Sepsisin Çekal Ligasyonu ve Delinmeye Bağlı Fare Modelinde Güvenilir Bir Biyobelirtecin Değerlendirilmesi

Özet

Bu protokol, bir fare sepsis modelinde çekal ligasyon ve ponksiyonun (CLP) operatif ayrıntılarını sunar. CLP, sepsisin hayvan modelini oluşturmak için en yaygın kullanılan tekniklerden biridir. Bu nedenle, güvenilir araştırma sonuçlarının elde edilmesi için standartlaştırılmış bir CLP protokolü gereklidir.

Özet

Sepsis, dünya çapında her yıl milyonlarca ölüme neden olan, hayatı tehdit eden ve hızla gelişen ciddi bir hastalıktır. Araştırmacılar, çeşitli hayvan modellerini kullanarak sepsisin patofizyolojisini aydınlatmak için muazzam çaba sarf etmişlerdir; çekal ligasyon ve ponksiyon (CLP) ile indüklenen sepsisin fare modeli laboratuvarlarda yaygın olarak kullanılmaktadır. CLP modelinin ciddiyetini ve tekrarlanabilirliğini etkileyen üç teknik husus, bağlı çekum yüzdesi, çekal ponksiyon için kullanılan iğnenin boyutu ve karın boşluğuna sıkılan dışkı hacmidir. Sepsisin hızlı ve spesifik tanısı sonucu etkileyen çok önemli bir faktördür. Sepsis tanısında altın standart mikrobiyal kültürdür; ancak, bu işlem zaman alıcıdır ve bazen yanlıştır. Sepsise özgü biyobelirteçlerin tespiti hızlıdır, ancak mevcut biyobelirteçler kısa yarı ömür, özgüllük ve yetersiz duyarlılık nedeniyle tatmin edici değildir. Bu nedenle, erken evrelerde güvenilir bir sepsis biyobelirtecine acil ihtiyaç vardır. Önceki yayınlar, sepsiste aşırı nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) meydana geldiğini göstermektedir. NET bileşeni olarak sitrülinlenmiş histon H3 (CitH3), hem septik hayvanlarda hem de hastalarda yükselir ve CitH3'ün varlığı sepsisin güvenilir bir tanısal biyobelirtecidir. Bu çalışmada CLP kaynaklı sepsisin standartlaştırılmış fare modelini tanımlamayı ve sepsisin güvenilir bir kan biyobelirtecini oluşturmayı amaçlamıştır. Çalışmalarımız gelecekte sepsisin erken ve doğru teşhisine katkıda bulunabilir.

Giriş

Sepsis, enfeksiyon^1'e karşı düzensiz konakçı yanıtının neden olduğu hayatı tehdit eden organ disfonksiyonu olarak tanımlanır ve septik şok, ciddi sepsis² vakalarında önde gelen ölüm nedenidir. Sepsis ve septik şok her yıl dünya çapında milyonlarca ölüme neden^{olmaktadır 3}. Sepsisli hastaların sonuçlarını iyileştirmenin anahtarı, antibiyotik⁴ gibi tedavilerin derhal başlatılmasıdır. Sepsis tanısında altın standart yöntem mikrobiyal kültürdür; Bununla birlikte, mikrobiyal kültür zaman alıcıdır ve klinik önemi büyük ölçüde sınırlayan yanlış pozitif ve yanlış negatif sonuçlara yol açabilir⁵. Bu nedenle, sepsisin bir kan biyobelirtecini tanımlamak oldukça arzu edilir. Prokalsitonin ideal bir sepsis biyobelirteci olarak kabul edilir, ancak sepsisi steril hastalıklardan ayırt edemediği için tanısal etkinliği sınırlıdır⁶.

Fare çekal ligasyonu ve ponksiyonu (CLP), bilimsel araştırmalarda bir sepsis modeli oluşturmak için yaygın olarak kullanılır. CLP en yaygın kullanılan sepsis modellerinden biridir, çünkü polimikrobiyal peritoniti taklit eder, hem proinflamatuar hem de antienflamatuar immün yanıtları aktive eder⁷. CLP'nin bakteriyel endotoksin enjeksiyonu gibi alternatif tekniklerden daha klinik olarak ilgili bir sepsis modeli oluşturduğu kabul edilmektedir. Bu nedenle, CLP, araştırma^8'de kullanılmak üzere klasik sepsis modeli olarak kabul edilir. Bununla birlikte, CLP'nin en büyük dezavantajı, model şiddeti, çekum bağlanmış yüzdesi, iğne boyutu, delinme sayısı ve laparotomi tekniği gibi çeşitli faktörlerden etkilendiğinden, tekrarlanabilirliğidir. Bu nedenle, CLP kaynaklı sepsis modelinin standartlaştırılmasına ihtiyaç vardır. Bu çalışmada, standartlaştırılmış prosedürü göstermek ve tekrarlanabilirliğini artırmak için CLP kaynaklı sepsis modelinin protokol detayları açıklanmaktadır.

Enflamatuar yanıt, sepsisin erken evresinde ortaya çıkar ve nötrofiller, organ hasarına neden olan aşırı miktarda oksidan ve proteaz salgılar⁸. Sepsisin patofizyolojisinde anahtar bir faktör, DNA, sitrülinlenmiş histonlar ve antimikrobiyal proteinazlar gibi nükleer ve sitozolik bileşenleri serbest bırakan nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) oluşumudur⁹. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, aşırı NET oluşumunun sepsis patolojisine aracılık ettiğini; Bu arada, peptidil arginin deiminazın (PAD) YW3-56 veya Cl-amidin gibi kimyasallar tarafından enzimatik inhibisyonu yoluyla NET'lerin azalması, sepsis^10,11'in fare modellerinde hayatta kalma yanlısı bir etki göstermektedir. Sitrüllinlenmiş histon H3 (CitH3) 2011 yılında sepsise özgü bir protein olarak tanımlanmıştır¹² ve sonraki yayınlar dolaşımdaki CitH3 konsantrasyonunun sepsis ^13,14'ün güvenilir bir tanısal biyobelirteci olduğunu göstermiştir. CitH3, prokalsitoninden daha hassas ve uzun ömürlü bir biyobelirteç olarak kabul edilir ve sepsisi ayırt etmede inflamatuar sitokinlerden daha spesifiktir¹³.

Bu çalışmada, CLP ile indüklenen bir sepsis fare modelinde sepsisin güvenilir bir tanısal biyobelirtecini değerlendirdik.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Xiangya Hastanesi ve Central South Üniversitesi'ndeki Hayvan İnceleme Komitesi (No. 202103149) tarafından onaylanan kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Hazırlık

1. Erkek C57BL/6J farelerini (ağırlık: 20-25 g; yaş: 8-12 hafta) seçin ve herhangi bir işlem yapmadan önce 3 gün boyunca evde konaklayın.
2. Fareyi tartın.
3. Fareyi soluyarak% 1.5 izofluran ile uyuşturun ve anestezi derinliğini kontrol etmek için ayak parmaklarını sıkıştırın.
4. Fareyi ısıtma yastığına sabitleyin. Karnına tüy dökücü krem uygulayın ve kremi ve saçları çıkarmadan önce 1 dakikadan fazla bekletmeyin.
   NOT: Ameliyat sırasında anestezi uygulanan farenin altına sıcak bir ped yerleştirilerek normal vücut ısısı korunmalıdır.

2. Operasyon

1. Kemirgen hayvan cerrahisi için uygun steril cerrahi aletler hazırlayın. Aseptik koşulları sağlamak için steril eldivenler, yüz maskesi ve cerrahi bir elbise giyin.
2. Karın derisini iyotlu mendillerle en az üç kez dezenfekte edin. Ameliyat bölgesini steril cerrahi örtülerle örtün.
3. Linea alba boyunca karın duvarında yaklaşık 2 cm'lik bir kesi yapmak için steril cerrahi makas kullanın.
   NOT: Organlara zarar vermeyin.
4. Çekumu peritoneal boşluktan steril cımbızla tanımlayın ve izole edin.
5. Çekumun hacminin% 75'ini 4-0 ipek dikişle bağlayın. Mezenterik kan damarlarını yağlamayın.
   NOT: Bağlı olan çekumun yüzdesi sepsisin şiddetini belirler.
6. Kuyruk ucu ile ligasyon seti arasındaki orta noktada 21 G'lik bir iğne ile (bir taraftan çekal duvardan karşı tarafa) bir adet içinden ve içinden delinme (iki delik) oluşturarak çekumu delin.
7. İğneyi atın. Penetrasyon deliklerinden çekumdan küçük bir dışkı damlacığını hafifçe sıkın.
   NOT: Peritoneal boşluğa sıkılan dışkı miktarı tutarlı olmalıdır, çünkü bu aynı zamanda sepsisin şiddetini de belirler. Sahte fareler için 2.5-2.7 arası adımlar atlanmalıdır.
8. Çekumu yavaşça karın boşluğuna değiştirin.
9. Karın kası ve cildi 6-0 ipek dikişle ayrı ayrı kapatın.
10. Kesini iyotla dezenfekte edin.
11. Çekumdan kaçınmak için ketoprofen (5 mg / kg) karnın sol alt çeyreğine enjekte edin. Fareyi anesteziden tamamen iyileşene kadar ılık bir pedin üzerine yerleştirin.
12. Fareyi sıcaklık kontrollü bir odada (22 °C) bir kafese yerleştirin ve yiyecek ve suya serbest erişim sağlayın. Postoperatif ilk hafta boyunca fareyi her 6 saatte bir kontrol edin.
    1. Sepsis semptomları önceden tanımlanmış son noktaları karşıladığında fareyi karbondioksit doz aşımı ile ötenazileştirin.

3. Tedavi

1. Fareleri rastgele sahte gruba, CLP grubuna, CLP + YW3-56 grubuna (Şekil 2a) ve CLP + Cl-amidin grubuna (Şekil 1) bölün.
   NOT: Sahte grup, CLP dışındaki CLP gruplarıyla aynı yordamlara tabi tutulmuştur. YW3-56 (5 mg / kg) veya Cl-amidin (40 mg / kg), kas ve cilt tabakası dikilirken adım 2.9'dan 1 saat sonra periton enjeksiyonu yoluyla uygulandı.
2. Örnek hasat
   1. Ameliyattan¹⁵ 24 saat sonra retrobulber pleksustan periferik kan toplayın.
3. Serumu santrifüjleme (1.000 x g, 5 dakika) ile hazırlayın ve kullanıma kadar -80 ° C'de saklayın.
4. CitH3 konsantrasyonunu, daha önce tarif edildiği gibi dolaylı bir sandviç ELISA kiti kullanarak ölçün¹³.
   1. CitH3 proteinini yakalamak için anti-CitH3 monoklonal antikorunu 96 delikli bir plaka üzerine kaplayın.
   2. Serumu DNaz I (150 birim / mL, 1 saat boyunca 37 °) ile tedavi edin ve kuyucuklarda (20 μL, oda sıcaklığı) inkübe edin.
   3. Yakalanan CitH3 proteinini tespit etmek için anti-CitH3 poliklonal antikoru (0.33 μg / mL, 100 μL, 2 saat) ekleyin.
   4. Tavşan karşıtı peroksidaz etiketli sekonder antikoru (0.02 μg/mL, 100 μl, 1 saat) kuyucuklarda inkübe edin.
   5. İyice yıkamadan sonra, kuyuları 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (100 μL, 20 dakika) ile geliştirin.
      NOT: ELISA kitinin diğer protokol ayrıntıları önceki yayın^13'te verilmiştir.
5. İstatistiksel analiz
   1. Üç grup arasındaki farklılıkları analiz etmek için bir yol ANOVA'yı gerçekleştirin, ardından çoklu karşılaştırmalar için Bonferroni post hoc testi yapın. Analizi gerçekleştirmek için istatistiksel bir yazılım kullanın. 0.05 veya daha düşük p değerleri anlamlı olarak kabul edildi.

Sonuçlar

Şekil 2A'da gösterildiği gibi, batı lekelenmesi ile sahte grupta CitH3 tespit edilmemiştir. CLP'den sonra serum CitH3 konsantrasyonu önemli ölçüde artmıştır ve bu artış, bir PAD inhibitörü¹⁰ olan YW3-56'nın uygulanması yoluyla NET oluşumunun inhibisyonu ile bloke edilmiştir. Şekil 2B, ELISA tarafından belirlenen serumCitH3 konsantrasyonlarını göstermektedir. CLP'den 24 saat sonra, CLP gruplarında CitH3'?...

Tartışmalar

CLP, preklinik bir sepsis modeli oluşturmak için karın içine patojenler sokar. CLP yaparken, eksojen bakterilerin girişimini ortadan kaldırmak ve doğru anestezik dozajlarını kullanmak için steril koşullar kullanmak önemlidir¹⁶. CLP'nin sepsis modelinin ciddiyetini ve tekrarlanabilirliğini etkileyen üç teknik yönü, bağlı çekumun yüzdesi, çekal ponksiyon için kullanılan iğnenin büyüklüğü ve karın boşluğuna sıkılan dışkı hacmidir. Çekumun yaklaşık% 75'inin ba?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
21G needle
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine	R&D Systems Inc	DY999
anti-CitH3 monoclonal antibody	laboratory self developed
anti-CitH3 polyclonal antibody	Abcam	ab5103
anti-rabbit secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	111-035-003
C57BL/6 mice	Xiangya School of Medicine, Central South University
Cl-amidine	Sigma Aldrich	SML2250
depilatory cream
Dnase I	Sigma Aldrich	11284932001
isoflurane	Sigma-Aldrich	26675-46-7
ketoprofen	Sigma Aldrich	PHR1375
silk sutures (4-0 & 6-0)
surgical instruments
YW3-56	GLPBIO	GC48263