Avaliação de um Biomarcador Confiável em um Modelo de Sepse de Camundongo Induzido por Ligadura Cecal e Punção

Resumo

Este protocolo apresenta os detalhes operatórios da ligadura e punção cecal (FLP) em um modelo de sepse em camundongo. O CLP é uma das técnicas mais utilizadas para criar um modelo animal de sepse. Portanto, um protocolo CLP padronizado é necessário para a obtenção de resultados de pesquisa confiáveis.

Resumo

A sepse é uma doença grave com risco de vida e em rápido desenvolvimento que causa milhões de mortes anualmente em todo o mundo. Os pesquisadores fizeram enormes esforços para elucidar a fisiopatologia da sepse usando vários modelos animais; o modelo de sepse induzida por ligadura e punção cecal (FLP) em camundongos é amplamente utilizado em laboratórios. Os três aspectos técnicos que afetam a gravidade e a replicabilidade do modelo de FLP são a porcentagem de ceco ligado, o tamanho da agulha utilizada para punção cecal e o volume de fezes espremidas na cavidade abdominal. O diagnóstico rápido e específico da sepse é um fator crucial que afeta o desfecho. O padrão-ouro para o diagnóstico de sepse é a cultura microbiana; no entanto, esse processo é demorado e às vezes impreciso. A detecção de biomarcadores específicos de sepse é rápida, mas os biomarcadores existentes são insatisfatórios devido a uma meia-vida curta, inespecificidade e sensibilidade insuficiente. Portanto, há uma necessidade urgente de um biomarcador confiável de sepse nos estágios iniciais. Publicações anteriores sugerem que armadilhas extracelulares (TNEs) excessivas de neutrófilos ocorrem na sepse. A histona H3 citrulinada (CitH3), como componente NET, está elevada tanto em animais sépticos quanto em pacientes, e a presença de CitH3 é um biomarcador diagnóstico confiável de sepse. O presente estudo teve como objetivo descrever um modelo padronizado de sepse induzida por FLP em camundongos e estabelecer um biomarcador sanguíneo confiável de sepse. Nosso trabalho pode contribuir para o diagnóstico precoce e preciso da sepse no futuro.

Introdução

A sepse é definida como disfunção de órgãos com risco de vida causada por uma resposta desregulada do hospedeiro à infecção¹, e o choque séptico é a principal causa de morte em casos graves de sepse². A sepse e o choque séptico causam milhões de mortes em todo o mundo a cada ano³. A chave para melhorar o desfecho de pacientes com sepse é o início imediato de tratamentos como antibióticos⁴. O método padrão-ouro para o diagnóstico de sepse é a cultura microbiana; no entanto, a cultura microbiana é demorada e pode levar a resultados falso-positivos e falso-negativos, o que limita sobremaneira a significância clínica⁵. Assim, é altamente desejável identificar um biomarcador sanguíneo de sepse. A procalcitonina é reconhecida como um biomarcador ideal de sepse, mas tem eficácia diagnóstica limitada por ser incapaz de distinguir sepse de doenças estéreis⁶.

A ligadura e punção cecal de camundongos (CLP) é comumente usada para criar um modelo de sepse em pesquisas científicas. A FLP é um dos modelos de sepse mais utilizados, pois mimetiza a peritonite polimicrobiana, ativando respostas imunes pró-inflamatórias e anti-inflamatórias⁷. É bem aceito que a FLP cria um modelo de sepse clinicamente mais relevante do que técnicas alternativas, como a injeção de endotoxina bacteriana. Portanto, a FLP é considerada o modelo clássico de sepse para uso em pesquisas⁸. No entanto, uma grande desvantagem da FLP é sua reprodutibilidade, pois a gravidade do modelo é afetada por vários fatores, como a porcentagem de ceco ligado, o tamanho da agulha, o número de punções e a técnica de laparotomia. Portanto, há necessidade de padronizar o modelo de sepse induzida por FLP. O presente estudo descreve os detalhes do protocolo do modelo de sepse induzida por FLP para mostrar o procedimento padronizado e aumentar sua reprodutibilidade.

A resposta inflamatória ocorre no estágio inicial da sepse, com neutrófilos liberando quantidades excessivas de oxidantes e proteases que causam danos aos órgãos⁸. Um fator-chave na fisiopatologia da sepse é a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (TNEs), que liberam componentes nucleares e citosólicos, como DNA, histonas citrulinadas e proteinases antimicrobianas⁹. Estudos recentes sugerem que a geração excessiva de TNEs medeia a patologia da sepse; enquanto isso, uma diminuição dos TNEs, através da inibição enzimática da peptidil arginina deiminase (DAP) por substâncias químicas como YW3-56 ou Cl-amidina, exerce um efeito pró-sobrevivência em modelos de camundongos de sepse^10,11. A histona Citrulina H3 (CitH3) foi identificada como uma proteína específica da sepse em 2011¹², e publicações subsequentes demonstraram que a concentração circulante de CitH3 é um biomarcador diagnóstico confiável de sepse^13,14. O CitH3 é considerado um biomarcador mais sensível e duradouro que a procalcitonina, sendo mais específico na distinção entre sepse do que citocinas inflamatórias¹³.

Neste estudo, avaliamos um biomarcador diagnóstico confiável de sepse em um modelo de sepse induzido por FLP em camundongos.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas pelo Comitê de Revisão Animal do Hospital Xiangya e da Universidade Central do Sul (No. 202103149).

1. Preparação

1. Selecione camundongos machos C57BL/6J (peso: 20-25 g; idade: 8-12 semanas) e hospede por 3 dias antes de realizar qualquer procedimento.
2. Pese o mouse.
3. Anestesiar o rato com isoflurano a 1,5% por inalação e beliscar os dedos dos pés para verificar a profundidade da anestesia.
4. Fixe o mouse na almofada de aquecimento. Aplique creme depilatório no abdômen e deixe por não mais de 1 minuto antes de remover o creme e o cabelo.
   NOTA: A temperatura corporal normal deve ser mantida colocando uma almofada quente sob o rato anestesiado durante a cirurgia.

2. Funcionamento

1. Prepare instrumentos cirúrgicos estéreis adequados para cirurgia de animais roedores. Use luvas estéreis, uma máscara facial e um avental cirúrgico para garantir condições assépticas.
2. Desinfete a pele abdominal com lenços umedecidos de iodo pelo menos três vezes. Cubra a área cirúrgica operatória com cortinas cirúrgicas estéreis.
3. Use tesouras cirúrgicas estéreis para fazer uma incisão de aproximadamente 2 cm na parede abdominal ao longo da linha alba.
   NOTA: Não danifique os órgãos.
4. Identifique e isole o ceco para fora da cavidade peritoneal com pinças estéreis.
5. Ligue 75% do volume do ceco com suturas de seda 4-0. Não ligue os vasos sanguíneos mesentéricos.
   NOTA: A percentagem do ceco que é ligado determina a gravidade da sépsis.
6. Perfure o ceco criando uma perfuração através de um através e através (dois furos) com uma agulha 21 G (de um lado através da parede cecal para o lado oposto) no ponto médio entre a extremidade da cauda e o conjunto de ligadura.
7. Descarte a agulha. Esprema suavemente uma pequena gota de fezes para fora do ceco através dos orifícios de penetração.
   NOTA: A quantidade de fezes espremidas na cavidade peritoneal deve ser consistente, pois isso também determina a gravidade da sepse. As etapas 2.5-2.7 devem ser ignoradas para camundongos simulados.
8. Substitua suavemente o ceco na cavidade abdominal.
9. Feche o músculo abdominal e a pele separadamente com suturas de seda 6-0.
10. Desinfete a incisão com iodo.
11. Injete cetoprofeno (5 mg/kg) no quadrante inferior esquerdo do abdômen para evitar o ceco. Coloque o rato numa almofada quente até que tenha recuperado totalmente do anestésico.
12. Coloque o rato numa gaiola numa sala com temperatura controlada (22 °C) e dê livre acesso a alimentos e água. Verifique o rato a cada 6 h para a primeira semana de pós-operatório.
    1. Eutanasiar o rato por overdose de dióxido de carbono quando os sintomas de sépsis satisfizerem os parâmetros de avaliação pré-definidos.

3. Tratamento

1. Divida aleatoriamente os camundongos em grupo sham, grupo CLP, grupo CLP + YW3-56 (Figura 2a) e grupo CLP + Cl-amidine (Figura 1).
   NOTA: O grupo simulado foi submetido aos mesmos procedimentos que os grupos FLP, exceto CLP. YW3-56 (5 mg/kg) ou Cl-amidina (40 mg/kg) foi administrada via injeção peritoneal 1 h após o passo 2.9 ao suturar a camada muscular e cutânea.
2. Colheita da amostra
   1. Colher sangue periférico do plexo retrobulbar¹⁵ 24 h após a operação.
3. Preparar o soro por centrifugação (1.000 x g, 5 min) e conservar a -80 °C até à sua utilização.
4. Meça a concentração de CitH3 usando um kit ELISA sanduíche indireto, conforme descrito anteriormente¹³.
   1. Revestir o anticorpo monoclonal anti-CitH3 em uma placa de 96 poços para capturar a proteína CitH3.
   2. Tratar o soro com DNase I (150 unidade/mL, 37°por 1 h) e incubar nos poços (20 μL, temperatura ambiente).
   3. Adicionar anticorpo policlonal anti-CitH3 (0,33 μg/mL, 100 μL, 2 h) para detectar a proteína CitH3 capturada.
   4. Incubar o anticorpo secundário marcado com peroxidase de coelho (0,02 μg/mL, 100 μl, 1 h) nos poços.
   5. Após lavagem minuciosa, desenvolver os poços com 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (100 μL, 20 min).
      NOTA: Mais detalhes do protocolo do kit ELISA são fornecidos na publicação anterior¹³.
5. Análise estatística
   1. Realizar ANOVA unidirecional para analisar as diferenças entre os três grupos, seguida de teste post hoc de Bonferroni para comparações múltiplas. Use um software estatístico para realizar a análise. valores de p de 0,05 ou menos foram considerados significativos.

Resultados

Como mostrado na Figura 2A, nenhum CitH3 foi detectado no grupo sham por western blotting. A concentração sérica de CitH3 aumentou significativamente após a FLP, e esse aumento foi bloqueado pela inibição da formação de NET através da administração de YW3-56, um inibidor de DAP¹⁰. A Figura 2B mostra as concentrações séricas de CitH3 determinadas por ELISA. Às 24 h após a FLP, a concentração sérica de CitH3 foi ...

Discussão

A FLP introduz patógenos no abdômen para criar um modelo pré-clínico de sepse. Ao realizar a FLP, é importante utilizar condições estéreis para eliminar a interferência de bactérias exógenas e utilizar dosagens precisas de anestésicos¹⁶. Os três aspectos técnicos da FLP que afetam a gravidade e a replicabilidade do modelo de sepse são a porcentagem do ceco ligado, o tamanho da agulha usada para punção cecal e o volume de fezes espremidas na cavidade abdominal. A ligadura de aproxi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
21G needle
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine	R&D Systems Inc	DY999
anti-CitH3 monoclonal antibody	laboratory self developed
anti-CitH3 polyclonal antibody	Abcam	ab5103
anti-rabbit secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	111-035-003
C57BL/6 mice	Xiangya School of Medicine, Central South University
Cl-amidine	Sigma Aldrich	SML2250
depilatory cream
Dnase I	Sigma Aldrich	11284932001
isoflurane	Sigma-Aldrich	26675-46-7
ketoprofen	Sigma Aldrich	PHR1375
silk sutures (4-0 & 6-0)
surgical instruments
YW3-56	GLPBIO	GC48263