JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פיתחנו בדיקת כתב ביוגנזה של מיקרו-רנ"א אינטרוני, שתשמש בתאים במבחנה עם ארבעה פלסמידים: אחד עם miRNA אינטרוני, אחד עם המטרה, אחד כדי לבטא יתר על המידה חלבון רגולטורי, ואחד עבור Renilla luciferase. ה-miRNA עובד ויכול היה לשלוט בביטוי לוציפראז על ידי קשירה לרצף המטרה.

Abstract

מיקרו-רנ"א (miRNAs) הן מולקולות רנ"א קצרות הנפוצות באאוקריוטים. רוב ה-miRNAs מתועתקים מאינטרונים, וההבשלה שלהם מערבת חלבונים קושרי RNA שונים בגרעין. miRNAs בוגרים מתווכים לעתים קרובות השתקת גנים, וזה הפך לכלי חשוב להבנת אירועים שלאחר שעתוק. מלבד זאת, ניתן לחקור אותה כמתודולוגיה מבטיחה לטיפולים גנטיים. עם זאת, כיום חסרות שיטות ישירות להערכת ביטוי miRNA בתרביות תאים של יונקים. במאמר זה נתאר שיטה יעילה ופשוטה המסייעת בקביעת הביוגנזה וההבשלה של miRNA באמצעות אישור האינטראקציה שלה עם רצפי מטרה. כמו כן, מערכת זו מאפשרת הפרדה של הבשלת miRNA אקסוגנית מהפעילות האנדוגנית שלה באמצעות מקדם דוקסיציקלין-אינדוקטיבי המסוגל לשלוט על שעתוק miRNA ראשוני (pri-miRNA) ביעילות גבוהה ובעלות נמוכה. כלי זה מאפשר גם אפנון עם חלבונים קושרי RNA בפלסמיד נפרד. בנוסף לשימוש בו עם מגוון של miRNAs שונים ואת המטרות שלהם בהתאמה, זה יכול להיות מותאם לקווי תאים שונים, בתנאי אלה מקובלים על transfection.

Introduction

שחבור mRNA מבשר הוא תהליך חשוב לוויסות ביטוי גנים באאוקריוטים1. הסרת אינטרונים ואיחוד האקסונים ברנ"א בוגר מזורזים על ידי ה-spliceosome, קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין של 2 מגה-דלטון המורכב מ-5 snRNAs (U1, U2, U4, U5 ו-U6) יחד עם יותר מ-100 חלבונים 2,3. תגובת השחבור מתרחשת באופן משותף, והשחבור מורכב בכל אינטרון חדש המונחה על ידי זיהוי אתרי שחבור משומרים בגבולות אקסון-אינטרון ובתוך האינטרון4. אינטרונים שונים עשויים להיות בעלי קצבי שחבור שונים למרות השימור המדהים של קומפלקס השחבור ומרכיביו. בנוסף להבדלים בשימור אתרי שחבור, רצפים רגולטוריים המופצים על אינטרונים ואקסונים יכולים להנחות חלבונים קושרי RNA (RBP) ולעורר או לדכא שחבור 5,6. HuR הוא RBP המבוטא בכל מקום והוא גורם חשוב לשליטה ביציבות mRNA7. תוצאות קודמות מהקבוצה שלנו הראו כי HuR יכול להיקשר לאינטרונים המכילים miRNAs, מה שמצביע על כך שחלבון זה עשוי להיות גורם חשוב המקל על עיבוד והבשלה של miRNA, מה שמוביל גם ליצירת איזופורמים חלופיים של שחבור 6,8,9.

מיקרו-רנ"א רבים (miRNAs) מקודדים מרצפים אינטרוניים. בעוד שחלקם הם חלק מהאינטרון, אחרים ידועים בשם "מיטרונים" ונוצרים על ידי כל האינטרון10,11. miRNAs הם רנ"א קצרים שאינם מקודדים, הנעים בין 18 ל-24 נוקלאוטידים באורך12. הרצף הבוגר שלהם מראה השלמה חלקית או מלאה עם רצפי מטרה ב-mRNA, ולכן משפיע על קצב התרגום ו/או הדעיכה של mRNA. השילובים של miRNAs ומטרות מניעים את התא לתוצאות שונות. מספר miRNAs יכולים להניע תאים לפנוטיפים פרו-או אנטי-גידוליים13. miRNAs אונקוגניים מתמקדים בדרך כלל ב-mRNA המעוררים מאפיין מדכא, מה שמוביל לשגשוג תאי מוגבר, נדידה ופלישה14. מצד שני, miRNAs מדכאי גידול עשויים להתמקד ב-mRNA אונקוגני או mRNA הקשורים לשגשוג מוגבר של תאים.

