تقييم علامة حيوية موثوقة في نموذج فأر للإنتان الناجم عن الربط وثقب

Summary

يقدم هذا البروتوكول التفاصيل التشغيلية لربط وثقب cecal (CLP) في نموذج فأر من الإنتان. CLP هي واحدة من أكثر التقنيات المستخدمة على نطاق واسع لإنشاء نموذج حيواني للإنتان. لذلك ، يلزم وجود بروتوكول CLP موحد لتحقيق نتائج بحثية موثوقة.

Abstract

الإنتان هو مرض خطير يهدد الحياة ويتطور بسرعة ويسبب ملايين الوفيات سنويا في جميع أنحاء العالم. بذل الباحثون جهودا هائلة لتوضيح الفيزيولوجيا المرضية للإنتان باستخدام نماذج حيوانية مختلفة. يستخدم نموذج الفأر للإنتان الناجم عن ربط وثقب cecal (CLP) على نطاق واسع في المختبرات. الجوانب التقنية الثلاثة التي تؤثر على شدة وتكرار نموذج CLP هي النسبة المئوية للعرقور المربوط ، وحجم الإبرة المستخدمة في ثقب cecal ، وحجم البراز المعصور في تجويف البطن. التشخيص السريع والمحدد للإنتان هو عامل حاسم يؤثر على النتيجة. المعيار الذهبي لتشخيص الإنتان هو الثقافة الميكروبية. ومع ذلك ، فإن هذه العملية تستغرق وقتا طويلا وأحيانا غير دقيقة. يتم الكشف عن المؤشرات الحيوية الخاصة بالإنتان بسرعة ، لكن المؤشرات الحيوية الحالية غير مرضية بسبب عمر النصف القصير ، وعدم الخصوصية ، والحساسية غير الكافية. لذلك ، هناك حاجة ملحة لعلامة حيوية موثوقة للإنتان في المراحل المبكرة. تشير المنشورات السابقة إلى أن مصائد العدلات خارج الخلية المفرطة (NETs) تحدث في الإنتان. يتم رفع هيستون H3 (CitH3) ، كمكون NET ، في كل من الصرف الصحي والمرضى ، ووجود CitH3 هو علامة حيوية تشخيصية موثوقة للإنتان. تهدف الدراسة الحالية إلى وصف نموذج فأر موحد للإنتان الناجم عن CLP وإنشاء علامة حيوية موثوقة للدم للإنتان. قد يساهم عملنا في التشخيص المبكر والدقيق للإنتان في المستقبل.

Introduction

يعرف الإنتان بأنه خلل وظيفي في الأعضاء يهدد الحياة ناتج عن استجابة المضيف غير المنظمة للعدوى¹ ، والصدمة الإنتانية هي السبب الرئيسي للوفاة في الحالات الشديدة من الإنتان². يتسبب الإنتان والصدمة الإنتانية في ملايين الوفيات في جميع أنحاء العالم كل عام³. المفتاح لتحسين نتائج المرضى الذين يعانون من الإنتان هو البدء الفوري للعلاجات مثل المضادات الحيوية⁴. الطريقة القياسية الذهبية لتشخيص الإنتان هي الثقافة الميكروبية. ومع ذلك ، فإن الثقافة الميكروبية تستغرق وقتا طويلا ويمكن أن تؤدي إلى نتائج إيجابية كاذبة وسلبية كاذبة ، مما يحد بشكل كبير من الأهمية السريرية⁵. وبالتالي ، فمن المستحسن للغاية تحديد علامة حيوية الدم من الإنتان. يعرف البروكالسيتونين بأنه علامة حيوية مثالية للإنتان ولكن له فعالية تشخيصية محدودة لأنه غير قادر على التمييز بين الإنتان والأمراض المعقمة⁶.

يشيع استخدام ربط وثقب الفأر (CLP) لإنشاء نموذج للإنتان في البحث العلمي. CLP هو أحد أكثر نماذج الإنتان استخداما لأنه يحاكي التهاب الصفاق متعدد الميكروبات ، وينشط كل من الاستجابات المناعية الالتهابية والمضادة للالتهابات⁷. من المقبول جيدا أن CLP يخلق نموذج تعفن الدم أكثر ملاءمة سريريا من التقنيات البديلة ، مثل حقن السموم الداخلية البكتيرية. لذلك ، يعتبر CLP نموذج الإنتان الكلاسيكي للاستخدام في البحث⁸. ومع ذلك ، فإن العيب الرئيسي ل CLP هو قابليته للتكاثر ، حيث تتأثر شدة النموذج بعدة عوامل مثل النسبة المئوية لربط الأعور ، وحجم الإبرة ، وعدد الثقوب ، وتقنية فتح البطن. لذلك ، هناك حاجة لتوحيد نموذج الإنتان الناجم عن CLP. تصف الدراسة الحالية تفاصيل بروتوكول نموذج الإنتان الناجم عن CLP لإظهار الإجراء الموحد وزيادة قابليته للتكاثر.

تحدث الاستجابة الالتهابية في المرحلة المبكرة من الإنتان ، حيث تطلق العدلات كميات زائدة من المؤكسدات والبروتياز التي تسبب تلف الأعضاء⁸. أحد العوامل الرئيسية في الفيزيولوجيا المرضية للإنتان هو تكوين مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) ، والتي تطلق مكونات نووية وخلوية مثل الحمض النووي ، وهيستون الحمضيات ، والبروتينات المضادة للميكروبات⁹. تشير الدراسات الحديثة إلى أن التوليد المفرط للشبكات يتوسط في أمراض الإنتان. وفي الوقت نفسه ، فإن انخفاض NETs ، من خلال التثبيط الأنزيمي للببتيديل أرجينين ديميناز (PAD) بواسطة مواد كيميائية مثل YW3-56 أو Cl-amidine ، يمارس تأثيرا مؤيدا للبقاء في نماذج الفئران من الإنتان^10,11. تم تحديد هيستون H3 (CitH3) كبروتين خاص بالإنتان في عام 2011¹² ، وقد أظهرت المنشورات اللاحقة أن تركيز CitH3 المتداول هو علامة حيوية تشخيصية موثوقة للإنتان^13,14. يعتبر CitH3 علامة حيوية أكثر حساسية وطويلة الأمد من البروكالسيتونين ، وهو أكثر تحديدا في تمييز الإنتان من السيتوكينات الالتهابية¹³.

في هذه الدراسة ، قمنا بتقييم علامة حيوية تشخيصية موثوقة للإنتان في نموذج فأر ناتج عن CLP للإنتان.

Protocol

تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المعتمدة من قبل لجنة مراجعة الحيوانات في مستشفى Xiangya وجامعة سنترال ساوث (رقم 202103149).

1. التحضير

1. حدد ذكور الفئران C57BL / 6J (الوزن: 20-25 جم ؛ العمر: 8-12 أسبوعا) والمنزل لمدة 3 أيام قبل تنفيذ أي إجراءات.
2. وزن الماوس.
3. تخدير الفأر بنسبة 1.5٪ إيزوفلوران عن طريق الاستنشاق وقرص أصابع القدم للتحقق من عمق التخدير.
4. ثبت الماوس على وسادة التدفئة. ضع كريم مزيل الشعر على البطن واتركه لمدة لا تزيد عن 1 دقيقة قبل إزالة الكريم والشعر.
   ملاحظة: يجب الحفاظ على درجة حرارة الجسم الطبيعية عن طريق وضع وسادة دافئة تحت الفأر المخدر أثناء الجراحة.

2. العملية

1. إعداد أدوات جراحية معقمة مناسبة لجراحة القوارض. ارتداء قفازات معقمة وقناع للوجه وثوب جراحي لضمان ظروف معقمة.
2. تطهير جلد البطن مع مناديل اليود ثلاث مرات على الأقل. قم بتغطية المنطقة الجراحية الجراحية بستائر جراحية معقمة.
3. استخدم مقص جراحي معقم لعمل شق بطول 2 سم تقريبا في جدار البطن على طول خط ألبا.
   ملاحظة: لا تتلف الأعضاء.
4. تحديد وعزل الأعور من التجويف البريتوني مع ملاقط معقمة.
5. ربط 75 ٪ من حجم الأعور مع 4-0 خيوط الحرير. لا تقم بربط الأوعية الدموية المساريقية.
   ملاحظة: تحدد النسبة المئوية للأعور المربوط شدة الإنتان.
6. ثقب الأعور عن طريق إنشاء ثقب واحد من خلال ومن خلال (فتحتين) مع إبرة 21 G (من جانب واحد من خلال جدار cecal إلى الجانب الآخر) في نقطة المنتصف بين نهاية الذيل ومجموعة الربط.
7. تخلص من الإبرة. اضغط برفق على قطرة صغيرة من البراز من الأعور من خلال ثقوب الاختراق.
   ملاحظة: يجب أن تكون كمية البراز التي يتم ضغطها في التجويف البريتوني متسقة ، لأن هذا يحدد أيضا شدة الإنتان. يجب تخطي الخطوات 2.5-2.7 للفئران الوهمية.
8. استبدل الأعور برفق في تجويف البطن.
9. أغلق عضلات البطن والجلد بشكل منفصل باستخدام 6-0 خيوط حريرية.
10. تطهير شق مع اليود.
11. حقن كيتوبروفين (5 ملغ / كغ) في الربع السفلي الأيسر من البطن لتجنب الأعور. ضع الماوس على وسادة دافئة حتى يتعافى تماما من المخدر.
12. ضع الفأر في قفص في غرفة يتم التحكم في درجة حرارتها (22 درجة مئوية) وامنح حرية الوصول إلى الطعام والماء. تحقق من الماوس كل 6 ساعات للأسبوع الأول بعد الجراحة.
    1. القتل الرحيم للفأر بجرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون عندما تلتقي أعراض الإنتان بنقاط النهاية المحددة مسبقا.

3. العلاج

1. قسم الفئران عشوائيا إلى مجموعة وهمية ، ومجموعة CLP ، ومجموعة CLP + YW3-56 (الشكل 2 أ) ، ومجموعة CLP + Cl-amidine (الشكل 1).
   ملاحظة: خضعت المجموعة الوهمية لنفس الإجراءات التي خضعت لها مجموعات CLP باستثناء CLP. تم إعطاء YW3-56 (5 ملغ/كغ) أو كل-أميدين (40 ملغ/كغ) عن طريق الحقن البريتوني بعد ساعة واحدة من الخطوة 2.9 عند خياطة طبقة العضلات والجلد.
2. حصاد العينة
   1. حصاد الدم المحيطي من الضفيرة خلف المنظار¹⁵ 24 ساعة بعد العملية.
3. حضري المصل بالطرد المركزي (1000 × جم ، 5 دقائق) واحفظيه في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
4. قم بقياس تركيز CitH3 باستخدام مجموعة ELISA شطيرة غير مباشرة كما هو موضح سابقا¹³.
   1. قم بتغطية الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد ل CitH3 على صفيحة من 96 بئرا لالتقاط بروتين CitH3.
   2. عالج المصل باستخدام DNase I (150 وحدة / مل ، 37 درجة لمدة 1 ساعة) واحتضانه في الآبار (20 ميكرولتر ، درجة حرارة الغرفة).
   3. أضف الجسم المضاد متعدد النسيلة المضاد ل CitH3 (0.33 ميكروغرام / مل ، 100 ميكرولتر ، 2 ساعة) للكشف عن بروتين CitH3 الذي تم التقاطه.
   4. احتضان الجسم المضاد الثانوي المسمى بالبيروكسيديز المضاد للأرانب (0.02 ميكروغرام / مل ، 100 ميكرولتر ، 1 ساعة) في الآبار.
   5. بعد الغسيل الشامل ، قم بتطوير الآبار باستخدام 3،3 '، 5،5'-رباعي ميثيل بنزيدين (100 ميكرولتر ، 20 دقيقة).
      ملاحظة: تم توفير مزيد من تفاصيل البروتوكول لمجموعة ELISA في المنشور السابق¹³.
5. التحليل الإحصائي
   1. قم بإجراء تحليل ANOVA بطريقة واحدة لتحليل الاختلافات بين المجموعات الثلاث ، متبوعا باختبار Bonferroni اللاحق للمقارنات المتعددة. استخدم برنامجا إحصائيا لإجراء التحليل. واعتبرت قيم p البالغة 0.05 أو أقل ذات دلالة.

النتائج

كما هو موضح في الشكل 2A ، لم يتم اكتشاف CitH3 في المجموعة الوهمية عن طريق النشاف الغربي. زاد تركيز CitH3 في المصل بشكل ملحوظ بعد CLP ، وتم حظر هذه الزيادة عن طريق تثبيط تكوين NET عن طريق إعطاء YW3-56 ، مثبط PAD¹⁰. يوضح الشكل 2B تركيزات المصل CitH3 التي تحددها ELI...

Discussion

يدخل CLP مسببات الأمراض في البطن لإنشاء نموذج ما قبل السريري للإنتان. عند إجراء CLP ، من المهم استخدام ظروف معقمة للقضاء على تداخل البكتيريا الخارجية واستخدام جرعات دقيقة من التخدير¹⁶. الجوانب التقنية الثلاثة ل CLP التي تؤثر على شدة نموذج الإنتان وإمكانية تكراره هي النسبة المئوية ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
21G needle
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine	R&D Systems Inc	DY999
anti-CitH3 monoclonal antibody	laboratory self developed
anti-CitH3 polyclonal antibody	Abcam	ab5103
anti-rabbit secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	111-035-003
C57BL/6 mice	Xiangya School of Medicine, Central South University
Cl-amidine	Sigma Aldrich	SML2250
depilatory cream
Dnase I	Sigma Aldrich	11284932001
isoflurane	Sigma-Aldrich	26675-46-7
ketoprofen	Sigma Aldrich	PHR1375
silk sutures (4-0 & 6-0)
surgical instruments
YW3-56	GLPBIO	GC48263