Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

قمنا بتطوير فحص مراسل التكوين الحيوي للحمض النووي الريبوزي المرسال الميكروي الإنتروني لاستخدامه في الخلايا في المختبر مع أربعة بلازميدات: واحد مع miRNA intronic ، واحد مع الهدف ، واحد للمبالغة في التعبير عن بروتين تنظيمي ، وواحد ل Renilla luciferase. تمت معالجة miRNA ويمكنه التحكم في تعبير luciferase عن طريق الارتباط بالتسلسل المستهدف.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) هي جزيئات RNA قصيرة منتشرة على نطاق واسع في حقيقيات النوى. يتم نسخ معظم miRNAs من الإنترونات ، ويتضمن نضجها بروتينات مختلفة مرتبطة بالحمض النووي الريبي في النواة. غالبا ما تتوسط الحمض النووي الريبوزي المرسال الناضج في إسكات الجينات ، وقد أصبح هذا أداة مهمة لفهم أحداث ما بعد النسخ. إلى جانب ذلك ، يمكن استكشافه كمنهجية واعدة للعلاجات الجينية. ومع ذلك ، هناك حاليا نقص في الطرق المباشرة لتقييم تعبير miRNA في مزارع خلايا الثدييات. هنا ، نصف طريقة فعالة وبسيطة تساعد في تحديد التكوين الحيوي للحمض النووي الريبوزي المرسال ونضجه من خلال تأكيد تفاعله مع التسلسلات المستهدفة. أيضا ، يسمح هذا النظام بفصل نضج miRNA الخارجي عن نشاطه الداخلي باستخدام مروج مستحث للدوكسيسيكلين قادر على التحكم في نسخ miRNA الأولي (pri-miRNA) بكفاءة عالية وتكلفة منخفضة. تسمح هذه الأداة أيضا بالتشكيل باستخدام بروتينات ربط الحمض النووي الريبي في بلازميد منفصل. بالإضافة إلى استخدامه مع مجموعة متنوعة من miRNAs المختلفة وأهدافها الخاصة ، يمكن تكييفها مع خطوط الخلايا المختلفة ، شريطة أن تكون قابلة للنقل.

Introduction

يعد ربط الحمض النووي الريبوزي المرسال السلائف عملية مهمة لتنظيم التعبير الجيني في حقيقيات النوى1. يتم تحفيز إزالة الإنترونات واتحاد الإكسونات في الحمض النووي الريبي الناضج بواسطة spliceosome ، وهو مركب بروتين ريبي نووي 2 ميجادالتون يتكون من 5 snRNAs (U1 و U2 و U4 و U5 و U6) إلى جانب أكثر من 100 بروتين 2,3. يحدث تفاعل الربط بشكل مشترك ، ويتم تجميع spliceosome في كل إنترون جديد مسترشدا بالتعرف على مواقع الربط المحفوظة عند حدود exon-intron وداخل intron4. قد يكون للإنترونات المختلفة معدلات ربط مختلفة على الرغم من الحفظ الملحوظ لمجمع spliceosome ومكوناته. بالإضافة إلى الاختلافات في الحفاظ على موقع الربط ، يمكن للتسلسلات التنظيمية الموزعة على الإنترونات والإكسونات توجيه البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي (RBP) وتحفيز أو قمع الربط 5,6. HuR هو RBP يتم التعبير عنه في كل مكان وهو عامل مهم للتحكم في استقرار mRNA7. أظهرت النتائج السابقة من مجموعتنا أن HuR يمكن أن يرتبط بالإنترونات التي تحتوي على miRNAs ، مما يشير إلى أن هذا البروتين قد يكون عاملا مهما لتسهيل معالجة miRNA ونضجه ، مما يؤدي أيضا إلى توليد أشكال ربط بديلة 6,8,9.

يتم ترميز العديد من microRNAs (miRNAs) من تسلسلات إنترونية. في حين أن بعضها جزء من الإنترون ، فإن البعض الآخر يعرف باسم "mirtrons" ويتم تشكيله بواسطة intron10,11 بأكمله. miRNAs هي RNAs قصيرة غير مشفرة ، تتراوح من 18 إلى 24 نيوكليوتيدات في الطول12. يظهر تسلسلها الناضج تكاملا جزئيا أو كليا مع التسلسلات المستهدفة في mRNAs ، مما يؤثر على الترجمة و / أو معدلات اضمحلال mRNA. مجموعات من miRNAs والأهداف تدفع الخلية إلى نتائج مختلفة. يمكن للعديد من miRNAs دفع الخلايا إلى الأنماط الظاهرية المؤيدة أو المضادة للوذكور13. عادة ما تستهدف miRNAs السرطانية المنشأ mRNAs التي تؤدي إلى خاصية قمعية ، مما يؤدي إلى زيادة الانتشار الخلوي والهجرة والغزو14. من ناحية أخرى ، قد تستهدف miRNAs المثبطة للورم mRNAs المسببة للأورام أو mRNAs المتعلقة بزيادة انتشار الخلايا.

تعتمد معالجة ونضج miRNAs أيضا على أصلها. تتم معالجة معظم miRNAs الإنترونية بمشاركة المعالج الدقيق ، الذي يتكون من الريبونوكلياز دروشا والعوامل المساعدة للبروتين12. تتم معالجة Mirtrons مع نشاط spliceosome بشكل مستقل عن Drosha15. بالنظر إلى التردد العالي لل miRNAs الموجودة داخل الإنترونات ، افترضنا أن البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي المشاركة في الربط يمكن أن تسهل أيضا معالجة ونضج هذه miRNAs. والجدير بالذكر أن RBP hnRNP A2 / B1 قد ارتبط بالفعل بالمعالج الدقيق والتكوين الحيوي miRNA16.

لقد أبلغنا سابقا أن العديد من البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي ، مثل hnRNPs و HuR ، ترتبط بالحمض النووي الريبوزي المرسال الاستبطاني بواسطة مطياف الكتلة17. تم تأكيد ارتباط HuR (ELAVL1) مع miRNAs من الكتلة الإنترونية miR-17-92 باستخدام الترسيب المناعي وفي تحليل سيليكو 9. miR-17-92 هي مجموعة miRNA إنترونية تتكون من ستة miRNAs مع زيادة التعبير في أنواع السرطان المختلفة18,19. تعرف هذه المجموعة أيضا باسم "oncomiR-1" وتتكون من miR-17 و miR-18a و miR-19 a و miR-20 و miR-19 b و miR-92 a. miR-19 a و miR-19b هي من بين أكثر miRNAs ورمية المنشأ في هذه المجموعة 19. زيادة التعبير عن HuR يحفز miR-19a و miR-19b التوليف9. نظرا لأن المناطق الإنترونية المحيطة بهذه المجموعة مرتبطة ب HuR ، فقد طورنا طريقة للتحقيق فيما إذا كان هذا البروتين يمكن أن ينظم تعبير ونضج miR-19a و miR-19b. كان أحد التنبؤات المهمة لفرضيتنا هو أنه ، كبروتين تنظيمي ، يمكن أن يسهل HuR التكوين الحيوي miRNA ، مما يؤدي إلى تغييرات في النمط الظاهري. كان أحد الاحتمالات هو أن miRNAs تمت معالجتها عن طريق تحفيز HuR ولكنها لن تكون ناضجة ووظيفية ، وبالتالي ، فإن آثار البروتين لن تؤثر بشكل مباشر على النمط الظاهري. لذلك ، قمنا بتطوير فحص مراسل الربط للتحقيق فيما إذا كان RBP مثل HuR يمكن أن يؤثر على التكوين الحيوي ونضج miRNA الإنتروني. من خلال تأكيد معالجة miRNA ونضجها ، يظهر فحصنا التفاعل مع التسلسل المستهدف وتوليد miRNA ناضج ووظيفي. في فحصنا ، نقوم بإقران التعبير عن مجموعة miRNA الإنترونية مع بلازميد luciferase للتحقق من وجود ربط مستهدف miRNA في الخلايا المستزرعة.

Protocol

ويرد في الشكل 1 عرض عام للبروتوكول الموصوف هنا.

1. بناء البلازميد

  1. pCAGGS-Cre: تم توفير هذا البلازميد من قبل الدكتور E. Makeyev21.
  2. pRD-miR-17-92:
    1. قم بتضخيم ما قبل miR-17-92 بواسطة PCR باستخدام 0.5 ميكرومتر من كل تمهيدي محدد (جدول المواد) ، و 150 نانوغرام من cDNA ، و 1 mM dNTPs ، و 1x Taq PCR buffer ، و 5 U من بوليميراز الحمض النووي Taq عالي الدقة. قم بإجراء تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل بدون قالب (استخدم الماء بدلا من cDNA) للتحقق من تلوث الحمض النووي.
    2. قم بتحويل منتج PCR إلى pRD-RIPE (يرجى تقديمه من قبل الدكتور E. Makiev ، جامعة نانيانغ التكنولوجية ، سنغافورة)21 داخل الإنترون بين مواقع تقييد EcoRI و EcoRV باستخدام ligase الحمض النووي ، مما أدى إلى إنشاء pRD-miR-17-92. تأكد من سلامة التسلسل عن طريق تسلسل Sanger.
  3. pmiRGLO-RAP-IB
    1. تصميم الاشعال الأمامية والخلفية محاطة بمواقع تقييد XhoI / XbaI ومع موقع تقييد NotI واحد في الداخل. اخلطي كميات متساوية من الاشعال الأمامية والخلفية واحتضني الخليط عند 90 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم انقليه إلى 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. كعناصر تحكم ، استخدم الاشعال مع تسلسلات الهدف المخلوطة (جدول المواد).
    2. قم بشق الشظايا الملدنة باستخدام إنزيمات تقييد XhoI / XbaI وقم بتحويلها إلى مجرى تسلسل luc2 في pmiR-GLO ، مما أدى إلى إنشاء مراسل PMIRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR (Luc-RAP-1B) و PMIRGLO-SCRAMBLED-3ʹ-UTR (Luc-scrambled). تأكيد الربط مع انقسام NotI.
      ملاحظة: تأكد من أن المعلقات التي تم إنشاؤها بعد التلدين التمهيدي مكملة للمتجه بعد تفاعل الانقسام.
  4. pFLAG-HuR
    1. لتوليد بلازميد HuR مفرط في التعبير ، قم بتضخيم تسلسل HuR باستخدام مواد تمهيدية محددة. امزج 300 نانوغرام من cDNA ، و 0.5 ميكرومتر من كل تمهيدي محدد ، ومزيج 1 mM dNTPs ، ومخزن مؤقت PCR 1x ، و 5 U من بوليميراز الحمض النووي Taq عالي الدقة.
    2. قم بتحويل منتج PCR إلى pGEM-T وتأكد من سلامة تسلسل الحمض النووي عن طريق تسلسل Sanger. قم بإزالة جزء HuR من pGEM-T وقم باستنساخه إلى متجه تعبير الثدييات pFLAG-CMV-3 لإنشاء متجه pFLAG-HuR.

2. زراعة الخلايا

ملاحظة: كان خط خلايا HeLa-Cre هدية من الدكتور E. Makeyev21 ، وتم تقديم خلية سرطان الغدة الدرقية الحليمية (BCPAP) من قبل الدكتور ماسيمو سانتورو (جامعة "Federico II" ، نابولي ، إيطاليا). تم استخدام خلية HeLa وخلية سرطان الغدة الدرقية الحليمية (BCPAP) و HEK-293T للمبالغة في التعبير عن HuR.

  1. الحفاظ على الخلايا في DMEM / الجلوكوز العالي مع 10 ٪ مصل البقر الجنين ، 1 mM بيروفات الصوديوم ، 200 mM L-الجلوتامين ، و 1x البنسلين الستربتومايسين (100 U / مل البنسلين ، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين) في أطباق بتري 100 ملم ، ما لم يذكر خلاف ذلك. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة وخاضعة للتحكم في الغلاف الجوي (5٪ CO2).
  2. احتضان الخلايا الملتصقة بالتريبسين / EDTA (خليط محلول 0.5٪) عند 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق. دعهم ينفصلون عن اللوحة (يمكن أن تختلف فترة الحضانة وفقا لنوع الخلية).
  3. قم بإجراء عمليات نقل باستخدام كاشف نقل قائم على الدهون باتباع تعليمات الشركة المصنعة. تأكد من أن مزارع الخلايا متقاربة بنسبة 70٪ تقريبا. استخدم كميات مماثلة من الحمض النووي لجميع مجموعات النقل ، كما هو موضح أدناه ، عن طريق إضافة الحمض النووي المناسب. إجراء تجارب النقل في النسخ المتماثلة.
    1. امزج 200 نانوغرام من الحمض النووي و 1.25 ميكرولتر من كاشف النقل في 100 ميكرولتر من وسط الزرع. أضف خليط النقل إلى الخلايا. احتضن الخلايا بمخاليط النقل لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، استبدل الوسط بوسط يحتوي على 10٪ FBS ، واحتضنه لمدة 24 ساعة أخرى قبل إضافة المضادات الحيوية للاختيار.

3. التعبير الزائد عن الحد من المعلومات

  1. انقل pFLAG-HuR و pFLAG الفارغ إلى HeLa. حدد الخلايا عن طريق زيادة تركيز الجينيتيسين (G418) (1 ميكروغرام / مل) من 100 ميكروغرام / مل إلى 1000 ميكروغرام / مل ، مما يولد خطوط خلايا مستقرة.
  2. تأكد من الإفراط في التعبير باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي باستخدام مواد تمهيدية محددة ل HuR mRNA، كما هو موضح في الخطوة 7.

4. عزل الحمض النووي الريبي الكلي

  1. استخدم الخلايا التي تم جمعها حديثا. Trypsinize 70٪ مزارع الخلايا المتقاربة (لهذا الفحص ، تم استخدام خلايا HeLa-Cre) ، كما هو موضح في الخطوة 2.2.
  2. جمع بيليه الخلية عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 500 × غرام عند 4 درجات مئوية وغسلها مع 1x PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) ؛ كرر الطرد المركزي.
  3. أعد تعليق بيليه الخلية في 1 مل من 1x PBS وانقله إلى أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق 1.5 مل.
  4. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية.
  5. قم بوزن حبيبات الخلايا الجافة ، واضبط أحجام وحجم الأنابيب وفقا لذلك. 1 ملغ من الخلايا تنتج حوالي 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي.
  6. في غطاء محرك السيارة ، أضف 500-1000 ميكرولتر من الفينول / الكلوروفورم إلى حبيبة الخلية (من الناحية المثالية 750 ميكرولتر لكل 0.25 غرام من الخلايا) وتجانسها عن طريق السحب لأعلى ولأسفل والاختلاط مع الدوامة.
  7. احتضن الخليط لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (20 درجة مئوية إلى 25 درجة مئوية) للسماح بالتفكك الكامل لمجمعات البروتين النووي.
  8. جهاز طرد مركزي للعينة عند 500 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  9. انقل السوبرناتانت إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل وأضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم لكل 1 مل من الفينول: الكلوروفورم المستخدم. قم بتغطية أنابيب العينة بإحكام.
  10. اخلطي بقوة لمدة 15 ثانية (باليد أو بالدوامة لفترة وجيزة بسرعة أقل) واحتضنيها في درجة حرارة الغرفة (20 درجة مئوية إلى 25 درجة مئوية) لمدة دقيقتين إلى 3 دقائق.
  11. الطرد المركزي للعينات عند 12000 × g لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  12. تحقق من وجود مرحلة الفينول والكلوروفورم الأحمر السفلي ، ومرحلة وسيطة ، ومرحلة مائية علوية عديمة اللون. يبقى الحمض النووي الريبي في المرحلة المائية العليا. في غطاء محرك السيارة ، اجمع المرحلة المائية ، وتجنب الاتصال بالمرحلة الوسيطة ، وانقلها إلى أنبوب جديد.
  13. ترسب الحمض النووي الريبي عن طريق خلط المرحلة المائية مع 400 ميكرولتر من الأيزوبروبانول الجزيئي (نسبة 1: 1 إلى الفينول / الكلوروفورم المستخدم) و 2 ميكرولتر من الجليكوجين في كل أنبوب (سيساعد على تصور وجود الكرية).
  14. تخلط بقوة باليد أو تجانس مع طرف لمدة ~ 10 ثانية. احتضن لمدة 15 دقيقة أو بين عشية وضحاها عند -20 درجة مئوية.
  15. قم بالطرد المركزي للعينة عند 12000 × g لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية وتخلص من supernatant.
  16. اغسل حبيبات الحمض النووي الريبي عن طريق إضافة 3 أحجام من الإيثانول بنسبة 100٪ (حوالي 1 مل ، مخفف باستخدام ماء DEPC) واخلط العينة عن طريق الدوامة حتى يتم إطلاق الكريات وتطفو من القاع.
  17. جهاز طرد مركزي عند 7500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  18. اغسل حبيبة الحمض النووي الريبي 1x بإضافة 1 مل من الإيثانول بنسبة 75٪ واخلط العينة عن طريق الدوامة حتى يتم إطلاق الكريات وتطفو من القاع. كرر الطرد المركزي كما هو موضح في الخطوة 4.17.
  19. قم بإجراء دوران طرد مركزي إضافي لمدة 5 ثوان لجمع السائل المتبقي من جانب الأنبوب وإزالة أي سائل متبقي باستخدام ماصة دون إزعاج الكرية.
  20. جفف حبيبة الحمض النووي الريبي لفترة وجيزة في الهواء عن طريق فتح غطاء الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-5 دقائق وقم بإذابة حبيبة الحمض النووي الريبي في 20-50 ميكرولتر من الماء المعالج ب DEPC الخالي من RNase. احتضان الحمض النووي الريبي لمدة 10 دقائق عند 55-60 درجة مئوية لتسهيل إعادة تعليق الكرية.

5. تحديد إجمالي تركيز الحمض النووي الريبي والجودة

  1. أوجد تركيز الحمض النووي الريبي عن طريق قياس الامتصاص عند 260 نانومتر و280 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي. الحصول على بيانات الطيفية كاملة قبل استخدام العينات في التطبيقات النهائية.
  2. تحكم في جودة الحمض النووي الريبي عن طريق حل 800-1000 نانوغرام على هلام أغاروز بنسبة 1.5٪ باستخدام مخزن مؤقت 0.5X TBE (قاعدة Tris 45 mM ، وحمض البوريك 45 mM ، و 1 mM EDTA). ينقسم إجمالي الحمض النووي الريبي إلى نطاقين يشيران إلى 28S و 18S rRNAs.
    1. اصنع جميع الكواشف واغسل جميع المعدات المستخدمة لتشغيل الجل بالماء المعالج من DEPC. يتم تحضير المياه المعالجة من DEPC في غطاء المحرك عن طريق إضافة 1 مل من ثنائي إيثيل بيروكربونات إلى 1000 مل من الماء فائق النقاء. احتضان لمدة ~ 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو في 37 درجة مئوية والأوتوكلاف. يخزن في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 10 أشهر.
      ملاحظة: يؤدي الرحلان الكهربائي للحمض النووي الريبي الكلي للثدييات إلى فصل الحمض النووي الريبي 28S و 18S بنسبة 2: 1 تقريبا. يجب أن تكون الأشرطة سليمة ومرئية كشريطين حادين. سيؤدي الحمض النووي الريبي المتدهور إلى نطاقات ضبابية.

6. النسخ العكسي

  1. اضبط تفاعل النسخ العكسي باستخدام 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي.
  2. قم بإجراء النسخ العكسي (RT) باستخدام إنزيم النسخ العكسي (انظر جدول المواد) و 50 نانوغرام / ميكرولتر من الاشعال العشوائية decamer.
    1. امزج الحمض النووي الريبي والاشعال العشوائي ومزيج dNTP 1 mM (10 mM) في 10 ميكرولتر. أضف الكواشف التالية: 1x RT buffer و 5 mM MgCl2 و 10 mM DTT و 40 U من مثبط RNase و 200 U من النسخ العكسي.
    2. احتضن لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية ولمدة 1 ساعة عند 50 درجة مئوية (قد تتغير درجات الحرارة إذا تم استخدام إنزيمات مختلفة). قم بإنهاء التفاعل عن طريق الحضانة عند 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ويمكن تخزين cDNAs عند -20 درجة مئوية.

7. تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي

  1. لتجميع التفاعل في حجم نهائي من 15 ميكرولتر ، امزج 3 ميكرولتر من cDNA (100 نانوغرام / ميكرولتر) ، و 3.2 بمول من كل تمهيدي ، و 6 ميكرولتر من المزيج الرئيسي الذي يحتوي على dNTPs والإنزيم ، و 2.8 ميكرولتر من الماء فائق النقاء.
    ملاحظة: استخدم الاشعال للجينات التأسيسية الذاتية المنشأ كعناصر تحكم (جينات التدبير المنزلي) لتطبيع مستويات التعبير عن الحمض النووي الريبوزي المرسال (mRNA) والحمض النووي الريبوزي المرسال (miRNAs). β-أكتين و snRNA U6 (RNU6B) هي خيارات متاحة لتطبيع mRNAs و miRNAs ، على التوالي ، ولكن قد تكون الجينات الأخرى مناسبة أيضا حسب الحالة.
  2. حدد مستويات التعبير باستخدام طريقة دلتا-دلتا Ct (2-ΔΔCt)20.

8. فحص المراسل

  1. الخلايا المستخدمة في الفحص
    1. نقل البلازميدات في خلايا HeLa-Cre على النحو التالي. نقل مع pTK-رينيلا (40 نانوغرام)، ثم pRD-miR-17-92، وتوليد HeLa-Cre-miR-17-92، واختيار مع 1 ميكروغرام/مل بوروميسين.
    2. قم بنقل HeLa-Cre-miR-17-92-pTK-Renilla مع PMIRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR أو PMIRGLO-SCRAMBLED-3ʹ-UTR ، بشكل منفصل. اختر باستخدام البنسلين (100 وحدة / مل) والستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل). تولد هذه الترجمات Luc-RAP-1-B و Luc-scrambled.
    3. قم بنقل الخلايا باستخدام pFLAG-HuR أو pFLAG فارغ (الخطوة 3).
    4. انتقل إلى زراعة الخلايا ، كما هو مفصل في الخطوة 2.2.، مع HeLa-Cre miR-17-92-luc ، HeLa-Cre miR-17-92-scrambled ، HeLa-Cre miR-17-92-HuR ، و HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc حتى حوالي 80٪ من الالتقاء. الحث مع 1 ميكرولتر من الدوكسيسيكلين (1 ميكروغرام / مل) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. أيضا ، احتفظ بجميع الخلايا بدون دوكسيسيكلين كعناصر تحكم ، لنفس الفترة.
      ملاحظة: يعتمد التركيز النهائي للدوكسيسيكلين على خط الخلية الذي تختاره. فائض من الدوكسيسيكلين يمكن أن يكون ساما لخلايا الثدييات.
  2. فحص الإنارة
    1. لتحديد ومقارنة شدة التلألؤ المختلفة ، استخدم مجموعة فحص مراسل Dual-luciferase. قم بإذابة محاليل فحص luciferase واتركها في درجة حرارة الغرفة قبل البدء في الفحص.
    2. تحضير مزيج Stop و Glo (أنابيب الغطاء الأزرق) عن طريق خلط 200 ميكرولتر من الركيزة في 10 مل من Luciferase Assay Buffer II. تحضير مزيج LAR II (أنابيب الغطاء الأخضر) عن طريق خلط 10 مل من Luciferase مقايسة المخزن المؤقت II في قارورة العنبر من Luciferase فحص الركيزة II ورج جيدا.
    3. انقل المحاليل إلى أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل تم تحديدها مسبقا وحمايتها من الضوء.
      ملاحظة: كبديل ، يمكن تحضير المحاليل مسبقا في 1-2 مل من الأليكوتات وتجميدها عند -80 درجة مئوية محمية من الضوء في رقائق الألومنيوم.
    4. إجراء قراءات التلألؤ باستخدام معدات مثل Synergy ؛ قياس لوسيفيراز المعبر عنه كوحدات ضوئية نسبية (RLU).
    5. تصدير النتائج إلى جدول بيانات لمزيد من التحليل الإحصائي.
    6. قم بإجراء تطبيع نشاط اليراع - لوسيفيراز بواسطة التحكم رينيلا (لوسيفيراز / رينيلا) ورسم ذلك كوحدات ضوء نسبية (RLU) في رسم. كرر هذا للمجموعات مع وبدون تحريض الدوكسيسيكلين.
    7. احسب المتوسط والخطأ المعياري للمتوسط (SEM). قم بإجراء اختبار t للطالب أو ANOVA ثنائي الاتجاه متبوعا باختبار Tukey اللاحق للسماح بمقارنة المجموعة. تتوفر هذه التحليلات في حزمة مثل GraphPad Prism. تعتبر الاختلافات عند قيم p < 0.05 كبيرة.

النتائج

كانت فرضيتنا الأولية هي أن HuR يمكن أن يسهل التكوين الحيوي miRNA الإنتروني عن طريق الارتباط بتسلسل ما قبل miRNA. وبالتالي ، فإن اتصال تعبير HuR والتكوين الحيوي العنقودي miR-17-92 يمكن أن يشير إلى آلية جديدة تحكم نضج هذه miRNAs. تم تأكيد الإفراط في التعبير عن HuR عند نقل pFLAG-HuR في ثلاثة خطوط خلوية مختلفة: ...

Discussion

يعد ربط ما قبل الحمض النووي الريبوزي المرسال عملية مهمة لتنظيم التعبير الجيني ، ويمكن أن يؤدي التحكم فيه إلى تأثيرات قوية على تعديلات النمط الظاهري للخلية22,23. يتم نسخ أكثر من 70٪ من miRNAs من الإنترونات في البشر ، وافترضنا أنه يمكن تسهيل معالجتها ونضجها عن طريق ...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

يشعر المؤلفون بالامتنان ل E. Makeyev (جامعة نانيانغ التكنولوجية ، سنغافورة) لخلايا HeLa-Cre وبلازميدات pRD-RIPE و pCAGGS-Cre. نشكر إدنا كيمورا وكارولينا بورسيل غويس وجيزيلا راموس ولوسيا روسيتي لوبيز وأنسيلمو موريسكوت على دعمهم.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Recombinant DNA
pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid)A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pFLAG-HuRGenerated during this work
pmiRGLO-RAP-IBGenerated during this work
pmiRGLO-scrambledGenerated during this work
pRD-miR-17-92Generated during this work
pRD-RIPE-donorA kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pTK-RenillaPromegaE2241
Antibodies
anti-B-actinSigma AldrichA5316
anti-HuRCell SignalingmAb 12582
IRDye 680CW Goat anti-mouse IgGLi-Cor Biosciences926-68070
IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgGLi-Cor Biosciences929-70020
Experimental Models: Cell Lines
HeLa-CreA kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
HeLa-Cre miR17-92Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuRGenerated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR-lucGenerated during this work
HeLa-Cre miR17-92-lucGenerated during this work
HeLa-Cre miR17-92-scrambledGenerated during this work
Chemicals and Peptides
DMEM/high-glucoseThermo Fisher Scientific12800-017
DoxycyclineBioBasicMB719150
Dual-Glo Luciferase Assay SystemPromegaE2940
EcoRIThermo Fisher ScientificER0271
EcoRVThermo Fisher ScientificER0301
GeneticinThermo Fisher ScientificE859-EG
L-glutamineLife Technologies
Opti-MEM ILife Technologies31985-070
pFLAG-CMV™-3 Expression VectorSigma AldrichE6783
pGEM-TPromegaA3600
Platinum Taq DNA polymeraseThermo Fisher Scientific10966-030
pmiR-GLOPromegaE1330
PuromycinSigma AldrichP8833
RNAse OUTThermo Fisher Scientific752899
SuperScript IV kitThermo Fisher Scientific18091050
Trizol-LS reagentThermo Fisher10296-028
trypsin/EDTA 10XLife Technologies15400-054
XbaIThermo Fisher Scientific10131035
XhoIPromegaR616A
Oligonucleotides
forward RAP-1B pmiRGLOExxtendTCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG
CTACTATATCAGTTTGCACAT
reverse RAP-1B pmiRGLOExxtendCTAGATGTGCAAACTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward scrambled pmiRGLOExxtendTCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA
GCTACTATATCAGGGGTAAAAT
reverse scrambled pmiRGLOExxtendCTAGATTTTACCCCTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward HuR pFLAGExxtendGCCGCGAATTCAATGTCTAAT
GGTTATGAAGAC
reverse HuR pFLAGExxtendGCGCTGATATCGTTATTTGTG
GGACTTGTTGG
forward pre-miR-1792 pRD-RIPEExxtendATCCTCGAGAATTCCCATTAG
GGATTATGCTGAG
reverse pre-miR-1792 pRD-RIPEExxtendACTAAGCTTGATATCATCTTG
TACATTTAACAGTG
forward snRNA U6 (RNU6B)ExxtendCTCGCTTCGGCAGCACATATAC
reverse snRNA U6 (RNU6B)ExxtendGGAACGCTTCACGAATTTGCGTG
forward B-Actin qPCRExxtendACCTTCTACAATGAGCTGCG
reverse B-Actin qPCRExxtendCCTGGATAGCAACGTACATGG
forward HuR qPCRExxtendATCCTCTGGCAGATGTTTGG
reverse HuR qPCRExxtendCATCGCGGCTTCTTCATAGT
forward pre-miR-1792 qPCRExxtendGTGCTCGAGACGAATTCGTCA
GAATAATGTCAAAGTG
reverse pre-miR-1792 qPCRExxtendTCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC
TCAACAGGCCG
Software and Algorithms
Prism 8 for Mac OS XGraphpadhttps://www.graphpad.com
ImageJNational Institutes of Healthhttp://imagej.nih.gov/ij

References

  1. Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).
  2. Will, C. L., Luhrmann, R. Spliceosome structure and function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).
  3. Zhang, X., et al. An atomic structure of the human spliceosome. Cell. 169 (5), 918-929 (2017).
  4. Staley, J. P., Guthrie, C. Mechanical devices of the spliceosome: Motors, clocks, springs, and things. Cell. 92 (3), 315-326 (1998).
  5. Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
  6. Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 36-45 (2013).
  7. Mukherjee, N., et al. Integrative regulatory mapping indicates that the RNA-binding protein HuR couples pre-mRNA processing and mRNA stability. Molecular Cell. 43 (3), 327-339 (2011).
  8. Pandit, S., et al. Genome-wide analysis reveals SR protein cooperation and competition in regulated splicing. Molecular Cell. 50 (2), 223-235 (2013).
  9. Gatti da Silva, G. H., Dos Santos, M. G. P., Nagasse, H. Y., Coltri, P. P. Human antigen R (HuR) facilitates miR-19 synthesis and affects cellular kinetics in papillary thyroid cancer. Cellular Physiology and Biochemistry. 56, 105-119 (2022).
  10. Westholm, J. O., Lai, E. C. Mirtrons: MicroRNA biogenesis via splicing. Biochimie. 93 (11), 1897-1904 (2011).
  11. Michlewski, G., Cáceres, J. F. Post-transcriptional control of miRNA biogenesis. RNA. 25 (1), 1-16 (2019).
  12. Bartel, D. P. MicroRNAs: Target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  13. Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs - MicroRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
  14. Lin, S., Gregory, R. I. MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).
  15. Curtis, H. J., Sibley, C. R., Wood, M. J. Mirtrons, an emerging class of atypical miRNA. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (5), 617-632 (2012).
  16. Alarcon, C. R., et al. HNRNPA2B1 is a mediator of m(6)A-dependent nuclear RNA processing events. Cell. 162 (6), 1299-1308 (2015).
  17. Paiva, M. M., Kimura, E. T., Coltri, P. P. miR18a and miR19a recruit specific proteins for splicing in thyroid cancer cells. Cancer Genomics and Proteomics. 14 (5), 373-381 (2017).
  18. He, L., et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).
  19. Olive, V., et al. miR-19 is a key oncogenic component of mir-17-92. Genes & Development. 23 (24), 2839-2849 (2009).
  20. Livak, K. J., Schmittgen, T. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  21. Khandelia, P., Yap, K., Makeyev, E. V. Streamlined platform for short hairpin RNA interference and transgenesis in cultured mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12799-12804 (2011).
  22. Huelga, S. C., et al. Integrative genome-wide analysis reveals cooperative regulation of alternative splicing by hnRNP proteins. Cell Reports. 1 (2), 167-178 (2012).
  23. Karni, R., et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (3), 185-193 (2007).
  24. Franca, G. S., Vibranovski, M. D., Galante, P. A. Host gene constraints and genomic context impact the expression and evolution of human microRNAs. Nature Communications. 7, 11438 (2016).
  25. Havens, M. A., Reich, A. A., Hastings, M. L. Drosha promotes splicing of a pre-microRNA-like alternative exon. PLoS Genetics. 10 (5), 1004312 (2014).
  26. Grammatikakis, I., Abdelmohsen, K., Gorospe, M. Posttranslational control of HuR function. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).
  27. Chang, S. H., et al. ELAVL1 regulates alternative splicing of eIF4E transporter to promote postnatal angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18309-18314 (2014).
  28. Huang, Y. H., et al. Delivery of therapeutics targeting the mRNA-binding protein HuR using 3DNA nanocarriers suppresses ovarian tumor growth. Cancer Research. 76 (6), 1549-1559 (2016).
  29. Wang, W., Caldwell, M. C., Lin, S., Furneaux, H., Gorospe, M. HuR regulates cyclin A and cyclin B1 mRNA stability during cell proliferation. The EMBO Journal. 19 (10), 2340-2350 (2000).
  30. Guo, X., Connick, M. C., Vanderhoof, J., Ishak, M. A., Hartley, R. S. MicroRNA-16 modulates HuR regulation of cyclin E1 in breast cancer cells. International Journal of Molecular Sciences. 16 (4), 7112-7132 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved