JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Dört plazmidli in vitro hücrelerde kullanılmak üzere bir intronic mikroRNA biyogenez muhabir testi geliştirdik: biri intronic miRNA ile, biri hedefli, biri düzenleyici bir proteini aşırı eksprese etmek ve biri Renilla lusiferaz için. MiRNA işlendi ve hedef diziye bağlanarak lusiferaz ekspresyonunu kontrol edebildi.

Özet

MikroRNA'lar (miRNA'lar) ökaryotlarda yaygın olan kısa RNA molekülleridir. Çoğu miRNA intronlardan kopyalanır ve olgunlaşmaları çekirdekte farklı RNA bağlayıcı proteinleri içerir. Olgun miRNA'lar sıklıkla gen susturmaya aracılık eder ve bu, transkripsiyon sonrası olayları anlamak için önemli bir araç haline gelmiştir. Bunun yanı sıra, gen terapileri için umut verici bir metodoloji olarak araştırılabilir. Bununla birlikte, şu anda memeli hücre kültürlerinde miRNA ekspresyonunu değerlendirmek için doğrudan yöntemlerin eksikliği vardır. Burada, miRNA biyogenezinin ve olgunlaşmanın belirlenmesinde, hedef dizilerle etkileşiminin doğrulanması yoluyla yardımcı olan etkili ve basit bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, bu sistem, birincil miRNA (pri-miRNA) transkripsiyonunu yüksek verimlilik ve düşük maliyetle kontrol edebilen bir doksisiklin ile indüklenebilir promotör kullanarak eksojen miRNA olgunlaşmasının endojen aktivitesinden ayrılmasını sağlar. Bu araç aynı zamanda ayrı bir plazmidde RNA bağlayıcı proteinlerle modülasyona izin verir. Çeşitli farklı miRNA'lar ve bunların ilgili hedefleriyle kullanımına ek olarak, transfeksiyona uygun olmaları koşuluyla farklı hücre hatlarına uyarlanabilir.

Giriş

Prekürsör mRNA ekleme, ökaryotlarda gen ekspresyonu regülasyonu için önemli bir süreçtir1. İntronların çıkarılması ve olgun RNA'daki ekzonların birleşmesi, 5 snRNA'dan (U1, U2, U4, U5 ve U6) oluşan 2 megadalton ribonükleoprotein kompleksi olan splisozom ve 100'den fazla protein 2,3 tarafından katalize edilir. Ekleme reaksiyonu ko-transkripsiyonel olarak gerçekleşir ve splisozom, ekzon-intron sınırlarında ve intron4 içinde korunmuş ekleme bölgelerinin tanınmasıyla yönlendirilen her yeni intronda birleştirilir. Farklı intronlar, splisozom kompleksinin ve bileşenlerinin dikkate değer korunumuna rağmen farklı ekleme oranlarına sahip olabilir. Ekleme bölgesi korunumundaki farklılıklara ek olarak, intronlar ve ekzonlar üzerine dağıtılan düzenleyici diziler, RNA bağlayıcı proteinleri (RBP) yönlendirebilir ve ekleme 5,6'yı uyarabilir veya bastırabilir. HuR, her yerde eksprese edilen bir RBP'dir ve mRNA stabilitesini kontrol etmek için önemli bir faktördür7. Grubumuzdan elde edilen önceki sonuçlar, HuR'nin miRNA'lar içeren intronlara bağlanabildiğini gösterdi, bu da bu proteinin miRNA işlemesini ve olgunlaşmasını kolaylaştırmak için önemli bir faktör olabileceğini ve ayrıca alternatif ekleme izoformlarının 6,8,9 oluşumuna yol açabileceğini gösterdi.

Birçok mikroRNA (miRNA) intronik dizilerden kodlanır. Bazıları intron'un bir parçası iken, diğerleri "mirtronlar" olarak bilinir ve tüm intron10,11 tarafından oluşturulur. miRNA'lar, uzunluğu12 olan 18 ila 24 nükleotid arasında değişen kısa kodlamayan RNA'lardır. Olgun dizileri, mRNA'lardaki hedef dizilerle kısmi veya tam tamamlayıcılık gösterir, bu nedenle translasyon ve / veya mRNA bozunma oranlarını etkiler. MiRNA'ların ve hedeflerin kombinasyonları hücreyi farklı sonuçlara götürür. Birkaç miRNA, hücreleri pro- veya anti-tümöral fenotiplere yönlendirebilir13. Onkojenik miRNA'lar genellikle baskılayıcı bir özelliği tetikleyen mRNA'ları hedef alır ve bu da hücresel proliferasyon, göç ve invazyonun artmasına neden olur14. Öte yandan, tümör baskılayıcı miRNA'lar, onkojenik mRNA'ları veya artmış hücre proliferasyonuna bağlı mRNA'ları hedefleyebilir.

