JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы разработали интронный анализ биогенеза микроРНК, который будет использоваться в клетках in vitro с четырьмя плазмидами: одна с интронной миРНК, одна с мишенью, одна для сверхэкспрессии регуляторного белка и одна для люциферазы Renilla. МиРНК была обработана и могла контролировать экспрессию люциферазы путем связывания с целевой последовательностью.

Аннотация

МикроРНК (миРНК) представляют собой короткие молекулы РНК, которые широко распространены у эукариот. Большинство миРНК транскрибируются из интронов, и их созревание включает в себя различные РНК-связывающие белки в ядре. Зрелые микроРНК часто опосредуют глушение генов, и это стало важным инструментом для понимания посттранскрипционных событий. Кроме того, его можно исследовать как перспективную методологию генной терапии. Однако в настоящее время отсутствуют прямые методы оценки экспрессии миРНК в культурах клеток млекопитающих. Здесь мы описываем эффективный и простой метод, который помогает в определении биогенеза и созревания миРНК путем подтверждения ее взаимодействия с целевыми последовательностями. Кроме того, эта система позволяет отделить созревание экзогенной миРНК от ее эндогенной активности с помощью доксициклин-индуцируемого промотора, способного контролировать транскрипцию первичной миРНК (примиРНК) с высокой эффективностью и низкой стоимостью. Этот инструмент также позволяет модулировать РНК-связывающими белками в отдельной плазмиде. В дополнение к его использованию с различными миРНК и их соответствующими мишенями, он может быть адаптирован к различным клеточным линиям, при условии, что они поддаются трансфекции.

Введение

Сплайсинг мРНК-предшественников является важным процессом регуляции экспрессии генов у эукариот1. Удаление интронов и объединение экзонов в зрелой РНК катализируется сплайсеосомой, 2-мегадальтонным рибонуклеопротеиновым комплексом, состоящим из 5 snRNAs (U1, U2, U4, U5 и U6) вместе с более чем 100 белками 2,3. Реакция сплайсинга происходит совместно транскрипционно, и сплайсеосома собирается на каждом новом интроне, руководствуясь распознаванием законсервированных участков сращивания на границах экзон-интрона и внутри интрона4. Различные интроны могут иметь разную скорость сплайсинга, несмотря на замечательное сохранение комплекса сплайсеосом и его компонентов. В дополнение к различиям в сохранении места сращивания, регуляторные последовательности, распределенные на интронах и экзонах, могут направлять РНК-связывающие белки (RBP) и стимулировать или подавлять сплайсинг 5,6. HuR является повсеместно экспрессируемым RBP и является важным фактором для контроля стабильности мРНК7. Предыдущие результаты нашей группы показали, что HuR может связываться с интронами, содержащими миРНК, что указывает на то, что этот белок может быть важным фактором для облегчения обработки и созревания миРНК, что также приводит к генерации альтернативных изоформ сплайсинга 6,8,9.

Многие микроРНК (миРНК) кодируются из интронных последовательностей. В то время как некоторые из них являются частью интрона, другие известны как «миртроны» и образованы целым интроном10,11. миРНК представляют собой короткие некодирующие РНК, в диапазоне от 18 до 24 нуклеотидов длиной12. Их зрелая последовательность демонстрирует частичную или полную комплементарность с целевыми последовательностями в мРНК, что влияет на скорость трансляции и/или распада мРНК. Комбинации миРНК и мишеней приводят клетку к различным результатам. Несколько микроРНК могут приводить клетки к про- или противоопухолевым фенотипам13. Онкогенные миРНК обычно нацелены на мРНК, которые вызывают супрессивную характеристику, что приводит к увеличению клеточной пролиферации, миграции и инвазии14. С другой стороны, опухолеподавляющие миРНК могут быть нацелены на онкогенные мРНК или мРНК, связанные с повышенной пролиферацией клеток.

Обработка и созревание миРНК также зависят от их происхождения. Большинство интронных миРНК обрабатываются с участием микропроцессора, образованного рибонуклеазой дрошей и белковыми кофакторами12. Миртроны обрабатываются активностью сплайсеосомы независимо от Drosha15. Учитывая высокую частоту миРНК, обнаруженных в интронах, мы предположили, что РНК-связывающие белки, участвующие в сплайсинге, также могут способствовать обработке и созреванию этих миРНК. Примечательно, что RBP hnRNP A2/B1 уже ассоциируется с микропроцессором и биогенезом миРНК16.

Ранее мы сообщали, что несколько РНК-связывающих белков, таких как hnRNP и HuR, связаны с интронными миРНК с помощью масс-спектрометрии17. Связь HuR (ELAVL1) с миРНК из интронного кластера miR-17-92 была подтверждена с использованием иммунопреципитации и анализа in silico 9. miR-17-92 представляет собой интронный кластер миРНК, состоящий из шести миРНК с повышенной экспрессией при различных видах рака18,19. Этот кластер также известен как «oncomiR-1» и состоит из miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20, miR-19b и miR-92a. miR-19a и miR-19b являются одними из самых онкогенных миРНК этого кластера19. Повышенная экспрессия HuR стимулирует синтез miR-19a и miR-19b 9. Поскольку интронные области, фланкирующие этот кластер, связаны с HuR, мы разработали метод исследования того, может ли этот белок регулировать экспрессию и созревание miR-19a и miR-19b. Одним из важных предсказаний нашей гипотезы было то, что в качестве регуляторного белка HuR может способствовать биогенезу миРНК, что приводит к фенотипическим изменениям. Одна из возможностей заключалась в том, что миРНК были обработаны стимуляцией HuR, но не были зрелыми и функциональными, и, следовательно, эффекты белка не влияли непосредственно на фенотип. Поэтому мы разработали сращивающий репортерный анализ, чтобы выяснить, может ли RBP, такой как HuR, влиять на биогенез и созревание интронной миРНК. Подтверждая обработку и созревание миРНК, наш анализ показывает взаимодействие с целевой последовательностью и генерацию зрелой и функциональной миРНК. В нашем анализе мы соединяем экспрессию интронного кластера миРНК с плазмидой люциферазы, чтобы проверить связывание миРНК-мишеней в культивируемых клетках.

протокол

Обзор протокола, описанного здесь, показан на рисунке 1.

1. Плазмидная конструкция

  1. pCAGGS-Cre: Эта плазмида была предоставлена доктором Е. Макеевым21.
  2. пРД-миР-17-92:
    1. Амплифицируют премиР-17-92 с помощью ПЦР с использованием 0,5 мкМ каждого конкретного праймера (Таблица материалов), 150 нг кДНК, 1 мМ дНТП, 1x Taq ПЦР-буфера и 5 ЕД высокоточной Taq ДНК-полимеразы. Выполните реакцию ПЦР без шаблона (используйте воду вместо кДНК) для проверки загрязнения ДНК.
    2. Разложите продукт ПЦР в pRD-RIPE (любезно предоставленный доктором Е. Макеевым, Наньянский технологический университет, Сингапур)21 внутри интрона между участками ограничения EcoRI и EcoRV с использованием ДНК-лигазы, создавая pRD-miR-17-92. Подтверждение целостности последовательности с помощью секвенирования Сэнгера.
  3. пмиРГЛО-РАП-ИБ
    1. Проектируйте передние и обратные грунтовки, окруженные сайтами ограничения XhoI / XbaI и с одним сайтом ограничения NotI внутри. Смешайте эквимолярные количества прямой и обратной грунтовок и инкубируйте смесь при 90 °C в течение 5 мин, затем переведите до 37 °C в течение 15 мин. В качестве элементов управления используйте праймеры с зашифрованными целевыми последовательностями (Таблица материалов).
    2. Расщепляйте отожженные фрагменты с помощью ферментов рестрикции XhoI/XbaI и лигируйте их после последовательности luc2 на pmiR-GLO, генерируя репортерные конструкции pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR (Luc-RAP-1B) и pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR (Luc-scrambled). Подтвердите перевязку с расщеплением NotI.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что свесы, созданные после отжига грунтовки, дополняют вектор после реакции расщепления.
  4. пФЛАГ-Хур
    1. Чтобы создать сверхэкспрессирующую плазмиду HuR, усилите последовательность HuR специфическими праймерами. Смешайте 300 нг кДНК, 0,5 мкМ каждого конкретного праймера, смесь 1 мМ дНТП, 1 буфер ПЦР и 5 ЕД высокоточной ДНК-полимеразы Taq.
    2. Влифицируйте продукт ПЦР в pGEM-T и подтвердите целостность последовательности ДНК методом секвенирования Сэнгера. Удалите фрагмент HuR из pGEM-T и подключите его в вектор экспрессии млекопитающих pFLAG-CMV-3 для генерации вектора pFLAG-HuR.

2. Клеточная культура

ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточная линия HeLa-Cre была подарком от доктора Э. Макеева21 года, а папиллярная клетка рака щитовидной железы (BCPAP) была любезно предоставлена доктором Массимо Санторо (Университет «Федерико II», Неаполь, Италия). Клетка HeLa, папиллярная клетка рака щитовидной железы (BCPAP) и HEK-293T использовались для сверхэкспрессии HuR.

  1. Поддерживайте клетки в DMEM / высоком уровне глюкозы, дополненных 10% фетальной бычьей сывороткой, 1 мМ пирувата натрия, 200 мМ L-глутамина и 1x пенициллин-стрептомицин (100 Ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина) в чашках Петри по 100 мм, если не указано иное. Инкубировать клетки при 37 °C в увлажненном инкубаторе с контролируемой атмосферой (5% CO2).
  2. Инкубировать адгезивные клетки трипсином/ЭДТА (0,5% смесь растворов) при 37 °C в течение 3-5 мин. Пусть они отделяются от пластины (инкубационный период может варьироваться в зависимости от типа клетки).
  3. Выполняйте трансфекции с помощью трансфекционного реагента на основе липидов в соответствии с инструкциями производителя. Убедитесь, что клеточные культуры примерно на 70% сливаются. Используйте аналогичные количества ДНК для всех комбинаций трансфекции, как описано ниже, путем добавления соответствующих ДНК. Проводите эксперименты по трансфекции в репликах.
    1. Смешайте 200 нг ДНК и 1,25 мкл трансфекционного реагента в 100 мкл питательной среды. Добавьте трансфекционную смесь в ячейки. Инкубировать клетки с трансфекционными смесями в течение 4 ч при 37 °C. Затем замените среду средой, содержащей 10% FBS, и инкубируйте еще 24 ч, прежде чем добавлять антибиотики для селекции.

3. Гиперэкспрессия HuR

  1. Трансфект pFLAG-HuR и пустой pFLAG в HeLa. Отбор клеток путем увеличения концентрации генетикина (G418) (1 мкг/мл) со 100 мкг/мл до 1000 мкг/мл, генерируя стабильные клеточные линии.
  2. Подтвердите гиперэкспрессию количественной ПЦР с помощью специфических праймеров для HuR мРНК, как описано в шаге 7.

4. Тотальная изоляция РНК

  1. Используйте свежесобранные клетки. Трипсинизировать 70% сливающихся клеточных культур (для этого анализа использовались клетки HeLa-Cre), как описано на этапе 2.2.
  2. Собрать ячейку гранулы центрифугированием в течение 5 мин при 500 х г при 4 °C и промыть ее 1x PBS (фосфатно-буферным физиологическим раствором); повторить центрифугирование.
  3. Повторно суспендируйте ячейку гранулы в 1 мл 1x PBS и перенесите ее в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
  4. Центрифуга в течение 5 мин при 500 х г при 4 °C.
  5. Взвесьте гранулу сухой ячейки и соответствующим образом отрегулируйте объем и размер трубок. 1 мг клеток дает приблизительно 1 мкг общей РНК.
  6. В вытяжке добавляют 500-1000 мкл фенола/хлороформа в гранулу ячейки (в идеале 750 мкл на 0,25 г клеток) и гомогенизируют ее путем пипетирования вверх и вниз и смешивания с вихрем.
  7. Инкубировать смесь в течение 5 мин при комнатной температуре (от 20 °C до 25 °C) до полной диссоциации нуклеопротеиновых комплексов.
  8. Центрифугирование образца при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C.
  9. Перенесите супернатант в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл и добавьте 200 мкл хлороформа на 1 мл используемого фенола:хлороформа. Надежно закройте пробирки для образцов.
  10. Энергично перемешивать в течение 15 с (вручную или кратковременно вихря с меньшей скоростью) и инкубировать при комнатной температуре (от 20 °C до 25 °C) в течение 2 мин до 3 мин.
  11. Центрифугируйте образцы при 12 000 х г в течение 15 мин при 4 °C.
  12. Проверьте наличие нижней красной фенол-хлороформной фазы, промежуточной фазы и бесцветной верхней водной фазы. РНК остается в верхней водной фазе. В вытяжке соберите водную фазу, избегая контакта с промежуточной фазой, и переведите в свежую трубку.
  13. Осадите РНК путем смешивания водной фазы с 400 мкл изопропанола молекулярного класса (соотношение 1:1 к используемому фенолу/хлороформу) и 2 мкл гликогена в каждой пробирке (это поможет визуализировать присутствие гранулы).
  14. Энергично перемешайте вручную или гомогенизируйте наконечником в течение ~10 с. Инкубировать в течение 15 мин или на ночь при температуре −20 °C.
  15. Центрифугируйте образец при 12 000 х г в течение 20 мин при 4 °C и выбросьте супернатант.
  16. Промыть гранулу РНК, добавив 3 объема 100% этанола (примерно 1 мл, разбавленного водой DEPC) и перемешать образец путем вихря до тех пор, пока гранула не высвободится и не всплывет со дна.
  17. Центрифуга при 7 500 х г в течение 5 мин при 4 °C.
  18. Промыть гранулу РНК 1x, добавив 1 мл 75% этанола и перемешать образец путем вихря до тех пор, пока гранула не высвободится и не всплывет со дна. Повторите центрифугирование, как описано на этапе 4.17.
  19. Выполните дополнительное вращение центрифугирования на 5 с, чтобы собрать остаточную жидкость со стороны трубки и удалить любую остаточную жидкость пипеткой, не нарушая гранулу.
  20. Кратковременно высушите гранулу РНК на воздухе, открыв крышку трубки при комнатной температуре в течение 3-5 мин, и растворите гранулу РНК в 20-50 мкл воды, очищенной DEPC без РНКазы. Инкубируют РНК в течение 10 мин при 55-60 °C для облегчения повторного суспендирования гранулы.

5. Определение общей концентрации и качества РНК

  1. Определяют концентрацию РНК путем измерения абсорбции при 260 нм и 280 нм с помощью спектрофотометра. Получение полноспектральных данных перед использованием образцов в последующих приложениях.
  2. Контролируйте качество РНК путем разрешения 800-1000 нг на 1,5% агарозном геле с использованием буфера 0,5X TBE (45 мМ основания Tris, борной кислоты 45 мМ, 1 мМ ЭДТА). Общая РНК разделяется на две полосы, относящиеся к рРНК 28S и 18S.
    1. Сделайте все реагенты и промойте все оборудование, используемое для работы геля, водой, обработанной DEPC. Воду, обработанную DEPC, готовят в вытяжке путем добавления 1 мл диэтилпирокарбоната к 1000 мл сверхчистой воды. Инкубировать в течение ~2 ч при комнатной температуре или при 37 °C и автоклаве. Хранить при комнатной температуре до 10 месяцев.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Электрофорез общих РНК млекопитающих приводит к разделению рРНК 28S и 18S в соотношении приблизительно 2:1. Полосы должны быть неповрежденными и видимыми как две острые полосы. Деградированная РНК приведет к размытым полосам.

6. Обратная транскрипция

  1. Установите реакцию обратной транскрипции, используя 1 мкг общей РНК.
  2. Выполняют обратную транскрипцию (RT) с использованием фермента обратной транскриптазы (см. Таблицу материалов) и 50 нг/мкл случайных десятимерных праймеров.
    1. Смешайте РНК, случайные праймеры и смесь 1 мМ dNTP (10 мМ) в 10 мкл. Инкубировать при 65 °C в течение 5 мин и на льду в течение 1 мин. Добавьте следующие реагенты: 1x RT буфер, 5 мМ MgCl2, 10 мМ DTT, 40 ЕД ингибитора РНКазы и 200 ЕД обратной транскриптазы.
    2. Инкубировать в течение 10 мин при 25 °C и в течение 1 ч при 50 °C (температура может изменяться, если используются различные ферменты). Прекратить реакцию путем инкубации при 85 °C в течение 5 мин. cDNAs можно хранить при −20 °C.

7. Количественная ПЦР

  1. Чтобы собрать реакцию в конечном объеме 15 мкл, смешайте 3 мкл кДНК (100 нг/мкл), 3,2 пмоль каждого праймера, 6 мкл главной смеси, содержащей дНТП и фермент, и 2,8 мкл сверхчистой воды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте праймеры для эндогенных конститутивных генов в качестве контроля (гены ведения хозяйства) для нормализации уровней экспрессии мРНК HuR и миРНК. β-Актин и snRNA U6 (RNU6B) являются доступными вариантами нормализации мРНК и миРНК соответственно, но другие гены также могут быть подходящими в зависимости от случая.
  2. Количественно оценить уровни экспрессии с помощью метода20 дельта-дельта Ct (2-ΔΔCt).

8. Репортерский анализ

  1. Клетки, используемые для анализа
    1. Трансфектируйте плазмиды в клетках HeLa-Cre следующим образом. Трансфектируют pTK-Renilla (40 нг), затем pRD-miR-17-92, генерируя HeLa-Cre-miR-17-92, и выбирают с 1 мкг/мл пуромицина.
    2. Трансфектировать HeLa-Cre-miR-17-92-pTK-Renilla с pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR или pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR, отдельно. Выбирают с помощью пенициллина (100 Ед/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл). Эти трансфекции генерируют Luc-RAP-1-B и Luc-scrambled.
    3. Трансфектируйте ячейки с помощью pFLAG-HuR или пустого pFLAG (шаг 3).
    4. Перейдите к клеточной культуре, как описано в шаге 2.2., с HeLa-Cre miR-17-92-luc, HeLa-Cre miR-17-92-scrambled, HeLa-Cre miR-17-92-HuR и HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc примерно до 80% слияния. Индуцировать с 1 мкл доксициклина (1 мкг/мл) в течение 30 мин при 37 °C. Кроме того, держите все клетки без доксициклина в качестве контрольной части в течение того же периода.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация доксициклина зависит от клеточной линии выбора. Избыток доксициклина может быть токсичным для клеток млекопитающих.
  2. Люминесцентный анализ
    1. Для количественной оценки и сравнения различных интенсивностей люминесценции используйте набор для репортерного анализа Dual-luciferase. Разморозьте растворы люциферазы и оставьте их при комнатной температуре перед началом анализа.
    2. Приготовьте смесь Stop и Glo (трубки с синей крышкой), перемешав 200 мкл субстрата в 10 мл буфера анализа люциферазы II. Приготовьте смесь LAR II (зеленые колпачковые трубки), перемешав 10 мл люциферазного буфера анализа II в янтарный флакон люциферазного пробирного субстрата II и хорошо встряхните.
    3. Перенесите растворы в 15 мл центрифужных трубок, ранее идентифицированных и защищенных от света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы растворы могут быть предварительно приготовлены в 1-2 мл аликвот и заморожены при −80 °C, защищенные от света в алюминиевой фольге.
    4. Выполняйте показания люминесценции с помощью такого оборудования, как Synergy; измерение экспрессированной люциферазы в виде относительных световых единиц (RLU).
    5. Экспортируйте результаты в электронную таблицу для дальнейшего статистического анализа.
    6. Выполните нормализацию активности светлячка-люциферазы с помощью контрольной Рениллы (люциферазы/Ренилла) и постройте ее в виде относительных световых единиц (RLU) на графике. Повторите это для групп с индукцией доксициклина и без нее.
    7. Рассчитайте среднее и стандартную погрешность среднего значения (SEM). Выполните t-тест Student или двусторонний ANOVA, а затем пост-тест Tukey, чтобы обеспечить групповое сравнение. Эти анализы доступны в таком пакете, как GraphPad Prism. Различия при p-значениях < 0,05 считаются значительными.

Результаты

Наша первоначальная гипотеза заключалась в том, что HuR может способствовать интронному биогенезу миРНК путем связывания с ее премирнкальной последовательностью. Таким образом, связь экспрессии HuR и кластерного биогенеза miR-17-92 может указывать на новый механизм, управляющий созрев...

Обсуждение

Сплайсинг пре-мРНК является важным процессом для регуляции экспрессии генов, и его контроль может вызвать сильное воздействие на фенотипические модификации клеток22,23. Более 70% микроРНК транскрибируются из интронов у людей, и мы предположили, что их обра?...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов.

Благодарности

Авторы благодарны Е. Макееву (Наньянский технологический университет, Сингапур) за клетки HeLa-Cre и плазмиды pRD-RIPE и pCAGGS-Cre. Мы благодарим Эдну Кимуру, Каролину Перселл Гоус, Гизелу Рамос, Люсию Россетти Лопес и Ансельмо Морискота за их поддержку.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Recombinant DNA
pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid)A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pFLAG-HuRGenerated during this work
pmiRGLO-RAP-IBGenerated during this work
pmiRGLO-scrambledGenerated during this work
pRD-miR-17-92Generated during this work
pRD-RIPE-donorA kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pTK-RenillaPromegaE2241
Antibodies
anti-B-actinSigma AldrichA5316
anti-HuRCell SignalingmAb 12582
IRDye 680CW Goat anti-mouse IgGLi-Cor Biosciences926-68070
IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgGLi-Cor Biosciences929-70020
Experimental Models: Cell Lines
HeLa-CreA kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
HeLa-Cre miR17-92Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuRGenerated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR-lucGenerated during this work
HeLa-Cre miR17-92-lucGenerated during this work
HeLa-Cre miR17-92-scrambledGenerated during this work
Chemicals and Peptides
DMEM/high-glucoseThermo Fisher Scientific12800-017
DoxycyclineBioBasicMB719150
Dual-Glo Luciferase Assay SystemPromegaE2940
EcoRIThermo Fisher ScientificER0271
EcoRVThermo Fisher ScientificER0301
GeneticinThermo Fisher ScientificE859-EG
L-glutamineLife Technologies
Opti-MEM ILife Technologies31985-070
pFLAG-CMV™-3 Expression VectorSigma AldrichE6783
pGEM-TPromegaA3600
Platinum Taq DNA polymeraseThermo Fisher Scientific10966-030
pmiR-GLOPromegaE1330
PuromycinSigma AldrichP8833
RNAse OUTThermo Fisher Scientific752899
SuperScript IV kitThermo Fisher Scientific18091050
Trizol-LS reagentThermo Fisher10296-028
trypsin/EDTA 10XLife Technologies15400-054
XbaIThermo Fisher Scientific10131035
XhoIPromegaR616A
Oligonucleotides
forward RAP-1B pmiRGLOExxtendTCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG
CTACTATATCAGTTTGCACAT
reverse RAP-1B pmiRGLOExxtendCTAGATGTGCAAACTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward scrambled pmiRGLOExxtendTCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA
GCTACTATATCAGGGGTAAAAT
reverse scrambled pmiRGLOExxtendCTAGATTTTACCCCTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward HuR pFLAGExxtendGCCGCGAATTCAATGTCTAAT
GGTTATGAAGAC
reverse HuR pFLAGExxtendGCGCTGATATCGTTATTTGTG
GGACTTGTTGG
forward pre-miR-1792 pRD-RIPEExxtendATCCTCGAGAATTCCCATTAG
GGATTATGCTGAG
reverse pre-miR-1792 pRD-RIPEExxtendACTAAGCTTGATATCATCTTG
TACATTTAACAGTG
forward snRNA U6 (RNU6B)ExxtendCTCGCTTCGGCAGCACATATAC
reverse snRNA U6 (RNU6B)ExxtendGGAACGCTTCACGAATTTGCGTG
forward B-Actin qPCRExxtendACCTTCTACAATGAGCTGCG
reverse B-Actin qPCRExxtendCCTGGATAGCAACGTACATGG
forward HuR qPCRExxtendATCCTCTGGCAGATGTTTGG
reverse HuR qPCRExxtendCATCGCGGCTTCTTCATAGT
forward pre-miR-1792 qPCRExxtendGTGCTCGAGACGAATTCGTCA
GAATAATGTCAAAGTG
reverse pre-miR-1792 qPCRExxtendTCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC
TCAACAGGCCG
Software and Algorithms
Prism 8 for Mac OS XGraphpadhttps://www.graphpad.com
ImageJNational Institutes of Healthhttp://imagej.nih.gov/ij

Ссылки

  1. Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).
  2. Will, C. L., Luhrmann, R. Spliceosome structure and function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).
  3. Zhang, X., et al. An atomic structure of the human spliceosome. Cell. 169 (5), 918-929 (2017).
  4. Staley, J. P., Guthrie, C. Mechanical devices of the spliceosome: Motors, clocks, springs, and things. Cell. 92 (3), 315-326 (1998).
  5. Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
  6. Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 36-45 (2013).
  7. Mukherjee, N., et al. Integrative regulatory mapping indicates that the RNA-binding protein HuR couples pre-mRNA processing and mRNA stability. Molecular Cell. 43 (3), 327-339 (2011).
  8. Pandit, S., et al. Genome-wide analysis reveals SR protein cooperation and competition in regulated splicing. Molecular Cell. 50 (2), 223-235 (2013).
  9. Gatti da Silva, G. H., Dos Santos, M. G. P., Nagasse, H. Y., Coltri, P. P. Human antigen R (HuR) facilitates miR-19 synthesis and affects cellular kinetics in papillary thyroid cancer. Cellular Physiology and Biochemistry. 56, 105-119 (2022).
  10. Westholm, J. O., Lai, E. C. Mirtrons: MicroRNA biogenesis via splicing. Biochimie. 93 (11), 1897-1904 (2011).
  11. Michlewski, G., Cáceres, J. F. Post-transcriptional control of miRNA biogenesis. RNA. 25 (1), 1-16 (2019).
  12. Bartel, D. P. MicroRNAs: Target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  13. Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs - MicroRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
  14. Lin, S., Gregory, R. I. MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).
  15. Curtis, H. J., Sibley, C. R., Wood, M. J. Mirtrons, an emerging class of atypical miRNA. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (5), 617-632 (2012).
  16. Alarcon, C. R., et al. HNRNPA2B1 is a mediator of m(6)A-dependent nuclear RNA processing events. Cell. 162 (6), 1299-1308 (2015).
  17. Paiva, M. M., Kimura, E. T., Coltri, P. P. miR18a and miR19a recruit specific proteins for splicing in thyroid cancer cells. Cancer Genomics and Proteomics. 14 (5), 373-381 (2017).
  18. He, L., et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).
  19. Olive, V., et al. miR-19 is a key oncogenic component of mir-17-92. Genes & Development. 23 (24), 2839-2849 (2009).
  20. Livak, K. J., Schmittgen, T. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  21. Khandelia, P., Yap, K., Makeyev, E. V. Streamlined platform for short hairpin RNA interference and transgenesis in cultured mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12799-12804 (2011).
  22. Huelga, S. C., et al. Integrative genome-wide analysis reveals cooperative regulation of alternative splicing by hnRNP proteins. Cell Reports. 1 (2), 167-178 (2012).
  23. Karni, R., et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (3), 185-193 (2007).
  24. Franca, G. S., Vibranovski, M. D., Galante, P. A. Host gene constraints and genomic context impact the expression and evolution of human microRNAs. Nature Communications. 7, 11438 (2016).
  25. Havens, M. A., Reich, A. A., Hastings, M. L. Drosha promotes splicing of a pre-microRNA-like alternative exon. PLoS Genetics. 10 (5), 1004312 (2014).
  26. Grammatikakis, I., Abdelmohsen, K., Gorospe, M. Posttranslational control of HuR function. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).
  27. Chang, S. H., et al. ELAVL1 regulates alternative splicing of eIF4E transporter to promote postnatal angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18309-18314 (2014).
  28. Huang, Y. H., et al. Delivery of therapeutics targeting the mRNA-binding protein HuR using 3DNA nanocarriers suppresses ovarian tumor growth. Cancer Research. 76 (6), 1549-1559 (2016).
  29. Wang, W., Caldwell, M. C., Lin, S., Furneaux, H., Gorospe, M. HuR regulates cyclin A and cyclin B1 mRNA stability during cell proliferation. The EMBO Journal. 19 (10), 2340-2350 (2000).
  30. Guo, X., Connick, M. C., Vanderhoof, J., Ishak, M. A., Hartley, R. S. MicroRNA-16 modulates HuR regulation of cyclin E1 in breast cancer cells. International Journal of Molecular Sciences. 16 (4), 7112-7132 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены