeitig erfassten Frames.
  4. Um die erhaltenen Daten auf das Basisliniensignal zu normalisieren, verwenden Sie Gleichung (1):
    ΔF/F 0 = (F - F 0)/F0 (1)
    wobei F die Signalintensität jedes Zeitrahmens nach Hintergrundsubtraktion und F0 die Basislinie Fluo-4-Fluoreszenz ist.
    HINWEIS: In dieser Studie wurde ein benutzerdefinierter Code verwendet.
  5. Um die Calciumaktivität zu analysieren, bestimmen Sie mehrere Parameter4: die Amplitude des Calciumpeaks (ΔF/F 0), die integrierte Änderung (Zeitintegral, Oberfläche unter der Antwortaufzeichnung) des Calciumtransienten (ΔF/F 0 × s), die Zeit bis zur Spitze vom Beginn der Stimulation bis zum Maximum des Kalziumtransienten (s), die Anstiegszeit vom Beginn der Stimulation bis zum Wert von ΔF/F 0 Das erreicht 50% -80% der maximalen Amplitude (s), halbe Breite voller Breite eines Transienten bei halbmaximaler Amplitude (s), Frequenz der Antworten, wenn sie sich wiederholen (Hz).

Ergebnisse

Charakterisierung verschiedener Gliazelltypen in Kultur
Es dauert normalerweise 15-21 Tage, um Astrozyten für Experimente zu produzieren, während Mikrogliazellen 10-15 Tage brauchen, um zu wachsen. Eine Immunfärbung wurde durchgeführt, um die Zellreinheit der Kultur zu beurteilen. Abbildung 1 zeigt die Expression der Doppelmarkierung des astrozytären Markers GFAP und des Mikrogliamarkers Iba1 in jeweiligen Kulturen.

Es ist bekannt, dass di...

Diskussion

In diesem Artikel wird die Methode der primären Zellkultivierung als schnelles und "budgetgerechtes" Werkzeug zur Untersuchung verschiedener Aspekte der Zell(patho)physiologie wie ALS im hSOD1G93A-Modell der Ratte vorgestellt. Die Technik eignet sich daher für Studien auf Einzelzellebene, die auf einer höheren Organisationsebene (d.h. in Gewebeschnitten oder in einem lebenden Tier) extrapoliert und weiter untersucht werden können. Die Zellkultivierung als Technik hat jedoch einige Vorbehalte. Es ist am wic...

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Bildung, Wissenschaft und technologische Entwicklung Republik Serbien Vertrag Nr. 451-03-9/2021-14/ 200178, dem FENS - NENS Education and Training Cluster-Projekt "Trilateral Course on Glia in Neuroinflammation" und dem EC H2020 MSCA RISE Grant #778405 unterstützt. Wir danken Marija Adžić und Mina Perić für die Bereitstellung der immunhistochemischen Bilder und Danijela Bataveljić für die Hilfe beim Schreiben von Papieren.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL tubeSarstedt, Germany62 554 502
2 mL tubeSarstedt, Germany72.691
21 G needleNipro, JapanHN-2138-ET
23 G needleNipro, JapanHN-2338-ET
5 mL syringeNipro, JapanSY3-5SC-EC
6 mm circular glass coverslipMenzel Glasser, Germany630-2113
60 mm Petri dishThermoFisher Sientific, USA130181
ATPSigma-Aldrich, GermanyA9062
AxioObserver A1Carl Zeiss, Germany
Bovine serum albumineSigma-Aldrich, GermanyB6917
Calcium chlorideSigma-Aldrich, Germany2110
CentrifugeEppendorf, Germany
DAPISigma-Aldrich, Germany10236276001
D-glucoseSigma-Aldrich, Germany158968
DMEMSigma-Aldrich, GermanyD5648
Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibodyInvitrogen, USAA-21447
Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibodyInvitrogen, USAA-21202
EDTASigma-Aldrich, GermanyEDS-100G
EGTASigma-Aldrich, GermanyE4378
”evolve”-EM 512 Digital Camera SystemPhotometrics, USA
Fetal bovine serum (FBS)Gibco, ThermoFisher Scientific, USA10500064
Fiji ImageJ SoftwareOpen source under the GNU General Public Licence
FITC filter setChroma Technology Inc., USA
Fluo-4 AMMolecular Probes, USAF14201
Goat anti-Iba1Fujifilm Wako Chemicals, USA011-27991
HEPESBiowest, FranceP5455
HighSpeed Solution Exchange SystemALA Scientific Instruments, USA
IncubatorMemmert GmbH + Co. KG, Germany
Magnesium chlorideSigma-Aldrich, GermanyM2393
Matlab softwareMath Works, USA
Mouse anti-GFAPMerck Millipore, USAMAB360
Mowiol 40-88Sigma-Aldrich, Germany324590
Normal donkey serumSigma-Aldrich, GermanyD9663
ParaformaldehydeSigma-Aldrich, Germany158127
Penicilin and StreptomycinThermoFisher Sientific, USA15140122
Poly-L-lysineSigma-Aldrich, GermanyP5899
Potassium chlorideSigma-Aldrich, GermanyP5405
Potassium dihydrogen phosphateCarlo Erba Reagents, Spain471686
Shaker DELFIA PlateShakePerkinElmer Life Sciencies, USA
Sodium bicarbonateSigma-Aldrich, GermanyS3817
Sodium chlorideSigma-Aldrich, GermanyS5886
Sodium phosphate dibasic heptahydrateCarl ROTH GmbHX987.2
Sodium pyruvateSigma-Aldrich, GermanyP5280
ThapsigargineTocris Bioscience, UK1138
Triton X - 100Sigma-Aldrich, GermanyT8787
TrypsinSigma-Aldrich, GermanyT4799
Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520Wescor, ELITechGroup Inc., USA
ViiFluor Imaging SystemVisitron System Gmbh, Germany
VisiChrome Polychromator SystemVisitron System Gmbh, Germany
VisiView high performance setupVisitron System Gmbh, Germany
Xenon Short Arc lampUshio, Japan

Referenzen

  1. Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
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