MiRNA'ların işlenmesi ve olgunlaşması da kökenlerine bağlıdır. Çoğu intronic miRNA, ribonükleaz Drisha ve protein ko-faktörleri12 tarafından oluşturulan mikroişlemcinin katılımıyla işlenir. Mirtronlar, Drosha15'ten bağımsız olarak splisozomun aktivitesi ile işlenir. İntronlarda bulunan miRNA'ların yüksek frekansını göz önünde bulundurarak, ekleme ile ilgili RNA bağlayıcı proteinlerin bu miRNA'ların işlenmesini ve olgunlaşmasını da kolaylaştırabileceğini varsaydık. Özellikle, RBP hnRNP A2 / B1 zaten mikroişlemci ve miRNA biyogenezi16 ile ilişkilendirilmiştir.

Daha önce hnRNP'ler ve HuR gibi birkaç RNA bağlayıcı proteinin, kütle spektrometrisi17 ile intronic miRNA'larla ilişkili olduğunu bildirmiştik. HuR'un (ELAVL1) miR-17-92 intronik kümesinden miRNA'larla ilişkisi, immünopresipitasyon ve in siliko analizi9 kullanılarak doğrulandı. miR-17-92, farklı kanserlerde ekspresyonu artmış altı miRNA'dan oluşan bir intronik miRNA kümesidir18,19. Bu küme aynı zamanda "oncomiR-1" olarak da bilinir ve miR-17, miR-18 a, miR-19 a, miR-20, miR-19b ve miR-92 a'dan oluşur. miR-19 a ve miR-19b, bu küme 19'un en onkojenik miRNA'larıarasındadır. HuR'nin artan ekspresyonu miR-19a ve miR-19b sentezi 9'u uyarır. Bu kümeyi çevreleyen tronik bölgeler HuR ile ilişkili olduğundan, bu proteinin miR-19a ve miR-19b ekspresyonunu ve olgunlaşmasını düzenleyip düzenleyemeyeceğini araştırmak için bir yöntem geliştirdik. Hipotezimizin önemli bir tahmini, düzenleyici bir protein olarak HuR'nin miRNA biyogenezini kolaylaştırabileceği ve fenotipik değişikliklere yol açabileceğiydi. Bir olasılık, miRNA'ların HuR'nin uyarılmasıyla işlendiği, ancak olgun ve işlevsel olmayacağı ve bu nedenle proteinin etkilerinin fenotipi doğrudan etkilemeyeceğiydi. Bu nedenle, HuR gibi bir RBP'nin intronic bir miRNA'nın biyogenezini ve olgunlaşmasını etkileyip etkilemediğini araştırmak için bir ekleme muhabiri testi geliştirdik. MiRNA işlemeyi ve olgunlaşmasını doğrulayarak, tahlilimiz hedef sekans ile etkileşimi ve olgun ve fonksiyonel bir miRNA'nın oluşumunu gösterir. Tahlilimizde, kültürlenmiş hücrelerde miRNA hedef bağlanmasını kontrol etmek için bir intronic miRNA kümesinin ekspresyonunu bir lusiferaz plazmidi ile birleştiriyoruz.

Protokol

Burada açıklanan protokole genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. Plazmid yapımı

  1. pCAGGS-Cre: Bu plazmid Dr. E. Makeyev21 tarafından sağlanmıştır.
  2. pRD-miR-17-92:
    1. Pre-miR-17-92'yi, her bir spesifik astarın 0.5 μM'sini (Malzeme Tablosu), 150 ng cDNA, 1 mM dNTP'ler, 1x Taq PCR tamponu ve 5 U yüksek doğruluklu Taq DNA polimeraz kullanarak PCR ile yükseltin. DNA kontaminasyonunu kontrol etmek için şablonsuz bir kontrol PCR reaksiyonu gerçekleştirin (cDNA yerine su kullanın).
    2. PCR ürününü DNA ligaz kullanarak EcoRI ve EcoRV kısıtlama bölgeleri arasındaki intron içinde pRD-RIPE (Nanyang Teknoloji Üniversitesi, Singapur'dan Dr. E. Makeyev tarafından sağlanmıştır)21'e bağlayın ve pRD-miR-17-92'yi oluşturun. Sanger dizilimi ile dizi bütünlüğünü onaylayın.
  3. pmiRGLO-RAP-IB
    1. XhoI/XbaI kısıtlama siteleri ve içinde bir NotI kısıtlama sitesi bulunan ileri ve geri astarlar tasarlayın. Equimolar miktarlarda ileri ve geri astarları karıştırın ve karışımı 5 dakika boyunca 90 ° C'de inkübe edin, ardından 15 dakika boyunca 37 ° C'ye aktarın. Kontrol olarak, karıştırılmış hedef dizilerine sahip astarlar kullanın (Malzeme Tablosu).
    2. XhoI/XbaI kısıtlama enzimlerini kullanarak tavlanmış parçaları ayırın ve luc2 dizisinin aşağı akışını pmiR-GLO'ya bağlayarak pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR (Luc-RAP-1B) ve pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR (Luc-scrambled) muhabir yapıları oluşturun. NotI bölünmesi ile ligasyonu onaylayın.
      NOT: Astar tavlamadan sonra oluşan çıkıntıların, bölünme reaksiyonundan sonra vektörü tamamladığından emin olun.
  4. pFLAG-HuR
    1. HuR aşırı eksprese eden bir plazmid oluşturmak için, HuR dizisini belirli primerlerle yükseltin. 300 ng cDNA, her bir spesifik astarın 0,5 μM, 1 mM dNTP karışımı, 1x PCR tamponu ve 5 U yüksek doğrulukta Taq DNA polimeraz karışımı.
    2. PCR ürününü pGEM-T'ye bağlayın ve Sanger dizilimi ile DNA dizisi bütünlüğünü onaylayın. HuR parçasını pGEM-T'den çıkarın ve pFLAG-HuR vektörünü oluşturmak için pFLAG-CMV-3 memeli ifade vektörüne alt klonlayın.

2. Hücre kültürü

NOT: HeLa-Cre hücre hattı Dr. E. Makeyev21'in bir hediyesiydi ve papiller tiroid kanseri hücresi (BCPAP) Dr. Massimo Santoro ("Federico II" Üniversitesi, Napoli, İtalya) tarafından nazikçe sağlandı. HuR'u aşırı eksprese etmek için HeLa hücresi, papiller tiroid kanseri hücresi (BCPAP) ve HEK-293T kullanıldı.

  1. Aksi belirtilmedikçe, 100 mm Petri kaplarında% 10 fetal sığır serumu, 1 mM sodyum piruvat, 200 mM L-glutamin ve 1x penisilin-streptomisin (100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin) ile desteklenmiş DMEM / yüksek glikozdaki hücreleri koruyun. Hücreleri nemlendirilmiş, kontrollü atmosferli bir inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin (% 5 CO2).
  2. Yapışkan hücreleri tripsin/EDTA (% 0.5 çözelti karışımı) ile 37 ° C'de 3-5 dakika boyunca inkübe edin. Plakadan ayrılmalarına izin verin (kuluçka süresi hücre tipine göre değişebilir).
  3. Üreticinin talimatlarını izleyerek lipit bazlı bir transfeksiyon reaktifi ile transfeksiyonlar gerçekleştirin. Hücre kültürlerinin yaklaşık% 70 oranında birleştiğinden emin olun. Uygun DNA'ları ekleyerek aşağıda açıklandığı gibi tüm transfeksiyon kombinasyonları için benzer miktarlarda DNA kullanın. Çoğaltmalarda transfeksiyon deneyleri gerçekleştirin.
    1. Kültür ortamının 100 μL'sinde 200 ng DNA ve 1.25 μL transfeksiyon reaktifini karıştırın. Transfeksiyon karışımını hücrelere ekleyin. Hücreleri transfeksiyon karışımları ile 37 ° C'de 4 saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, ortamı% 10 FBS içeren ortamla değiştirin ve seçim için antibiyotik eklemeden önce 24 saat daha inkübe edin.

3. HuR aşırı ifadesi

  1. pFLAG-HuR'u transfekt edin ve pFLAG'i HeLa'ya boşaltın. Genetikin (G418) (1 μg / mL) konsantrasyonunu 100 μg / mL'den 1000 μg / mL'ye çıkararak hücreleri seçin ve kararlı hücre hatları oluşturun.
  2. Adım 7'de açıklandığı gibi, HuR mRNA için spesifik primerler kullanarak kantitatif PCR ile aşırı ekspresyonu onaylayın.

4. Toplam RNA izolasyonu

  1. Taze toplanan hücreleri kullanın. Adım 2.2'de açıklandığı gibi% 70 birleşik hücre kültürlerini tripsinize edin (bu test için HeLa-Cre hücreleri kullanıldı).
  2. Hücre peletini 4 ° C'de 500 x g'de 5 dakika santrifüjleme ile toplayın ve 1x PBS (fosfat tamponlu salin) ile yıkayın; santrifüjlemeyi tekrarlayın.
  3. Hücre peletini 1 mL 1x PBS'de yeniden askıya alın ve 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  4. 4 °C'de 500 x g'de 5 dakika santrifüj.
  5. Kuru hücre peletini tartın ve tüplerin hacimlerini ve boyutlarını buna göre ayarlayın. 1 mg hücre yaklaşık 1 μg toplam RNA verir.
  6. Bir davlumbazda, hücre peletine 500-1.000 μL fenol / kloroform ekleyin (ideal olarak 0.25 g hücre başına 750 μL) ve yukarı ve aşağı pipetleyerek ve vorteks ile karıştırarak homojenleştirin.
  7. Nükleoprotein komplekslerinin tamamen ayrışmasına izin vermek için karışımı oda sıcaklığında (20 ° C ila 25 ° C) 5 dakika boyunca inkübe edin.
  8. Numuneyi 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın.
  9. Süpernatantı yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 1 mL fenol:kloroform başına 200 μL kloroform ekleyin. Numune tüplerini güvenli bir şekilde kapatın.
  10. 15 s boyunca kuvvetlice karıştırın (elle veya daha düşük bir hızda kısaca vorteksleme) ve oda sıcaklığında (20 ° C ila 25 ° C) 2 dakika ila 3 dakika boyunca inkübe edin.
  11. Numuneleri 4 °C'de 15 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj yapın.
  12. Alt kırmızı fenol-kloroform faz, ara faz ve renksiz üst sulu fazın varlığını kontrol edin. RNA üst sulu fazda kalır. Bir davlumbazda, ara faza temas etmekten kaçınarak sulu fazı toplayın ve taze bir tüpe aktarın.
  13. Sulu fazı 400 μL moleküler dereceli izopropanol (kullanılan fenol / kloroforma 1: 1 oran) ve her tüpte 2 μL glikojen ile karıştırarak RNA'yı çökeltin (peletin varlığını görselleştirmeye yardımcı olacaktır).
  14. Elle kuvvetlice karıştırın veya ~ 10 s için uçla homojenize edin. 15 dakika veya gece boyunca -20 ° C'de inkübe edin.
  15. Numuneyi 4 ° C'de 20 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
  16. RNA peletini 3 hacim% 100 etanol (yaklaşık 1 mL, DEPC suyu kullanılarak seyreltilmiş) ekleyerek yıkayın ve pelet serbest bırakılana ve alttan yüzene kadar numuneyi vorteks yaparak karıştırın.
  17. 4 °C'de 5 dakika boyunca 7.500 x g'de santrifüj.
  18. RNA peletini 1 mL% 75 etanol ekleyerek 1x yıkayın ve pelet serbest bırakılana ve alttan yüzene kadar numuneyi vorteks yaparak karıştırın. Santrifüjlemeyi adım 4.17'de açıklandığı gibi tekrarlayın.
  19. Tüpün yanından kalan sıvıyı toplamak için ilave bir 5 s santrifüjleme spini gerçekleştirin ve artık sıvıyı peleti rahatsız etmeden pipetle çıkarın.
  20. Tüpün kapağını oda sıcaklığında 3-5 dakika boyunca açarak RNA peletini kısaca havayla kurutun ve RNA peletini 20-50 μL RNaz içermeyen DEPC ile muamele edilmiş suda çözün. Peletin yeniden süspansiyonunu kolaylaştırmak için RNA'yı 55-60 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.

5. Toplam RNA konsantrasyonunun ve kalitesinin belirlenmesi

  1. Bir spektrofotometre kullanarak absorbansı 260 nm ve 280 nm'de ölçerek RNA konsantrasyonunu belirleyin. Örnekleri aşağı akış uygulamalarında kullanmadan önce tam spektral veriler elde edin.
  2. 0.5X TBE tamponu (45 mM Tris baz, 45 mM borik asit, 1 mM EDTA) kullanarak% 1.5'lik bir agaroz jeli üzerinde 800-1000 ng çözerek RNA kalitesini kontrol edin. Toplam RNA, 28S ve 18S rRNA'lara atıfta bulunan iki banda ayrılır.
    1. Tüm reaktifleri yapın ve jeli çalıştırmak için kullanılan tüm ekipmanı DEPC ile arıtılmış suyla yıkayın. DEPC ile arıtılmış su, 1000 mL ultra saf suya 1 mL dietilpirokarbonat ilave edilerek davlumbazda hazırlanır. Oda sıcaklığında veya 37 °C'de ~2 saat inkübe edin ve otoklav. 10 aya kadar oda sıcaklığında saklayın.
      NOT: Memeli total RNA'larının elektroforezi, 28S ve 18S rRNA'larının yaklaşık 2: 1 oranında ayrılmasına yol açar. Bantlar sağlam olmalı ve iki keskin bant olarak görünür olmalıdır. Bozulmuş RNA bulanık bantlara neden olur.

6. Ters transkripsiyon

  1. 1 μg toplam RNA kullanarak ters transkripsiyon reaksiyonunu ayarlayın.
  2. Ters transkriptaz enzimi ( bakınız Malzeme Tablosu) ve 50 ng/μL rastgele decamer primerleri kullanarak ters transkripsiyon (RT) gerçekleştirin.
    1. RNA'yı, rastgele primerleri ve 10 μL'de 1 mM dNTP karışımını (10 mM) karıştırın. 5 dakika boyunca 65 ° C'de ve 1 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Aşağıdaki reaktifleri ekleyin: 1x RT tamponu, 5 mM MgCl2, 10 mM DTT, 40 U RNaz inhibitörü ve 200 U Ters Transkriptaz.
    2. 25 °C'de 10 dakika ve 50 °C'de 1 saat inkübe edin (farklı enzimler kullanılırsa sıcaklıklar değişebilir). 5 dakika boyunca 85 ° C'de inkübe ederek reaksiyonu sonlandırın. cDNA'lar -20 ° C'de saklanabilir.

7. Kantitatif PCR

  1. Reaksiyonu 15 μL'lik son bir hacimde birleştirmek için, 3 μL cDNA (100 ng / μL), her primerden 3.2 pmol, dNTP'leri ve enzimi içeren 6 μL ana karışım ve 2.8 μL ultra saf su karıştırın.
    NOT: HuR mRNA ve miRNA'ların ekspresyon seviyelerini normalleştirmek için endojen kurucu genler için primerleri kontrol (temizlik genleri) olarak kullanın. β-Aktin ve snRNA U6 (RNU6B), sırasıyla mRNA'ların ve miRNA'ların normalizasyonu için mevcut seçeneklerdir, ancak duruma bağlı olarak diğer genler de uygun olabilir.
  2. Delta-delta Ct (2-ΔΔCt) yöntemi20'yi kullanarak ifade seviyelerini ölçün.

8. Muhabir tahlili

  1. Tahlil için kullanılan hücreler
    1. HeLa-Cre hücrelerindeki plazmidleri aşağıdaki gibi transfekte edin. pTK-Renilla (40 ng) ile transfect, daha sonra pRD-miR-17-92, HeLa-Cre-miR-17-92 üretir ve 1 μg / mL puromisin ile seçilir.
    2. Transfect HeLa-Cre-miR-17-92-pTK-Renilla, pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR veya pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR ile ayrı ayrı. Penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (100 μg/mL) kullanarak seçin. Bu transfeksiyonlar Luc-RAP-1-B ve Luc-scrambled üretir.
    3. Hücreleri pFLAG-HuR veya boş pFLAG ile aktarın (adım 3).
    4. Adım 2.2.'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, HeLa-Cre miR-17-92-luc, HeLa-Cre miR-17-92-scrambled, HeLa-Cre miR-17-92-HuR ve HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc ile birleşmenin yaklaşık% 80'ine kadar hücre kültürüne geçin. 37 °C'de 30 dakika boyunca 1 μL doksisiklin (1 μg / mL) ile indükleyin. Ayrıca, doksisiklin içermeyen tüm hücreleri aynı süre boyunca kontrol olarak saklayın.
      NOT: Doksisiklin nihai konsantrasyonu, seçilen hücre hattına bağlıdır. Aşırı miktarda doksisiklin memeli hücreleri için toksik olabilir.
  2. Lüminesan testi
    1. Farklı lüminesans yoğunluklarını ölçmek ve karşılaştırmak için, Çift lusiferaz muhabir tahlil kitini kullanın. Lusiferaz tahlil solüsyonlarını çözün ve tahlil işlemine başlamadan önce oda sıcaklığında bırakın.
    2. Stop ve Glo (mavi kapaklı tüpler) karışımını, substratın 200 μL'sini 10 mL'lik Luciferaz Tahlil Tamponu II'de karıştırarak hazırlayın. Luciferaz Tahlil Substrat II'nin amber şişesine 10 mL Luciferaz Tahlil Tamponu II'yi karıştırarak LAR II (yeşil kapaklı tüpler) karışımını hazırlayın ve iyice çalkalayın.
    3. Çözeltileri daha önce tanımlanmış ve ışıktan korunan 15 mL santrifüj tüplerine aktarın.
      NOT: Alternatif olarak, çözeltiler daha önce 1-2 mL alikotlarda hazırlanabilir ve alüminyum folyodaki ışıktan korunan -80 ° C'de dondurulabilir.
    4. Parlaklık ölçümlerini Sinerji gibi bir ekipman kullanarak gerçekleştirin; eksprese edilen lusiferazı göreceli ışık birimleri (RLU) olarak ölçün.
    5. Daha fazla istatistiksel analiz için sonuçları bir e-tabloya aktarın.
    6. Kontrol Renilla (lusiferaz / Renilla) tarafından ateş böceği-lusiferaz aktivitesinin normalleştirilmesini gerçekleştirin ve bunu bir grafikte göreceli ışık birimleri (RLU) olarak çizin. Bunu doksisiklin indüksiyonu olan ve olmayan gruplar için tekrarlayın.
    7. Ortalama ve standart ortalamanın (SEM) hatasını hesaplayın. Grup karşılaştırmasına izin vermek için bir Öğrencinin t-testini veya iki yönlü ANOVA'yı ve ardından Tukey'in son testini gerçekleştirin. Bu analizler GraphPad Prizma gibi bir pakette mevcuttur. 0.05 < p-değerlerindeki farklılıklar anlamlı kabul edilir.

Sonuçlar

İlk hipotezimiz, HuR'nin pre-miRNA dizisine bağlanarak intronic miRNA biyogenezini kolaylaştırabileceğiydi. Bu nedenle, HuR ekspresyonu ve miR-17-92 küme biyogenezinin bağlantısı, bu miRNA'ların olgunlaşmasını yöneten yeni bir mekanizmaya işaret edebilir. pFLAG-HuR'nin transfeksiyonu üzerine HuR'nin aşırı ekspresyonu üç farklı hücre hattında doğrulandı: HeLa, BCPAP ve HEK-293T (Şekil 2). Kontrol olarak, transfekte edilmemiş hücreler ve boş pFLAG vektör...

Tartışmalar

Pre-mRNA ekleme, gen ekspresyon regülasyonu için önemli bir süreçtir ve kontrolü, hücre fenotipik modifikasyonları üzerinde güçlü etkileri tetikleyebilir22,23. MiRNA'ların% 70'inden fazlası insanlardaki intronlardan kopyalanır ve bunların işlenmesinin ve olgunlaşmasının, düzenleyici proteinlerin24,25 eklenmesiyle kolaylaştırılabileceğini varsaydık. Kültürlü hücrelerde introni...

Açıklamalar

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, HeLa-Cre hücreleri ve pRD-RIPE ve pCAGGS-Cre plazmidleri için E. Makeyev'e (Nanyang Teknoloji Üniversitesi, Singapur) minnettardır. Edna Kimura, Carolina Purcell Goes, Gisela Ramos, Lucia Rossetti Lopes ve Anselmo Moriscot'a destekleri için teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Recombinant DNA
pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid)A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pFLAG-HuRGenerated during this work
pmiRGLO-RAP-IBGenerated during this work
pmiRGLO-scrambledGenerated during this work
pRD-miR-17-92Generated during this work
pRD-RIPE-donorA kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pTK-RenillaPromegaE2241
Antibodies
anti-B-actinSigma AldrichA5316
anti-HuRCell SignalingmAb 12582
IRDye 680CW Goat anti-mouse IgGLi-Cor Biosciences926-68070
IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgGLi-Cor Biosciences929-70020
Experimental Models: Cell Lines
HeLa-CreA kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
HeLa-Cre miR17-92Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuRGenerated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR-lucGenerated during this work
HeLa-Cre miR17-92-lucGenerated during this work
HeLa-Cre miR17-92-scrambledGenerated during this work
Chemicals and Peptides
DMEM/high-glucoseThermo Fisher Scientific12800-017
DoxycyclineBioBasicMB719150
Dual-Glo Luciferase Assay SystemPromegaE2940
EcoRIThermo Fisher ScientificER0271
EcoRVThermo Fisher ScientificER0301
GeneticinThermo Fisher ScientificE859-EG
L-glutamineLife Technologies
Opti-MEM ILife Technologies31985-070
pFLAG-CMV™-3 Expression VectorSigma AldrichE6783
pGEM-TPromegaA3600
Platinum Taq DNA polymeraseThermo Fisher Scientific10966-030
pmiR-GLOPromegaE1330
PuromycinSigma AldrichP8833
RNAse OUTThermo Fisher Scientific752899
SuperScript IV kitThermo Fisher Scientific18091050
Trizol-LS reagentThermo Fisher10296-028
trypsin/EDTA 10XLife Technologies15400-054
XbaIThermo Fisher Scientific10131035
XhoIPromegaR616A
Oligonucleotides
forward RAP-1B pmiRGLOExxtendTCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG
CTACTATATCAGTTTGCACAT
reverse RAP-1B pmiRGLOExxtendCTAGATGTGCAAACTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward scrambled pmiRGLOExxtendTCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA
GCTACTATATCAGGGGTAAAAT
reverse scrambled pmiRGLOExxtendCTAGATTTTACCCCTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward HuR pFLAGExxtendGCCGCGAATTCAATGTCTAAT
GGTTATGAAGAC
reverse HuR pFLAGExxtendGCGCTGATATCGTTATTTGTG
GGACTTGTTGG
forward pre-miR-1792 pRD-RIPEExxtendATCCTCGAGAATTCCCATTAG
GGATTATGCTGAG
reverse pre-miR-1792 pRD-RIPEExxtendACTAAGCTTGATATCATCTTG
TACATTTAACAGTG
forward snRNA U6 (RNU6B)ExxtendCTCGCTTCGGCAGCACATATAC
reverse snRNA U6 (RNU6B)ExxtendGGAACGCTTCACGAATTTGCGTG
forward B-Actin qPCRExxtendACCTTCTACAATGAGCTGCG
reverse B-Actin qPCRExxtendCCTGGATAGCAACGTACATGG
forward HuR qPCRExxtendATCCTCTGGCAGATGTTTGG
reverse HuR qPCRExxtendCATCGCGGCTTCTTCATAGT
forward pre-miR-1792 qPCRExxtendGTGCTCGAGACGAATTCGTCA
GAATAATGTCAAAGTG
reverse pre-miR-1792 qPCRExxtendTCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC
TCAACAGGCCG
Software and Algorithms
Prism 8 for Mac OS XGraphpadhttps://www.graphpad.com
ImageJNational Institutes of Healthhttp://imagej.nih.gov/ij

Referanslar

  1. Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).
  2. Will, C. L., Luhrmann, R. Spliceosome structure and function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).
  3. Zhang, X., et al. An atomic structure of the human spliceosome. Cell. 169 (5), 918-929 (2017).
  4. Staley, J. P., Guthrie, C. Mechanical devices of the spliceosome: Motors, clocks, springs, and things. Cell. 92 (3), 315-326 (1998).
  5. Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
  6. Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 36-45 (2013).
  7. Mukherjee, N., et al. Integrative regulatory mapping indicates that the RNA-binding protein HuR couples pre-mRNA processing and mRNA stability. Molecular Cell. 43 (3), 327-339 (2011).
  8. Pandit, S., et al. Genome-wide analysis reveals SR protein cooperation and competition in regulated splicing. Molecular Cell. 50 (2), 223-235 (2013).
  9. Gatti da Silva, G. H., Dos Santos, M. G. P., Nagasse, H. Y., Coltri, P. P. Human antigen R (HuR) facilitates miR-19 synthesis and affects cellular kinetics in papillary thyroid cancer. Cellular Physiology and Biochemistry. 56, 105-119 (2022).
  10. Westholm, J. O., Lai, E. C. Mirtrons: MicroRNA biogenesis via splicing. Biochimie. 93 (11), 1897-1904 (2011).
  11. Michlewski, G., Cáceres, J. F. Post-transcriptional control of miRNA biogenesis. RNA. 25 (1), 1-16 (2019).
  12. Bartel, D. P. MicroRNAs: Target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  13. Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs - MicroRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
  14. Lin, S., Gregory, R. I. MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).
  15. Curtis, H. J., Sibley, C. R., Wood, M. J. Mirtrons, an emerging class of atypical miRNA. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (5), 617-632 (2012).
  16. Alarcon, C. R., et al. HNRNPA2B1 is a mediator of m(6)A-dependent nuclear RNA processing events. Cell. 162 (6), 1299-1308 (2015).
  17. Paiva, M. M., Kimura, E. T., Coltri, P. P. miR18a and miR19a recruit specific proteins for splicing in thyroid cancer cells. Cancer Genomics and Proteomics. 14 (5), 373-381 (2017).
  18. He, L., et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).
  19. Olive, V., et al. miR-19 is a key oncogenic component of mir-17-92. Genes & Development. 23 (24), 2839-2849 (2009).
  20. Livak, K. J., Schmittgen, T. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  21. Khandelia, P., Yap, K., Makeyev, E. V. Streamlined platform for short hairpin RNA interference and transgenesis in cultured mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12799-12804 (2011).
  22. Huelga, S. C., et al. Integrative genome-wide analysis reveals cooperative regulation of alternative splicing by hnRNP proteins. Cell Reports. 1 (2), 167-178 (2012).
  23. Karni, R., et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (3), 185-193 (2007).
  24. Franca, G. S., Vibranovski, M. D., Galante, P. A. Host gene constraints and genomic context impact the expression and evolution of human microRNAs. Nature Communications. 7, 11438 (2016).
  25. Havens, M. A., Reich, A. A., Hastings, M. L. Drosha promotes splicing of a pre-microRNA-like alternative exon. PLoS Genetics. 10 (5), 1004312 (2014).
  26. Grammatikakis, I., Abdelmohsen, K., Gorospe, M. Posttranslational control of HuR function. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).
  27. Chang, S. H., et al. ELAVL1 regulates alternative splicing of eIF4E transporter to promote postnatal angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18309-18314 (2014).
  28. Huang, Y. H., et al. Delivery of therapeutics targeting the mRNA-binding protein HuR using 3DNA nanocarriers suppresses ovarian tumor growth. Cancer Research. 76 (6), 1549-1559 (2016).
  29. Wang, W., Caldwell, M. C., Lin, S., Furneaux, H., Gorospe, M. HuR regulates cyclin A and cyclin B1 mRNA stability during cell proliferation. The EMBO Journal. 19 (10), 2340-2350 (2000).
  30. Guo, X., Connick, M. C., Vanderhoof, J., Ishak, M. A., Hartley, R. S. MicroRNA-16 modulates HuR regulation of cyclin E1 in breast cancer cells. International Journal of Molecular Sciences. 16 (4), 7112-7132 (2015).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser Ara t rmalarSay 184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır