הערכה של סמן ביולוגי אמין במודל של אלח דם של אלח דם של אלח דם הנגרם על-ידי נקב

Summary

פרוטוקול זה מציג את הפרטים האופרטיביים של קשירת cecal ונקב (CLP) במודל עכבר של אלח דם. CLP היא אחת הטכניקות הנפוצות ביותר ליצירת מודל חייתי של אלח דם. לכן, נדרש פרוטוקול CLP סטנדרטי להשגת תוצאות מחקר אמינות.

Abstract

אלח דם היא מחלה מסכנת חיים ומתפתחת במהירות הגורמת למיליוני מקרי מוות מדי שנה ברחבי העולם. חוקרים עשו מאמצים אדירים להבהיר את הפתופיזיולוגיה של אלח דם באמצעות מודלים שונים של בעלי חיים; מודל העכבר של אלח דם המושרה על ידי קשירת cecal ונקב (CLP) נמצא בשימוש נרחב במעבדות. שלושת ההיבטים הטכניים המשפיעים על חומרתו ושכפולו של מודל CLP הם אחוז הצקום הקשור, גודל המחט המשמשת לניקוב cecal, ונפח הצואה הנדחקת לחלל הבטן. האבחנה המהירה והספציפית של אלח דם היא גורם מכריע המשפיע על התוצאה. תקן הזהב לאבחון אלח דם הוא תרבית מיקרוביאלית; עם זאת, תהליך זה גוזל זמן ולעיתים אינו מדויק. הזיהוי של סמנים ביולוגיים ספציפיים לאלח דם הוא מהיר, אך הסמנים הביולוגיים הקיימים אינם מספקים בשל זמן מחצית חיים קצר, חוסר ספציפיות ורגישות לא מספקת. לכן, יש צורך דחוף סמן ביולוגי אמין של אלח דם בשלבים המוקדמים. פרסומים קודמים מצביעים על כך שמלכודות חוץ-תאיות מוגזמות של נויטרופילים (NETs) מתרחשות באלח דם. היסטון H3 (CitH3), כמרכיב NET, מוגבה הן בבעלי חיים סופגים והן בחולים, ונוכחותו של CitH3 היא סמן ביולוגי אבחוני אמין של אלח דם. המחקר הנוכחי נועד לתאר מודל עכברי סטנדרטי של אלח דם המושרה על ידי CLP ולבסס סמן ביולוגי אמין בדם של אלח דם. עבודתנו עשויה לתרום לאבחון מוקדם ומדויק של אלח דם בעתיד.

Introduction

אלח דם מוגדר כתפקוד לקוי של איברים מסכני חיים הנגרם על ידי תגובת מארח לא מווסתת לזיהום¹, והלם ספטי הוא סיבת המוות המובילה במקרים חמורים של אלח דם². אלח דם והלם ספטי גורמים למיליוני מקרי מוות ברחבי העולם מדי שנה³. המפתח לשיפור התוצאה של חולים עם אלח דם הוא ייזום מהיר של טיפולים כגון אנטיביוטיקה⁴. שיטת תקן הזהב לאבחון אלח דם היא תרבות מיקרוביאלית; עם זאת, תרבית מיקרוביאלית גוזלת זמן רב ויכולה להוביל לתוצאות חיוביות שגויות ושליליות שגויות, המגבילות מאוד את המשמעות הקלינית⁵. לכן, רצוי מאוד לזהות סמן ביולוגי בדם של אלח דם. פרוקלציטונין מוכר כסמן ביולוגי אידיאלי לאלח דם, אך יש לו יעילות אבחנתית מוגבלת מכיוון שהוא אינו מסוגל להבחין בין אלח דם למחלות סטריליות⁶.

קשירת צקאל עכבר ודיקור (CLP) משמשת בדרך כלל ליצירת מודל של אלח דם במחקר מדעי. CLP הוא אחד המודלים הנפוצים ביותר של אלח דם מכיוון שהוא מחקה דלקת צפק פולימיקרוביאלית, ומפעיל תגובות חיסוניות פרו-דלקתיות ואנטי-דלקתיות⁷. מקובל כי CLP יוצר מודל אלח דם רלוונטי יותר מבחינה קלינית מאשר טכניקות חלופיות, כגון הזרקת אנדוטוקסין חיידקי. לכן, CLP נחשב למודל אלח הדם הקלאסי לשימוש במחקר⁸. עם זאת, חסרון מרכזי של CLP הוא יכולת השכפול שלו, שכן חומרת המודל מושפעת ממספר גורמים כגון אחוז הצקום קשירה, גודל המחט, מספר הנקבים וטכניקת הלפרוטומיה. לכן, יש צורך לתקנן את מודל אלח דם המושרה על ידי CLP. המחקר הנוכחי מתאר את פרטי הפרוטוקול של מודל אלח הדם המושרה על ידי CLP כדי להראות את ההליך הסטנדרטי ולהגדיל את יכולת השכפול שלו.

התגובה הדלקתית מתרחשת בשלב מוקדם של אלח דם, כאשר נויטרופילים משחררים כמויות מופרזות של מחמצנים ופרוטאזות הגורמים נזק לאיברים⁸. גורם מפתח בפתופיזיולוגיה של אלח דם הוא היווצרות מלכודות נויטרופיליות חוץ-תאיות (NETs), המשחררות רכיבים גרעיניים וציטוזוליים כגון דנ"א, היסטונים ציטרולין וחלבונים אנטי-מיקרוביאליים⁹. מחקרים אחרונים מצביעים על כך שדור מופרז של NETs מתווך את הפתולוגיה של אלח דם; בינתיים, ירידה של NETs, באמצעות עיכוב אנזימטי של פפטידיל ארגינין deiminase (PAD) על ידי כימיקלים כמו YW3-56 או Cl-amidine, מפעילה אפקט פרו-הישרדותי במודלים עכברים של אלח דם^10,11. היסטון H3 (CitH3) זוהה כחלבון ספציפי לאלח דם בשנת 2011¹², ופרסומים מאוחרים יותר הראו כי ריכוז CitH3 במחזור הוא סמן ביולוגי אבחוני אמין של אלח דם^13,14. CitH3 נחשב לסמן ביולוגי רגיש יותר וארוך טווח יותר מאשר פרוקלציטונין, והוא ספציפי יותר בהבחנה בין אלח דם מאשר ציטוקינים דלקתיים¹³.

במחקר זה, הערכנו סמן ביולוגי אבחוני אמין של אלח דם במודל עכבר המושרה על ידי CLP של אלח דם.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות שאושרו על ידי הוועדה לבדיקת חיות בבית החולים שיאנגיה ובאוניברסיטת סנטרל דרום (מס '202103149).

1. הכנה

1. עכברי C57BL/6J זכרים נבחרים (משקל: 20-25 גרם; גיל: 8-12 שבועות) ובבית למשך 3 ימים לפני ביצוע הליכים כלשהם.
2. שקלו את העכבר.
3. מרדים את העכבר עם 1.5% איזופלורן על ידי שאיפה וצובט את הבהונות כדי לבדוק את עומק ההרדמה.
4. הנח את העכבר על כרית החימום. החל קרם דפילציה על הבטן ולהשאיר לא יותר מ 1 דקה לפני הסרת הקרם והשיער.
   הערה: יש לשמור על טמפרטורת גוף תקינה על ידי הנחת כרית חמה מתחת לעכבר המרדים במהלך הניתוח.

2. מבצע

1. הכינו כלי ניתוח סטריליים המתאימים לניתוח בעלי חיים מכרסמים. יש ללבוש כפפות סטריליות, מסכת פנים וחלוק כירורגי כדי להבטיח תנאים אספטיים.
2. לחטא את עור הבטן עם מגבונים יוד לפחות שלוש פעמים. יש לכסות את אזור הניתוח הניתוחי בווילונות כירורגיים סטריליים.
3. השתמש במספריים כירורגיים סטריליים כדי לבצע חתך של כ -2 ס"מ בדופן הבטן לאורך הלינאה אלבה.
   הערה: אין לפגוע באיברים.
4. לזהות ולבודד את cecum מתוך חלל הצפק עם פינצטה סטרילית.
5. ליגייט 75% מנפח הצקום עם 4-0 תפרי משי. אין לנעוץ את כלי הדם המזנטריים.
   הערה: אחוז הצקום המחויב קובע את חומרת אלח הדם.
6. נקבו את הצקום על ידי יצירת ניקוב אחד דרך ודרך (שני חורים) עם מחט של 21 G (מצד אחד דרך דופן הסקל לצד הנגדי) בנקודת האמצע שבין קצה הזנב לסט הקשירה.
7. השליכו את המחט. סוחטים בעדינות טיפה קטנה של צואה מתוך הצואה דרך חורי החדירה.
   הערה: כמות הצואה שנדחקה לתוך חלל הצפק צריכה להיות עקבית, שכן זה גם קובע את חומרת אלח דם. יש לדלג על שלבים 2.5-2.7 עבור עכברי בושה.
8. החלף בעדינות את הצקום לתוך חלל הבטן.
9. סגרו את שרירי הבטן והעור בנפרד עם 6-0 תפרי משי.
10. יש לחטא את החתך ביוד.
11. הזריקו קטופרופן (5 מ"ג/ק"ג) ברביע השמאלי התחתון של הבטן כדי למנוע את הצקום. הניחו את העכבר על כרית חמה עד שהוא התאושש לחלוטין מההרדמה.
12. הניחו את העכבר בכלוב בחדר עם בקרת טמפרטורה (22 מעלות צלזיוס) ותנו גישה חופשית למזון ולמים. בדוק את העכבר כל 6 שעות בשבוע הראשון שלאחר הניתוח.
    1. הרדמת העכבר על ידי מנת יתר של פחמן דו חמצני כאשר הסימפטומים של אלח דם פוגשים את נקודות הקצה שהוגדרו מראש.

3. טיפול

1. חלקו באופן אקראי עכברים לקבוצת הבושה, קבוצת CLP, קבוצת CLP + YW3-56 (איור 2a) וקבוצת CLP + Cl-amidine (איור 1).
   הערה: קבוצת הבושה עברה את אותם הליכים כמו קבוצות CLP למעט CLP. YW3-56 (5 מ"ג/ק"ג) או Cl-amidine (40 מ"ג/ק"ג) ניתנו בהזרקת פריטונל שעה לאחר שלב 2.9 בעת תפירת שכבת השריר והעור.
2. קציר לדוגמה
   1. קצירת דם היקפי ממקלעת רטרובולבר¹⁵ 24 שעות לאחר הניתוח.
3. מכינים את הסרום על ידי צנטריפוגה (1,000 x גרם, 5 דקות) ומאחסנים בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.
4. מדוד את ריכוז CitH3 באמצעות ערכת ELISA של סנדוויץ' עקיף כפי שתואר קודם^{לכן 13}.
   1. מצפים את הנוגדן החד-שבטי נגד CitH3 על צלחת בעלת 96 בארות כדי ללכוד את חלבון CitH3.
   2. יש לטפל בסרום עם DNase I (150 יחידה/מ"ל, 37° למשך שעה) ולדגירה בבארות (20 μL, טמפרטורת החדר).
   3. הוסיפו נוגדן פוליקלונלי נגד CitH3 (0.33 מיקרוגרם/מ"ל, 100 מיקרול, 2 שעות) כדי לזהות את חלבון CitH3 שנתפס.
   4. לדגום את הנוגדן המשני המסומן נגד פרוקסידאז (0.02 מיקרוגרם/מ"ל, 100 מיקרוגרם, שעה אחת) בבארות.
   5. לאחר שטיפה יסודית, לפתח את הבארות עם 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (100 μL, 20 דקות).
      הערה: פרטי פרוטוקול נוספים של ערכת ELISA מסופקים בפרסום הקודם¹³.
5. ניתוח סטטיסטי
   1. בצע בדרך אחת ANOVA כדי לנתח את ההבדלים בין שלוש הקבוצות, ולאחר מכן Bonferroni לאחר בדיקת הוק להשוואות מרובות. השתמש בתוכנה סטטיסטית כדי לבצע את הניתוח. ערכי p של 0.05 או פחות נחשבו משמעותיים.

תוצאות

כפי שניתן לראות באיור 2A, לא זוהה CitH3 בקבוצת הבושה על ידי כתם מערבי. ריכוז CitH3 בסרום עלה באופן משמעותי לאחר CLP, ועלייה זו נחסמה על ידי עיכוב היווצרות NET באמצעות מתן YW3-56, מעכב PAD¹⁰. איור 2B מראה את ריכוזי הסרוםCitH3 שנקבעו על-ידי ELISA. ב-24 שעות לאחר CLP, רי...

Discussion

CLP מכניס פתוגנים לתוך הבטן כדי ליצור מודל פרה-קליני של אלח דם. בעת ביצוע CLP, חשוב להשתמש בתנאים סטריליים כדי למנוע את ההפרעה של חיידקים אקסוגניים ולהשתמש במינונים מדויקים של חומרי הרדמה¹⁶. שלושת ההיבטים הטכניים של CLP המשפיעים על חומרתו ושכפולו של מודל אלח הדם הם אחוז הצקום הקשור,...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
21G needle
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine	R&D Systems Inc	DY999
anti-CitH3 monoclonal antibody	laboratory self developed
anti-CitH3 polyclonal antibody	Abcam	ab5103
anti-rabbit secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	111-035-003
C57BL/6 mice	Xiangya School of Medicine, Central South University
Cl-amidine	Sigma Aldrich	SML2250
depilatory cream
Dnase I	Sigma Aldrich	11284932001
isoflurane	Sigma-Aldrich	26675-46-7
ketoprofen	Sigma Aldrich	PHR1375
silk sutures (4-0 & 6-0)
surgical instruments
YW3-56	GLPBIO	GC48263