Evaluación de un biomarcador fiable en un modelo de sepsis de sepsis inducida por punción cecal y ligadura cecal

Resumen

Este protocolo presenta los detalles operatorios de la ligadura y punción cecal (CLP) en un modelo de sepsis en ratones. CLP es una de las técnicas más utilizadas para crear un modelo animal de sepsis. Por lo tanto, se requiere un protocolo CLP estandarizado para el logro de resultados de investigación confiables.

Resumen

La sepsis es una enfermedad grave potencialmente mortal y de rápido desarrollo que causa millones de muertes anualmente en todo el mundo. Los investigadores han hecho enormes esfuerzos para dilucidar la fisiopatología de la sepsis utilizando varios modelos animales; el modelo de ratón de sepsis inducida por ligadura y punción cecal (CLP) es ampliamente utilizado en los laboratorios. Los tres aspectos técnicos que afectan la gravedad y replicabilidad del modelo CLP son el porcentaje de ciego ligado, el tamaño de la aguja utilizada para la punción cecal y el volumen de heces comprimidas en la cavidad abdominal. El diagnóstico rápido y específico de sepsis es un factor crucial que afecta el resultado. El estándar de oro para el diagnóstico de sepsis es el cultivo microbiano; Sin embargo, este proceso lleva mucho tiempo y, a veces, es inexacto. La detección de biomarcadores específicos de sepsis es rápida, pero los biomarcadores existentes son insatisfactorios debido a una vida media corta, no especificidad y sensibilidad insuficiente. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de un biomarcador confiable de sepsis en las primeras etapas. Publicaciones anteriores sugieren que el exceso de trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) ocurren en la sepsis. La histona citrulinada H3 (CitH3), como componente NET, está elevada tanto en animales sépticos como en pacientes, y la presencia de CitH3 es un biomarcador diagnóstico fiable de sepsis. El presente estudio tuvo como objetivo describir un modelo estandarizado de ratón de sepsis inducida por CLP y establecer un biomarcador sanguíneo confiable de sepsis. Nuestro trabajo puede contribuir al diagnóstico temprano y preciso de la sepsis en el futuro.

Introducción

La sepsis se define como una disfunción orgánica potencialmente mortal causada por una respuesta desregulada del huésped a la infección¹, y el shock séptico es la principal causa de muerte en casos graves de sepsis². La sepsis y el shock séptico causan millones de muertes en todo el mundo cada año³. La clave para mejorar el resultado de los pacientes con sepsis es el inicio oportuno de tratamientos como los antibióticos⁴. El método estándar de oro para el diagnóstico de la sepsis es el cultivo microbiano; Sin embargo, el cultivo microbiano consume mucho tiempo y puede conducir a resultados falsos positivos y falsos negativos, lo que limita en gran medida la importancia clínica⁵. Por lo tanto, es altamente deseable identificar un biomarcador sanguíneo de sepsis. La procalcitonina es reconocida como un biomarcador ideal de sepsis, pero tiene una eficacia diagnóstica limitada porque es incapaz de distinguir la sepsis de las enfermedades estériles⁶.

La ligadura y punción cecal del ratón (CLP) se usa comúnmente para crear un modelo de sepsis en la investigación científica. La CLP es uno de los modelos de sepsis más utilizados porque imita la peritonitis polimicrobiana, activando respuestas inmunes tanto proinflamatorias como antiinflamatorias⁷. Es bien aceptado que CLP crea un modelo de sepsis clínicamente más relevante que las técnicas alternativas, como la inyección de endotoxina bacteriana. Por lo tanto, CLP es considerado el modelo clásico de sepsis para su uso en investigación⁸. Sin embargo, una desventaja importante de CLP es su reproducibilidad, ya que la gravedad del modelo se ve afectada por varios factores, como el porcentaje de ciego ligado, el tamaño de la aguja, el número de punciones y la técnica de laparotomía. Por lo tanto, es necesario estandarizar el modelo de sepsis inducida por CLP. El presente estudio describe los detalles del protocolo del modelo de sepsis inducida por CLP para mostrar el procedimiento estandarizado y aumentar su reproducibilidad.

La respuesta inflamatoria ocurre en la etapa temprana de la sepsis, con neutrófilos liberando cantidades excesivas de oxidantes y proteasas que causan daño a los órganos⁸. Un factor clave en la fisiopatología de la sepsis es la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (TNE), que liberan componentes nucleares y citosólicos como ADN, histonas citrulinadas y proteinasas antimicrobianas⁹. Estudios recientes sugieren que la generación excesiva de TNE media la patología de la sepsis; mientras tanto, una disminución de los TNE, a través de la inhibición enzimática de peptidil arginina deiminasa (PAD) por productos químicos como YW3-56 o Cl-amidina, ejerce un efecto pro-supervivencia en modelos de ratón de sepsis^10,11. La histona citrulinada H3 (CitH3) fue identificada como una proteína específica de sepsis en 2011¹², y publicaciones posteriores han demostrado que la concentración circulante de CitH3 es un biomarcador diagnóstico fiable de sepsis^13,14. La citH3 se considera un biomarcador más sensible y duradero que la procalcitonina, y es más específica para distinguir la sepsis que las citoquinas inflamatorias¹³.

En este estudio, hemos evaluado un biomarcador diagnóstico fiable de sepsis en un modelo de sepsis de ratón inducido por CLP.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices aprobadas por el Comité de Revisión de Animales del Hospital Xiangya y la Universidad Central del Sur (No. 202103149).

1. Preparación

1. Seleccione ratones machos C57BL / 6J (peso: 20-25 g; edad: 8-12 semanas) y albergue durante 3 días antes de realizar cualquier procedimiento.
2. Pesa el ratón.
3. Anestesiar al ratón con isoflurano al 1,5% por inhalación y pellizcar los dedos de los pies para comprobar la profundidad de la anestesia.
4. Fije el ratón en la almohadilla térmica. Aplique crema depilatoria en el abdomen y déjela por no más de 1 minuto antes de quitar la crema y el vello.
   NOTA: La temperatura corporal normal debe mantenerse colocando una almohadilla caliente debajo del ratón anestesiado durante la cirugía.

2. Funcionamiento

1. Preparar instrumentos quirúrgicos estériles adecuados para la cirugía de animales roedores. Use guantes estériles, una mascarilla y una bata quirúrgica para garantizar condiciones asépticas.
2. Desinfecte la piel abdominal con toallitas de yodo al menos tres veces. Cubra el área quirúrgica quirúrgica con cortinas quirúrgicas estériles.
3. Use tijeras quirúrgicas estériles para hacer una incisión de aproximadamente 2 cm en la pared abdominal a lo largo de la línea alba.
   NOTA: No dañe los órganos.
4. Identificar y aislar el ciego fuera de la cavidad peritoneal con pinzas estériles.
5. Ligate el 75% del volumen del ciego con suturas de seda 4-0. No ligar los vasos sanguíneos mesentéricos.
   NOTA: El porcentaje del ciego que se liga determina la gravedad de la sepsis.
6. Perforar el ciego creando una perforación a través y a través (dos orificios) con una aguja de 21 G (desde un lado a través de la pared cecal hasta el lado opuesto) en el punto medio entre el extremo de la cola y el conjunto de ligadura.
7. Deseche la aguja. Exprima suavemente una pequeña gota de heces fuera del ciego a través de los orificios de penetración.
   NOTA: La cantidad de heces comprimidas en la cavidad peritoneal debe ser consistente, ya que esto también determina la gravedad de la sepsis. Los pasos 2.5-2.7 deben omitirse para ratones simulados.
8. Reemplace suavemente el ciego en la cavidad abdominal.
9. Cierre el músculo abdominal y la piel por separado con suturas de seda 6-0.
10. Desinfecte la incisión con yodo.
11. Inyecte ketoprofeno (5 mg/kg) en el cuadrante inferior izquierdo del abdomen para evitar el ciego. Coloque el ratón en una almohadilla caliente hasta que se haya recuperado completamente de la anestesia.
12. Coloque el ratón en una jaula en una habitación con temperatura controlada (22 ° C) y dé acceso gratuito a alimentos y agua. Revise el ratón cada 6 h durante la primera semana después de la operación.
    1. Eutanasia al ratón por sobredosis de dióxido de carbono cuando los síntomas de sepsis cumplan con los criterios de valoración predefinidos.

3. Tratamiento

1. Divida aleatoriamente los ratones en el grupo simulado, grupo CLP, grupo CLP + YW3-56 (Figura 2a) y CLP + grupo Cl-amidina (Figura 1).
   NOTA: El grupo simulado se sometió a los mismos procedimientos que los grupos CLP, excepto CLP. YW3-56 (5 mg/kg) o Cl-amidina (40 mg/kg) se administró mediante inyección peritoneal 1 h después del paso 2,9 al suturar la capa muscular y cutánea.
2. Muestra de cosecha
   1. Recolectar sangre periférica del plexo retrobulbar¹⁵ 24 h después de la operación.
3. Preparar el suero por centrifugación (1.000 x g, 5 min) y conservar a -80 °C hasta su uso.
4. Mida la concentración de CitH3 utilizando un kit ELISA sándwich indirecto como se describió anteriormente¹³.
   1. Cubra el anticuerpo monoclonal anti-CitH3 en una placa de 96 pocillos para capturar la proteína CitH3.
   2. Tratar el suero con DNasa I (150 unidades/ml, 37° durante 1 h) e incubar en los pocillos (20 μL, temperatura ambiente).
   3. Añadir anticuerpo policlonal anti-CitH3 (0,33 μg/ml, 100 μL, 2 h) para detectar la proteína CitH3 capturada.
   4. Incubar el anticuerpo secundario marcado con peroxidasa anti-conejo (0,02 μg/ml, 100 μl, 1 h) en los pocillos.
   5. Después de un lavado completo, desarrollar los pocillos con 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (100 μL, 20 min).
      NOTA: En la publicación anterior¹³ se proporcionan más detalles del protocolo del kit ELISA.
5. Análisis estadístico
   1. Realice un ANOVA unidireccional para analizar las diferencias entre los tres grupos, seguido de pruebas post hoc de Bonferroni para comparaciones múltiples. Utilice un software estadístico para realizar el análisis. Los valores de p de 0,05 o menos se consideraron significativos.

Resultados

Como se muestra en la Figura 2A, no se detectó CitH3 en el grupo simulado por Western blotting. La concentración sérica de CitH3 aumentó significativamente después de CLP, y este aumento fue bloqueado por la inhibición de la formación de NET a través de la administración de YW3-56, un inhibidor de la EAP¹⁰. La figura 2B muestra las concentraciones séricas de CitH3 determinadas por ELISA. A las 24 h después de CLP, la c...

Discusión

CLP introduce patógenos en el abdomen para crear un modelo preclínico de sepsis. Al realizar CLP, es importante utilizar condiciones estériles para eliminar la interferencia de bacterias exógenas y utilizar dosis precisas de anestésicos¹⁶. Los tres aspectos técnicos de CLP que afectan la gravedad y replicabilidad del modelo de sepsis son el porcentaje de ciego ligado, el tamaño de la aguja utilizada para la punción cecal y el volumen de heces comprimidas en la cavidad abdominal. La ligadur...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
21G needle
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine	R&D Systems Inc	DY999
anti-CitH3 monoclonal antibody	laboratory self developed
anti-CitH3 polyclonal antibody	Abcam	ab5103
anti-rabbit secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	111-035-003
C57BL/6 mice	Xiangya School of Medicine, Central South University
Cl-amidine	Sigma Aldrich	SML2250
depilatory cream
Dnase I	Sigma Aldrich	11284932001
isoflurane	Sigma-Aldrich	26675-46-7
ketoprofen	Sigma Aldrich	PHR1375
silk sutures (4-0 & 6-0)
surgical instruments
YW3-56	GLPBIO	GC48263