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摘要

我们开发了一种内旋microRNA生物发生报告基因检测方法，用于具有四种质粒 的体外 细胞:一种具有内旋性miRNA，一种具有靶标，一种用于过表达调节蛋白，另一种用于Renilla荧光素酶。miRNA经过处理，可以通过与靶序列结合来控制荧光素酶的表达。

摘要

微RNA（miRNA）是短RNA分子，在真核生物中广泛存在。大多数miRNA是从内含子转录而来的，它们的成熟涉及细胞核中不同的RNA结合蛋白。成熟的miRNA经常介导基因沉默，这已成为理解转录后事件的重要工具。除此之外，它还可以被探索为一种有前途的基因疗法方法。然而，目前缺乏评估哺乳动物细胞培养物中miRNA表达的直接方法。在这里，我们描述了一种高效而简单的方法，该方法通过确认其与靶序列的相互作用来帮助确定miRNA生物发生和成熟。此外，该系统允许使用多西环素诱导的启动子将外源性miRNA成熟与其内源性活性分离，该启动子能够以高效率和低成本控制初级miRNA（pri-miRNA）转录。该工具还允许在单独的质粒中用RNA结合蛋白进行调节。除了与各种不同的miRNA及其各自的靶标一起使用外，只要这些细胞系适合转染，它还可以适应不同的细胞系。

引言

前体mRNA剪接是真核生物1中基因表达调控的重要过程。成熟RNA中内含子的去除和外显子的结合是由剪接体催化的，剪接体是一种2兆达尔顿的核糖核蛋白复合物，由5个snRNA（U1，U2，U4，U5和U6）以及100多个蛋白质2，3组成。剪接反应以共转录方式发生，并且剪接体在每个新内含子处组装，由外显子 - 内含子边界和内含子4内的保守剪接位点的识别引导。不同的内含子可能具有不同的剪接速率，尽管剪接体复合物及其组分具有显着的守恒。除了剪接位点保存的差异外，分布在内含子和外显子上的调节序列可以引导RNA结合蛋白（RBP）并刺激或抑制剪接5，6。HuR是一种普遍表达的RBP，是控制mRNA稳定性7的重要因素。我们小组先前的结果表明，HuR可以与含有miRNA的内含子结合，表明该蛋白可能是促进miRNA加工和成熟的重要因素，也导致产生替代剪接同种型6，8，9。

许多微纳（miRNA）是从内旋序列编码的。虽然有些是内含子的一部分，但其他的被称为"mirtrons"，由整个内含子10，11形成。miRNA是短的非编码RNA，长度为12的18至24个核苷酸。它们的成熟序列与mRNA中的靶序列具有部分或全部互补性，因此影响翻译和/或mRNA衰变率。miRNA和靶标的组合驱动细胞获得不同的结果。几种miRNA可以驱使细胞产生促肿瘤或抗肿瘤表型13。致癌性miRNA通常靶向触发抑制特征的mRNA，导致细胞增殖，迁移和侵袭增加14。另一方面，肿瘤抑制性miRNA可能靶向致癌性mRNA或与细胞增殖增加相关的mRNA。

miRNA的加工和成熟也取决于它们的来源。大多数内源性miRNA是在微处理器的参与下处理的，微处理器由核糖核酸酶Drosha和蛋白质辅助因子12形成。米氏物以剪接体的活性进行加工，独立于Drosha15。考虑到在内含子中发现的miRNA的高频，我们假设参与剪接的RNA结合蛋白也可以促进这些miRNA的加工和成熟。值得注意的是，RBP hnRNP A2 / B1已经与微处理器和miRNA生物发生16相关联。

我们之前已经报道过，几种RNA结合蛋白，如hnRNP和HuR，通过质谱17与内源性miRNA相关。使用免疫沉淀和计算机分析9证实了HuR（ELAVL1）与miR-17-92内旋簇的miRNA的关联。miR-17-92是一种内源性miRNA簇，由6个miRNA组成，在不同癌症中表达增加18，19。该簇也称为"oncomiR-1"，由 miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20、miR-19b 和 miR-92a组成。HuR表达的增加刺激了miR-19a和miR-19b合成9。由于该簇两侧的内源性区域与HuR相关，我们开发了一种方法来研究该蛋白是否可以调节miR-19a和miR-19b的表达和成熟。对我们的假设的一个重要预测是，作为一种调节蛋白，HuR可以促进miRNA生物发生，导致表型改变。一种可能性是miRNA是通过HuR的刺激处理的，但不会成熟和功能化，因此，蛋白质的作用不会直接影响表型。因此，我们开发了一种剪接报告基因检测法，以研究像HuR这样的RBP是否会影响内源性miRNA的生物发生和成熟。通过确认miRNA处理和成熟，我们的测定显示了与靶序列的相互作用以及成熟和功能性miRNA的产生。在我们的测定中，我们将内旋性miRNA簇的表达与荧光素酶质粒偶联，以检查培养细胞中的miRNA靶标结合。

研究方案

图 1 描述了此处描述的协议的概述。

1. 质粒构建

  1. pCAGGS-Cre:该质粒由E.马凯耶夫博士21提供。
  2. 17-92:
    1. 使用每个特定引物的0.5μM（材料表），150 ng的cDNA，1 mM dNTP，1x Taq PCR缓冲液和5 U的高保真Taq DNA聚合酶，通过PCR通过PCR前扩增。执行无模板对照PCR反应（用水代替cDNA）以检查DNA污染。
    2. 使用DNA连接酶将PCR产物在生态研究所和EcRV限制性位点之间的内含子内加入pRD-RIPE（由新加坡南洋理工大学E.马克耶夫博士提供）21 中，形成pRD-miR-17-92。通过桑格测序确认序列完整性。
  3. PMIRGLO-RAP-IB
    1. 设计正向和反向引物，两侧是 XhoI/XbaI 限制性位点，内部有一个 NotI 限制性位点。混合等摩尔量的正向和反向引物，并将混合物在90°C下孵育5分钟，然后转移到37°C下15分钟。作为对照，使用具有加扰目标序列的引物（材料表）。
    2. 使用 XhoI/XbaI 限制性内切酶切割退火片段，并将它们连接到茂铁 2 序列的下游，生成具有互补性粒细胞增多酶的检测器结构，生成用NotI裂解确认结扎。
      注意:确保引物退火后产生的悬垂与裂解反应后的载体互补。
  4. 普弗拉格-胡尔
    1. 要生成HuR过度表达的质粒，请用特定的引物扩增HuR序列。混合 300 ng cDNA、0.5 μM 每个特定引物、1 mM dNTP 混合物、1x PCR 缓冲液和 5 U 高保真 Taq DNA 聚合酶。
    2. 将PCR产物与pGEM-T连接，并通过桑格测序确认DNA序列的完整性。从pGEM-T中取出HuR片段并将其亚克隆成pfLAG-CMV-3哺乳动物表达载体以生成pfLAG-HuR载体。

2. 细胞培养

注:HeLa-Cre细胞系是E.马克耶夫21博士的礼物，甲状腺癌细胞（BCPAP）由马西莫·桑托罗博士（意大利那不勒斯"费德里科二世"大学）提供。使用HeLa细胞，甲状腺状癌细胞（BCPAP）和HEK-293T来过表达HuR。

  1. 除非另有说明，否则将细胞维持在DMEM/高葡萄糖中，补充10%胎牛血清，1mM丙酮酸钠，200mM L-谷氨酰胺和1x青霉素 - 链霉素（100 U / mL青霉素，100μg/ mL链霉素）。将细胞在37°C下在加湿的受控气氛培养箱（5%CO2）中孵育。
  2. 将贴壁细胞与胰蛋白酶/ EDTA（0.5%溶液混合物）在37°C下孵育3-5分钟。让它们从板中分离（潜伏期可能因细胞类型而异）。
  3. 按照制造商的说明，使用脂质基转染试剂进行转染。确保细胞培养物约70%汇合。通过添加适当的DNA，对所有转染组合使用相似量的DNA，如下所述。在重复中进行转染实验。
    1. 将200 ng DNA和1.25μL转染试剂混合在100μL培养基中。将转染混合物加入细胞中。将细胞与转染混合物在37°C下孵育4小时。 然后，用含有10%FBS的培养基替换培养基，并在加入抗生素进行选择之前再孵育24小时。

3. 胡氏硬度过表达

  1. 将消融阻燃剂-HuR并清空油画颜料放入海拉。通过将遗传素（G418）（1μg/mL）的浓度从100μg/mL增加到1000μg/mL来选择细胞，从而产生稳定的细胞系。
  2. 使用HuR mRNA的特异性引物进行定量PCR检测以确认过表达，如步骤7中所述。

4. 总核糖核酸分离

  1. 使用新鲜收集的细胞。胰蛋白酶消化70%汇合的细胞培养物（对于该测定，使用HeLa-Cre细胞），如步骤2.2中所述。
  2. 通过在4°C下以500× g 离心5分钟收集细胞沉淀，并用1x PBS（磷酸盐缓冲盐水）洗涤;重复离心。
  3. 将细胞沉淀重悬于1 mL的1x PBS中，并将其转移到1.5 mL微量离心管中。
  4. 在4°C下以500× g 离心5分钟。
  5. 称量干细胞沉淀，并相应地调整管的体积和大小。1毫克细胞产生约1微克的总RNA。
  6. 在罩中，向细胞沉淀中加入500-1，000μL苯酚/氯仿（理想情况下每0.25g细胞750μL），并通过上下移液并与涡流混合使其均质化。
  7. 将混合物在室温（20°C至25°C）下孵育5分钟，以允许核蛋白复合物完全解离。
  8. 在4°C下以500× g 离心样品5分钟。
  9. 将上清液转移到新的1.5 mL微量离心管中，每使用1 mL苯酚:氯仿中加入200μL氯仿。牢固地盖住样品管。
  10. 剧烈混合15秒（用手或以较低的速度短暂涡旋），并在室温（20°C至25°C）下孵育2分钟至3分钟。
  11. 在4°C下以12，000× g 离心样品15分钟。
  12. 检查是否存在下层红色苯酚 - 氯仿相，中间相和无色上层水相。RNA保留在上层水相中。在抽油烟机中，收集水相，避免接触中间相，然后转移到新鲜的管中。
  13. 通过将水相与400μL分子级异丙醇（与使用的苯酚/氯仿的比例为1:1）和每个管中的2μL糖原混合来沉淀RNA（这将有助于可视化沉淀的存在）。
  14. 用手剧烈混合或与吸头均匀混合约10秒。在−20°C下孵育15分钟或过夜。
  15. 在4°C下以12，000× g 离心样品20分钟并弃去上清液。
  16. 通过加入3体积的100%乙醇（约1mL，用DEPC水稀释）洗涤RNA沉淀，并通过涡旋混合样品，直到沉淀被释放并从底部漂浮。
  17. 在4°C下以7，500× g 离心5分钟。
  18. 通过加入1mL 75%乙醇洗涤RNA沉淀1x，并通过涡旋混合样品，直到沉淀被释放并从底部漂浮。按照步骤4.17中所述重复离心。
  19. 再进行5秒的离心旋转，以从管子的侧面收集残留液体，并用移液管除去任何残留液体，而不会干扰沉淀。
  20. 通过在室温下打开管盖3-5分钟将RNA沉淀短暂风干，并将RNA沉淀溶解在20-50μL无RNase DEPC处理的水中。将RNA在55-60°C下孵育10分钟，以促进沉淀的重悬。

5. 总RNA浓度和质量的测定

  1. 通过使用分光光度计测量260nm和280nm处的吸光度来确定RNA浓度。在下游应用中使用样品之前，请先获取全光谱数据。
  2. 通过使用0.5X TBE缓冲液（45 mM Tris碱，45 mM硼酸，1 mM EDTA）在1.5%琼脂糖凝胶上分离800-1000 ng来控制RNA质量。总RNA分为两个条带，分别指28S和18S rRNA。
    1. 制作所有试剂，并用DEPC处理过的水清洗用于电泳凝胶的所有设备。DEPC处理过的水是在烟罩中加入1 mL碳酸二乙酯到1000 mL超纯水中制备的。在室温或37°C下孵育约2小时并高压灭菌。在室温下储存长达10个月。
      注意:哺乳动物总RNA的电泳导致28S和18S rRNA的分离比例约为2:1。条带应完好无损，并可视为两条尖锐条带。降解的RNA会导致条带模糊。

6. 逆转录

  1. 使用1μg总RNA设置逆转录反应。
  2. 使用逆转录酶（见 材料表）和50 ng / μL随机十满物引物进行逆转录（RT）。
    1. 在10μL中混合RNA，随机引物和1mM dNTP混合物（10mM）。加入以下试剂:1x RT缓冲液，5 mM MgCl2，10 mM DTT，40 U RNase抑制剂和200 U逆转录酶。
    2. 在25°C下孵育10分钟，在50°C下孵育1小时（如果使用不同的酶，温度可能会发生变化）。通过在85°C下孵育5分钟来终止反应，cDNA可以在-20°C下储存。

7. 荧光定量 PCR

  1. 为了在15μL的最终体积中组装反应物，混合3μLcDNA（100ng / μL），每个引物的3.2 pmol，含有dNTPs和酶的6μL预混液以及2.8μL超纯水。
    注意:使用内源性组成基因的引物作为对照（管家基因），使HuR mRNA和miRNA的表达水平正常化。β-肌动蛋白和 snRNA U6 （RNU6B） 分别是用于 mRNA 和 miRNA 正常化的可用选项，但根据病例，其他基因也可能适用。
  2. 使用δ-ΔCt （2-ΔΔCt） 方法量化表达水平20。

8. 报告基因检测

  1. 用于测定的细胞
    1. 转染HeLa-Cre细胞中的质粒，如下所示。用pTK-雷尼拉（40纳克）转染，然后用pRD-miR-17-92转染，生成海拉-克雷米R-17-92，并选择1μg/mL嘌呤霉素。
    2. 转染海拉-克雷-米R-17-92-pTK-雷尼拉与吡格洛-RAP-IB-3ʹ-UTR或吡米格洛-加扰-3ʹ-UTR，单独。选择使用青霉素（100 U / mL）和链霉素（100μg / mL）。这些转染产生吕克-RAP-1-B和柳克加扰。
    3. 用普氏杀伤寒或空振霜转染细胞（步骤3）。
    4. 如步骤2.2中所述，继续进行细胞培养，用海拉克雷miR-17-92-luc，他拉-克雷miR-17-92-打乱，海拉克雷miR-17-92-HuR和他拉-克雷miR-17-92-胡氏混合，直到大约80%汇合。在37°C下用1μL多西环素（1μg/ mL）诱导30分钟。 此外，在同一时期内保持所有不含多西环素的细胞作为对照。
      注意:多西环素的最终浓度取决于所选的细胞系。过量的多西环素可能对哺乳动物细胞有毒。
  2. 发光检测
    1. 要量化和比较不同的发光强度，请使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒。解冻荧光素酶测定溶液，并在开始测定之前将其置于室温下。
    2. 通过在10mL荧光素酶测定缓冲液II中混合200μL底物来制备混合停止和Glo（蓝色盖管）。通过将10mL荧光素酶测定缓冲液II混合到荧光素酶测定底物II的琥珀小瓶中并摇匀来制备混合物LAR II（绿色盖管）。
    3. 将溶液转移到先前鉴定的15 mL离心管中，并避光。
      注意:作为替代方案，溶液可以预先以1-2 mL等分试样制备，并在-80°C下冷冻，以防止在铝箔中避光。
    4. 使用协同等设备执行发光读数;测量以相对光单位（RLU）表示的荧光素酶。
    5. 将结果导出到电子表格以进行进一步的统计分析。
    6. 通过对照雷尼拉（荧光素酶/雷尼拉）对萤火虫 - 荧光素酶活性进行归一化，并在图形中将其绘制为相对光单位（RLU）。对有和不联合多西环素诱导的组重复上述步骤。
    7. 计算均值和标准误 （SEM）。执行学生的 t 检验或双向方差分析，然后执行 Tukey 的后检验，以便进行组比较。这些分析以图形板等软件包形式提供。p 值 < 0.05 时的差异被视为显著。

结果

我们最初的假设是，HuR可以通过与其前miRNA序列结合来促进内源性miRNA生物发生。因此，HuR表达与miR-17-92簇生物发生的联系可能指向控制这些miRNA成熟的新机制。在三种不同的细胞系中证实了转染PFLAG-HuR时胡氏环氧铈的过表达:HeLa，BCPAP和HEK-293T（图2）。作为对照，使用未转染的细胞和用空的pfLAG载体转染的细胞。重要的是，我们观察到这些细胞中的HuR过表达刺激miR-19...

讨论

前mRNA剪接是基因表达调控的重要过程，其控制可以触发对细胞表型修饰的强烈影响22，23。超过70%的miRNA是从人类内含子转录而来的，我们假设它们的加工和成熟可以通过剪接调节蛋白24，25来促进。我们开发了一种分析内源性miRNA处理和功能的方法。我们的测定使用四种不同的质粒，并允许我们测试内源性和?...

披露声明

作者没有利益冲突。

致谢

作者感谢E.马凯耶夫（新加坡南洋理工大学）的海拉克雷细胞和pRD-RIPE和pCAGGS-Cre质粒。我们感谢埃德娜·木村、卡罗琳娜·珀塞尔·戈伊斯、吉塞拉·拉莫斯、露西亚·罗塞蒂·洛佩斯和安塞尔莫·莫里斯科特的支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Recombinant DNA
pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid)A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pFLAG-HuRGenerated during this work
pmiRGLO-RAP-IBGenerated during this work
pmiRGLO-scrambledGenerated during this work
pRD-miR-17-92Generated during this work
pRD-RIPE-donorA kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pTK-RenillaPromegaE2241
Antibodies
anti-B-actinSigma AldrichA5316
anti-HuRCell SignalingmAb 12582
IRDye 680CW Goat anti-mouse IgGLi-Cor Biosciences926-68070
IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgGLi-Cor Biosciences929-70020
Experimental Models: Cell Lines
HeLa-CreA kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
HeLa-Cre miR17-92Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuRGenerated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR-lucGenerated during this work
HeLa-Cre miR17-92-lucGenerated during this work
HeLa-Cre miR17-92-scrambledGenerated during this work
Chemicals and Peptides
DMEM/high-glucoseThermo Fisher Scientific12800-017
DoxycyclineBioBasicMB719150
Dual-Glo Luciferase Assay SystemPromegaE2940
EcoRIThermo Fisher ScientificER0271
EcoRVThermo Fisher ScientificER0301
GeneticinThermo Fisher ScientificE859-EG
L-glutamineLife Technologies
Opti-MEM ILife Technologies31985-070
pFLAG-CMV™-3 Expression VectorSigma AldrichE6783
pGEM-TPromegaA3600
Platinum Taq DNA polymeraseThermo Fisher Scientific10966-030
pmiR-GLOPromegaE1330
PuromycinSigma AldrichP8833
RNAse OUTThermo Fisher Scientific752899
SuperScript IV kitThermo Fisher Scientific18091050
Trizol-LS reagentThermo Fisher10296-028
trypsin/EDTA 10XLife Technologies15400-054
XbaIThermo Fisher Scientific10131035
XhoIPromegaR616A
Oligonucleotides
forward RAP-1B pmiRGLOExxtendTCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG
CTACTATATCAGTTTGCACAT
reverse RAP-1B pmiRGLOExxtendCTAGATGTGCAAACTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward scrambled pmiRGLOExxtendTCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA
GCTACTATATCAGGGGTAAAAT
reverse scrambled pmiRGLOExxtendCTAGATTTTACCCCTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward HuR pFLAGExxtendGCCGCGAATTCAATGTCTAAT
GGTTATGAAGAC
reverse HuR pFLAGExxtendGCGCTGATATCGTTATTTGTG
GGACTTGTTGG
forward pre-miR-1792 pRD-RIPEExxtendATCCTCGAGAATTCCCATTAG
GGATTATGCTGAG
reverse pre-miR-1792 pRD-RIPEExxtendACTAAGCTTGATATCATCTTG
TACATTTAACAGTG
forward snRNA U6 (RNU6B)ExxtendCTCGCTTCGGCAGCACATATAC
reverse snRNA U6 (RNU6B)ExxtendGGAACGCTTCACGAATTTGCGTG
forward B-Actin qPCRExxtendACCTTCTACAATGAGCTGCG
reverse B-Actin qPCRExxtendCCTGGATAGCAACGTACATGG
forward HuR qPCRExxtendATCCTCTGGCAGATGTTTGG
reverse HuR qPCRExxtendCATCGCGGCTTCTTCATAGT
forward pre-miR-1792 qPCRExxtendGTGCTCGAGACGAATTCGTCA
GAATAATGTCAAAGTG
reverse pre-miR-1792 qPCRExxtendTCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC
TCAACAGGCCG
Software and Algorithms
Prism 8 for Mac OS XGraphpadhttps://www.graphpad.com
ImageJNational Institutes of Healthhttp://imagej.nih.gov/ij

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