העיבוד וההבשלה של miRNAs תלויים גם במקורם. רוב miRNAs אינטרוניים מעובדים בהשתתפות המיקרו-מעבד, שנוצר על ידי ריבונוקלאז דרושה וקו-פקטורים של חלבון12. מיטרונים מעובדים עם פעילות של spliceosome ללא תלות Drosha15. בהתחשב בתדירות הגבוהה של miRNAs שנמצאים בתוך אינטרונים, שיערנו שחלבונים קושרי RNA המעורבים בשחבור יכולים גם להקל על העיבוד וההבשלה של miRNAs אלה. יש לציין כי ה-RBP hnRNP A2/B1 כבר נקשר למיקרו-מעבד ולביוגנזה של miRNA16.

דיווחנו בעבר כי מספר חלבונים קושרי RNA, כגון hnRNPs ו-HuR, קשורים ל-miRNAs אינטרוניים על ידי ספקטרומטריית מסה17. הקשר של HuR (ELAVL1) עם miRNAs מהצביר הפנימי miR-17-92 אושר באמצעות מיצוי חיסוני ובניתוח סיליקו 9. miR-17-92 הוא אשכול miRNA אינטרוני המורכב משישה miRNAs עם ביטוי מוגבר בסוגי סרטן שונים18,19. אשכול זה ידוע גם בשם "oncomiR-1" והוא מורכב מ- miR-17, miR-18 a, miR-19 a, miR-20, miR-19 b ו- miR-92 a. miR-19 a ו- miR-19 b הם בין ה- miRNAsהאונקוגניים ביותר של אשכול זה 19. הביטוי המוגבר של HuR מגרה את הסינתזה miR-19a ו-miR-19b 9. מאחר שאזורים אינטרוניים המקיפים את הצביר הזה קשורים ל-HuR, פיתחנו שיטה לחקור אם חלבון זה יכול לווסת את הביטוי וההבשלה של miR-19a ו-miR-19b. אחד התחזיות החשובות של ההשערה שלנו היה שכחלבון רגולטורי, HuR יכול להקל על ביוגנזה של miRNA, מה שמוביל לשינויים פנוטיפיים. אפשרות אחת הייתה ש-miRNAs עובדו על ידי גירוי של HuR אך לא יהיו בוגרים ומתפקדים, ולכן ההשפעות של החלבון לא ישפיעו ישירות על הפנוטיפ. לכן, פיתחנו בדיקת כתב שחבור כדי לחקור אם RBP כגון HuR יכול להשפיע על ביוגנזה והבשלה של miRNA אינטרוני. על ידי אישור עיבוד והבשלה של miRNA, הבדיקה שלנו מראה את האינטראקציה עם רצף המטרה ואת יצירת miRNA בוגר ומתפקד. בבדיקה שלנו, אנו משלבים את הביטוי של צביר miRNA אינטרוני עם פלסמיד לוציפראז כדי לבדוק אם יש קשירת מטרה של miRNA בתאים בתרבית.

Protocol

סקירה כללית של הפרוטוקול המתואר כאן מתוארת באיור 1.

1. בנייה פלסמידית

  1. pCAGGS-Cre: פלסמיד זה סופק על ידי ד"ר א. מקייב21.
  2. pRD-miR-17-92:
    1. הגבר pre-miR-17-92 על ידי PCR באמצעות 0.5 μM של כל פריימר ספציפי (טבלת חומרים), 150 ננוגרם של cDNA, 1 mM dNTPs, 1x Taq PCR buffer, ו 5 U של פולימראז DNA Taq בנאמנות גבוהה. בצע תגובת PCR ללא תבנית (השתמש במים במקום cDNA) כדי לבדוק אם יש זיהום DNA.
    2. הפוך את מוצר ה-PCR ל-pRD-RIPE (באדיבות ד"ר א. מקייב, האוניברסיטה הטכנולוגית נאניאנג, סינגפור)21 בתוך האינטרון בין אתרי ההגבלה EcoRI ו-EcoRV באמצעות ליגאז DNA, ליצירת pRD-miR-17-92. אשר את שלמות הרצף על-ידי ריצוף Sanger.
  3. pmiRGLO-RAP-IB
    1. עיצוב פריימרים קדימה ואחורה לצד אתרי הגבלה של XhoI/XbaI ועם אתר הגבלה אחד של NotI בפנים. מערבבים כמויות שוות של פריימרים קדימה ואחורה ומדגרים את התערובת בטמפרטורה של 90 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואז מעבירים ל-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. כפקדים, השתמש בפריימרים עם רצפי מטרה מקושקשים (טבלת חומרים).
    2. בקעו את השברים הנישולים באמצעות אנזימי הגבלה של XhoI/XbaI והעבירו אותם במורד הזרם של רצף luc2 לתוך pmiR-GLO, תוך יצירת pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR (Luc-RAP-1B) ו-pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR (Luc-scrambled). אשר קשירה עם מחשוף NotI.
      הערה: ודא שהשלוחות הנוצרות לאחר חישול פריימר משלימות את הווקטור לאחר תגובת המחשוף.
  4. pFLAG-HuR
    1. כדי ליצור פלסמיד עם ביטוי יתר של HuR, הגבר את רצף HuR באמצעות פריימרים ספציפיים. יש לערבב 300 ננוגרם של cDNA, 0.5 מיקרומטר מכל פריימר ספציפי, תערובת dNTPs של 1 mM, מאגר PCR אחד ו-5 U של פולימראז Taq DNA באיכות גבוהה.
    2. יש ללפות את מוצר ה-PCR ל-pGEM-T ולאשר את שלמות רצף הדנ"א על ידי ריצוף סנגר. הסר את מקטע ה- HuR מ- pGEM-T והחלף אותו לווקטור ביטוי יונקים pFLAG-CMV-3 כדי ליצור את וקטור ה- pFLAG-HuR.

2. תרבית תאים

הערה: קו התאים HeLa-Cre היה מתנה מד"ר א. מקייב21, והתא הפפילרי של סרטן בלוטת התריס (BCPAP) סופק בחביבות על ידי ד"ר מאסימו סנטורו (אוניברסיטת "פדריקו השני", נאפולי, איטליה). תאי HeLa, תא סרטן פפילרי של בלוטת התריס (BCPAP) ו-HEK-293T שימשו לביטוי יתר של HuR.

  1. שמור על התאים ב-DMEM/עתירת גלוקוז בתוספת 10% סרום בקר עוברי, 1 mM נתרן פירובט, 200 mM L-גלוטמין, ו-1x פניצילין-סטרפטומיצין (100 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין) בצלחות פטרי 100 מ"מ, אלא אם כן צוין אחרת. לדגור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לחות עם אטמוספירה מבוקרת (5% CO2).
  2. דגירה של תאים דביקים עם טריפסין/EDTA (תערובת תמיסה של 0.5%) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3-5 דקות. תנו להם להתנתק מהצלחת (תקופת הדגירה יכולה להשתנות בהתאם לסוג התא).
  3. בצע טרנספקציה עם מגיב טרנספקציה על בסיס שומנים בהתאם להוראות היצרן. ודא כי תרביות התאים הן כ 70% נפגש. השתמש בכמויות דומות של דנ"א עבור כל צירופי הטרנספקציה, כמתואר להלן, על-ידי הוספת הדנ"א המתאימים. בצע ניסויי טרנספקציה בשכפולים.
    1. ערבבו 200 ננוגרם של דנ"א ו-1.25 מיקרוגרם של ריאגנט טרנספקציה ב-100 מיקרוגרם של מדיום התרבית. מוסיפים את תערובת הטרנספקציה לתאים. דגירה של התאים עם תערובות transfection במשך 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, החלף את המדיום במדיום המכיל 10% FBS, ודגרה במשך 24 שעות נוספות לפני הוספת האנטיביוטיקה לבחירה.

3. ביטוי יתר של HuR

  1. טרנספקט pFLAG-HuR ו- pFLAG ריק לתוך HeLa. בחר תאים על ידי הגדלת ריכוז הגנטיצין (G418) (1 מיקרוגרם/מ"ל) מ-100 מיקרוגרם/מ"ל ל-1000 מיקרוגרם/מ"ל, מה שיוצר קווי תאים יציבים.
  2. אשר ביטוי יתר עם PCR כמותי באמצעות פריימרים ספציפיים עבור HuR mRNA, כמתואר בשלב 7.

4. בידוד RNA מוחלט

  1. השתמש בתאים שנאספו זה עתה. טריפסיניזציה של 70% תרביות תאים קונפלואנטיות (לצורך בדיקה זו נעשה שימוש בתאי HeLa-Cre), כמתואר בשלב 2.2.
  2. לאסוף את כדור התא על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 500 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס ולשטוף אותו עם 1x PBS (מלח חוצץ פוספט); חזור על הצנטריפוגה.
  3. השהה את כדור התא ב-1 מ"ל של PBS 1x והעבר אותו לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
  4. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 500 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס.
  5. שקלו את כדור התא היבש, והתאימו את נפחי וגודל הצינורות בהתאם. 1 מ"ג תאים מניב כ-1 מיקרוגרם של רנ"א כולל.
  6. במכסה המנוע, הוסיפו 500-1,000 μL של פנול/כלורופורם לכדור התא (באופן אידיאלי 750 μL לכל 0.25 גרם תאים) והפכו אותו להומוגני על ידי פיפטינג למעלה ולמטה וערבוב עם המערבולת.
  7. לדגום את התערובת במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (20 °C עד 25 °C) כדי לאפשר דיסוציאציה מלאה של קומפלקסים nucleoprotein.
  8. צנטריפוגה את הדגימה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  9. העבירו את הסופר-נטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל והוסיפו 200 מיקרו-ליטר של כלורופורם לכל 1 מ"ל של פנול:כלורופורם בשימוש. כסו היטב את צינורות הדגימה.
  10. מערבבים במרץ במשך 15 שניות (ביד או בקצרה מערבולות במהירות נמוכה יותר) ודוגרים בטמפרטורת החדר (20°C עד 25°C) למשך 2 דקות עד 3 דקות.
  11. צנטריפוגה את הדגימות ב 12,000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  12. בדוק נוכחות של שלב פנול-כלורופורם אדום תחתון, שלב ביניים ופאזה מימית עליונה חסרת צבע. הרנ"א נשאר בשלב המיימי העליון. במכסה המנוע, לאסוף את השלב המיימי, הימנעות ממגע עם השלב המתווך, ולהעביר צינור טרי.
  13. זרז RNA על ידי ערבוב הפאזה המימית עם 400 μL של איזופרופנול בדרגה מולקולרית (יחס של 1:1 לפנול/כלורופורם בשימוש) ו-2 μL של גליקוגן בכל צינור (זה יעזור לדמיין את נוכחות הכדור).
  14. מערבבים במרץ ביד או הומוגניים עם הקצה במשך ~ 10 שניות. דגירה במשך 15 דקות או לילה ב -20 מעלות צלזיוס.
  15. צנטריפוגה את הדגימה ב 12,000 x גרם במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant.
  16. שטפו את כדור ה-RNA על ידי הוספת 3 נפחים של 100% אתנול (כ-1 מ"ל, מדולל באמצעות מי DEPC) וערבבו את הדגימה על ידי מערבולת עד שהכדור משתחרר וצף מלמטה.
  17. צנטריפוגה ב 7,500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  18. שוטפים את כדור ה-RNA פי 1 על ידי הוספת 1 מ"ל של 75% אתנול ומערבבים את הדגימה על ידי מערבולת עד שהכדור משתחרר וצף מלמטה. חזור על הצנטריפוגה כמתואר בשלב 4.17.
  19. בצע סיבוב צנטריפוגה נוסף של 5 שניות כדי לאסוף נוזל שיורי מצד הצינור ולהסיר כל נוזל שיורי עם פיפטה מבלי להפריע לכדור.
  20. ייבשו לזמן קצר את כדור ה-RNA באוויר על ידי פתיחת מכסה הצינור בטמפרטורת החדר למשך 3-5 דקות והמיסו את גלולת ה-RNA ב-20-50 μL של מים ללא RNase שטופלו ב-DEPC. דגירה של RNA במשך 10 דקות ב 55-60 מעלות צלזיוס כדי להקל על resuspension של גלולה.

5. קביעת ריכוז ואיכות RNA כוללים

  1. קבע את ריכוז הרנ"א על ידי מדידת הספיגה ב-260 ננומטר ו-280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. קבל נתונים ספקטרליים מלאים לפני השימוש בדגימות ביישומים במורד הזרם.
  2. שלוט באיכות הרנ"א על ידי פתרון 800-1000 ננוגרם על ג'ל אגרוז 1.5% באמצעות חיץ TBE 0.5X (בסיס טריס 45 mM, 45 mM חומצה בורית, 1 mM EDTA). סך כל הרנ"א מתפצל לשני פסים המתייחסים ל-28S ו-18S rRNA.
    1. הכינו את כל הריאגנטים ושטפו את כל הציוד המשמש להפעלת הג'ל במים שטופלו ב-DEPC. מים מטופלים DEPC מוכנים במכסה המנוע על ידי הוספת 1 מ"ל של diethylpyrocarbonate ל 1000 מ"ל של מים טהורים במיוחד. דגירה במשך ~ 2 שעות בטמפרטורת החדר או ב 37 °C (77 °F) ו autoclave. יש לאחסן בטמפרטורת החדר עד 10 חודשים.
      הערה: אלקטרופורזה של סך ה-RNA של יונקים מובילה להפרדה של 28S ו-18S rRNAs ביחס של כ-2:1. הרצועות צריכות להיות שלמות וגלויות כשתי רצועות חדות. RNA פגום יגרום לפסים מטושטשים.

6. תמלול לאחור

  1. הגדר את תגובת השעתוק ההפוכה באמצעות 1 מיקרוגרם של RNA כולל.
  2. בצע שעתוק הפוך (RT) באמצעות אנזים טרנסקריפטאז הפוך (ראה טבלת חומרים) ופריימרים אקראיים של 50 ng/μL.
    1. מערבבים RNA, פריימרים אקראיים ותערובת dNTP של 1 mM (10 mM) ב-10 μL. דגירה ב-65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ועל קרח למשך דקה אחת. הוסף את הריאגנטים הבאים: מאגר RT 1x, 5 mM MgCl2, 10 mM DTT, 40 U של מעכב RNase ו- 200 U של טרנסקריפטאז הפוך.
    2. דגירה במשך 10 דקות ב 25 °C (75 °F) ובמשך שעה אחת ב 50 °C (הטמפרטורות עשויות להשתנות אם נעשה שימוש באנזימים שונים). סיים את התגובה על ידי דגירה ב 85 °C במשך 5 דקות.

7. PCR כמותי

  1. כדי להרכיב את התגובה בנפח סופי של 15 μL, יש לערבב 3 μL של cDNA (100 ng/μL), 3.2 pmol של כל פריימר, 6 μL של תערובת מאסטר המכילה את dNTPs ואנזים, ו-2.8 μL של מים אולטרה-טהורים.
    הערה: השתמש בפריימרים עבור גנים מכוננים אנדוגניים כבקרות (גנים משק בית) כדי לנרמל את רמות הביטוי של mRNA HuR ו- miRNAs. β-אקטין ו-snRNA U6 (RNU6B) הן אפשרויות זמינות לנורמליזציה של mRNAs ו-miRNAs, בהתאמה, אך גם גנים אחרים עשויים להתאים בהתאם למקרה.
  2. כימות רמות הביטוי באמצעות שיטת דלתא-דלתא Ct (2-ΔΔCt)20.

8. מבחן הכתב

  1. תאים המשמשים לבדיקה
    1. טרנספקט את הפלסמידים בתאי HeLa-Cre כדלקמן. טרנספקט עם pTK-רנילה (40 ננוגרם), לאחר מכן pRD-miR-17-92, יצירת HeLa-Cre-miR-17-92, ובחירה עם 1 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין.
    2. Transfect HeLa-Cre-miR-17-92-pTK-Renilla עם pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR או pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR, בנפרד. בחר באמצעות פניצילין (100 U / mL) וסטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל). טרנספקציות אלה יוצרות את לוק-ראפ-1-B ולוק-מקושקשות.
    3. בצע טרנספקט של התאים באמצעות pFLAG-HuR או pFLAG ריק (שלב 3).
    4. המשך לתרבית תאים, כמפורט בשלב 2.2., עם HeLa-Cre miR-17-92-luc, HeLa-Cre miR-17-92-scrambled, HeLa-Cre miR-17-92-HuR, ו- HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc עד כ-80% מהמפגש. השרה עם 1 μL של דוקסיציקלין (1 מיקרוגרם / מ"ל) במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כמו כן, שמור את כל התאים ללא doxycycline כמו בקרות, במשך אותה תקופה.
      הערה: הריכוז הסופי של דוקסיציקלין תלוי בקו התא המועדף. עודף של דוקסיציקלין יכול להיות רעיל לתאי יונקים.
  2. בדיקת זוהר
    1. כדי לכמת ולהשוות עוצמות זוהר שונות, השתמש בערכת הבדיקה של כתב Dual-luciferase. הפשירו את תמיסות הבדיקה של לוציפראז והשאירו אותן בטמפרטורת החדר לפני תחילת הבדיקה.
    2. הכינו את התערובת סטופ וגלו (צינורות כובע כחול) על ידי ערבוב 200 מיקרון ליטר של המצע ב-10 מ"ל של לוציפראז Assay Buffer II. הכינו את התערובת LAR II (צינורות כובע ירוק) על ידי ערבוב 10 מ"ל של לוציפראז Assay Buffer II לתוך בקבוקון הענבר של לוציפראז Assay Substrate II ונערו היטב.
    3. העבר את הפתרונות לצינורות צנטריפוגה של 15 מ"ל שזוהו בעבר ומוגנים מפני אור.
      הערה: כחלופה, ניתן להכין את הפתרונות בעבר ב-aliquots של 1-2 מ"ל ולהקפיא אותם בטמפרטורה של 80°C- מוגנים מפני אור ברדיד אלומיניום.
    4. לבצע את קריאות luminescence באמצעות ציוד כגון סינרגיה; מידה מבוטא לוציפראז כיחידות אור יחסיות (RLU).
    5. ייצא את התוצאות לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח סטטיסטי נוסף.
    6. בצע נורמליזציה של פעילות גחלילית-לוציפראז על ידי הבקרה רנילה (לוציפראז/רנילה) והתווה זאת כיחידות אור יחסיות (RLU) בגרפיקה. חזור על כך עבור קבוצות עם ובלי אינדוקציה של דוקסיציקלין.
    7. חשב את הממוצע ואת שגיאת התקן של הממוצע (SEM). בצע מבחן t של סטודנט או ANOVA דו-כיווני ואחריו מבחן שלאחר Tukey כדי לאפשר השוואה קבוצתית. ניתוחים אלה זמינים בחבילה כגון GraphPad Prism. הבדלים בערכי p < 0.05 נחשבים משמעותיים.

תוצאות

ההשערה הראשונית שלנו הייתה ש-HuR יכול להקל על ביוגנזה פנימית של miRNA על ידי קשירה לרצף הקדם-miRNA שלו. לפיכך, הקשר של ביטוי HuR וביוגנזה של אשכול miR-17-92 יכול להצביע על מנגנון חדש המסדיר את ההבשלה של miRNAs אלה. ביטוי יתר של HuR לאחר העברה של pFLAG-HuR אושר בשלושה קווי תאים שונים: HeLa, BCPAP ו-HEK-293T (?...

Discussion

שחבור קדם-mRNA הוא תהליך חשוב לוויסות ביטוי גנים, והבקרה שלו יכולה לגרום להשפעות חזקות על שינויים פנוטיפיים של תאים22,23. יותר מ-70% מה-miRNAs מתועתקים מאינטרונים בבני אדם, והשערנו שניתן להקל על העיבוד וההבשלה שלהם על ידי שחבור חלבונים רגולטוריים24,25

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

המחברים מודים ל- E. Makeyev (האוניברסיטה הטכנולוגית של נאניאנג, סינגפור) על תאי HeLa-Cre ופלסמידים pRD-RIPE ו- pCAGGS-Cre. אנו מודים לעדנה קימורה, קרולינה פרסל גוסס, גיזלה ראמוס, לוסיה רוזטי לופס ואנסלמו מוריסקוט על תמיכתם.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Recombinant DNA
pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid)A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pFLAG-HuRGenerated during this work
pmiRGLO-RAP-IBGenerated during this work
pmiRGLO-scrambledGenerated during this work
pRD-miR-17-92Generated during this work
pRD-RIPE-donorA kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pTK-RenillaPromegaE2241
Antibodies
anti-B-actinSigma AldrichA5316
anti-HuRCell SignalingmAb 12582
IRDye 680CW Goat anti-mouse IgGLi-Cor Biosciences926-68070
IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgGLi-Cor Biosciences929-70020
Experimental Models: Cell Lines
HeLa-CreA kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
HeLa-Cre miR17-92Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuRGenerated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR-lucGenerated during this work
HeLa-Cre miR17-92-lucGenerated during this work
HeLa-Cre miR17-92-scrambledGenerated during this work
Chemicals and Peptides
DMEM/high-glucoseThermo Fisher Scientific12800-017
DoxycyclineBioBasicMB719150
Dual-Glo Luciferase Assay SystemPromegaE2940
EcoRIThermo Fisher ScientificER0271
EcoRVThermo Fisher ScientificER0301
GeneticinThermo Fisher ScientificE859-EG
L-glutamineLife Technologies
Opti-MEM ILife Technologies31985-070
pFLAG-CMV™-3 Expression VectorSigma AldrichE6783
pGEM-TPromegaA3600
Platinum Taq DNA polymeraseThermo Fisher Scientific10966-030
pmiR-GLOPromegaE1330
PuromycinSigma AldrichP8833
RNAse OUTThermo Fisher Scientific752899
SuperScript IV kitThermo Fisher Scientific18091050
Trizol-LS reagentThermo Fisher10296-028
trypsin/EDTA 10XLife Technologies15400-054
XbaIThermo Fisher Scientific10131035
XhoIPromegaR616A
Oligonucleotides
forward RAP-1B pmiRGLOExxtendTCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG
CTACTATATCAGTTTGCACAT
reverse RAP-1B pmiRGLOExxtendCTAGATGTGCAAACTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward scrambled pmiRGLOExxtendTCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA
GCTACTATATCAGGGGTAAAAT
reverse scrambled pmiRGLOExxtendCTAGATTTTACCCCTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward HuR pFLAGExxtendGCCGCGAATTCAATGTCTAAT
GGTTATGAAGAC
reverse HuR pFLAGExxtendGCGCTGATATCGTTATTTGTG
GGACTTGTTGG
forward pre-miR-1792 pRD-RIPEExxtendATCCTCGAGAATTCCCATTAG
GGATTATGCTGAG
reverse pre-miR-1792 pRD-RIPEExxtendACTAAGCTTGATATCATCTTG
TACATTTAACAGTG
forward snRNA U6 (RNU6B)ExxtendCTCGCTTCGGCAGCACATATAC
reverse snRNA U6 (RNU6B)ExxtendGGAACGCTTCACGAATTTGCGTG
forward B-Actin qPCRExxtendACCTTCTACAATGAGCTGCG
reverse B-Actin qPCRExxtendCCTGGATAGCAACGTACATGG
forward HuR qPCRExxtendATCCTCTGGCAGATGTTTGG
reverse HuR qPCRExxtendCATCGCGGCTTCTTCATAGT
forward pre-miR-1792 qPCRExxtendGTGCTCGAGACGAATTCGTCA
GAATAATGTCAAAGTG
reverse pre-miR-1792 qPCRExxtendTCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC
TCAACAGGCCG
Software and Algorithms
Prism 8 for Mac OS XGraphpadhttps://www.graphpad.com
ImageJNational Institutes of Healthhttp://imagej.nih.gov/ij

References

  1. Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).
  2. Will, C. L., Luhrmann, R. Spliceosome structure and function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).
  3. Zhang, X., et al. An atomic structure of the human spliceosome. Cell. 169 (5), 918-929 (2017).
  4. Staley, J. P., Guthrie, C. Mechanical devices of the spliceosome: Motors, clocks, springs, and things. Cell. 92 (3), 315-326 (1998).
  5. Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
  6. Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 36-45 (2013).
  7. Mukherjee, N., et al. Integrative regulatory mapping indicates that the RNA-binding protein HuR couples pre-mRNA processing and mRNA stability. Molecular Cell. 43 (3), 327-339 (2011).
  8. Pandit, S., et al. Genome-wide analysis reveals SR protein cooperation and competition in regulated splicing. Molecular Cell. 50 (2), 223-235 (2013).
  9. Gatti da Silva, G. H., Dos Santos, M. G. P., Nagasse, H. Y., Coltri, P. P. Human antigen R (HuR) facilitates miR-19 synthesis and affects cellular kinetics in papillary thyroid cancer. Cellular Physiology and Biochemistry. 56, 105-119 (2022).
  10. Westholm, J. O., Lai, E. C. Mirtrons: MicroRNA biogenesis via splicing. Biochimie. 93 (11), 1897-1904 (2011).
  11. Michlewski, G., Cáceres, J. F. Post-transcriptional control of miRNA biogenesis. RNA. 25 (1), 1-16 (2019).
  12. Bartel, D. P. MicroRNAs: Target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  13. Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs - MicroRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
  14. Lin, S., Gregory, R. I. MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).
  15. Curtis, H. J., Sibley, C. R., Wood, M. J. Mirtrons, an emerging class of atypical miRNA. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (5), 617-632 (2012).
  16. Alarcon, C. R., et al. HNRNPA2B1 is a mediator of m(6)A-dependent nuclear RNA processing events. Cell. 162 (6), 1299-1308 (2015).
  17. Paiva, M. M., Kimura, E. T., Coltri, P. P. miR18a and miR19a recruit specific proteins for splicing in thyroid cancer cells. Cancer Genomics and Proteomics. 14 (5), 373-381 (2017).
  18. He, L., et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).
  19. Olive, V., et al. miR-19 is a key oncogenic component of mir-17-92. Genes & Development. 23 (24), 2839-2849 (2009).
  20. Livak, K. J., Schmittgen, T. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  21. Khandelia, P., Yap, K., Makeyev, E. V. Streamlined platform for short hairpin RNA interference and transgenesis in cultured mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12799-12804 (2011).
  22. Huelga, S. C., et al. Integrative genome-wide analysis reveals cooperative regulation of alternative splicing by hnRNP proteins. Cell Reports. 1 (2), 167-178 (2012).
  23. Karni, R., et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (3), 185-193 (2007).
  24. Franca, G. S., Vibranovski, M. D., Galante, P. A. Host gene constraints and genomic context impact the expression and evolution of human microRNAs. Nature Communications. 7, 11438 (2016).
  25. Havens, M. A., Reich, A. A., Hastings, M. L. Drosha promotes splicing of a pre-microRNA-like alternative exon. PLoS Genetics. 10 (5), 1004312 (2014).
  26. Grammatikakis, I., Abdelmohsen, K., Gorospe, M. Posttranslational control of HuR function. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).
  27. Chang, S. H., et al. ELAVL1 regulates alternative splicing of eIF4E transporter to promote postnatal angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18309-18314 (2014).
  28. Huang, Y. H., et al. Delivery of therapeutics targeting the mRNA-binding protein HuR using 3DNA nanocarriers suppresses ovarian tumor growth. Cancer Research. 76 (6), 1549-1559 (2016).
  29. Wang, W., Caldwell, M. C., Lin, S., Furneaux, H., Gorospe, M. HuR regulates cyclin A and cyclin B1 mRNA stability during cell proliferation. The EMBO Journal. 19 (10), 2340-2350 (2000).
  30. Guo, X., Connick, M. C., Vanderhoof, J., Ishak, M. A., Hartley, R. S. MicroRNA-16 modulates HuR regulation of cyclin E1 in breast cancer cells. International Journal of Molecular Sciences. 16 (4), 7112-7132 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved