敗血症の盲腸結紮および穿刺誘発マウスモデルにおける信頼性の高いバイオマーカーの評価

要約

このプロトコルは、敗血症のマウスモデルにおける盲腸結紮および穿刺(CLP)の手術の詳細を提示します。CLPは、敗血症の動物モデルを作成するために最も広く使用されている技術の1つです。したがって、信頼性の高い研究結果を得るためには、標準化されたCLPプロトコルが必要です。

要約

敗血症は、生命を脅かし、急速に発症する深刻な病気であり、世界中で毎年数百万人が死亡しています。研究者は、さまざまな動物モデルを使用して敗血症の病態生理学を解明するために多大な努力を払ってきました。盲腸結紮および穿刺(CLP)によって誘発される敗血症のマウスモデルは、実験室で広く使用されています。CLPモデルの重症度と再現性に影響を与える3つの技術的側面は、盲腸結紮の割合、盲腸穿刺に使用される針のサイズ、および腹腔内に押し込まれた糞便の量です。敗血症の迅速かつ具体的な診断は、結果に影響を与える重要な要素です。敗血症診断のゴールドスタンダードは微生物培養です。ただし、このプロセスは時間がかかり、場合によっては不正確です。敗血症特異的バイオマーカーの検出は高速ですが、既存のバイオマーカーは、半減期が短く、非特異性があり、感度が不十分なため、不十分です。したがって、初期段階での敗血症の信頼できるバイオマーカーが緊急に必要とされています。以前の出版物は、過剰な好中球細胞外トラップ(NET)が敗血症で発生することを示唆しています。NET成分としてのシトルリン化ヒストンH3(CitH3)は、敗血症動物と患者の両方で上昇しており、CitH3の存在は敗血症の信頼できる診断バイオマーカーです。本研究は、CLP誘発敗血症の標準化されたマウスモデルを記述し、敗血症の信頼できる血液バイオマーカーを確立することを目的とした。私たちの研究は、将来的に敗血症の早期かつ正確な診断に貢献する可能性があります。

概要

敗血症は^{、感染に対する}調節不全の宿主反応によって引き起こされる生命を脅かす臓器機能障害として定義され1、敗血症性ショックは敗血症の重症例の主要な死因です²。敗血症と敗血症性ショックは、毎年世界中で何百万人もの死者を出しています³。敗血症患者の転帰を改善するための鍵は、抗生物質などの治療の迅速な開始です⁴。敗血症の診断のためのゴールドスタンダードの方法は微生物培養です。しかし、微生物培養は時間がかかり、偽陽性および偽陰性の結果につながる可能性があり、臨床的意義が大幅に制限されます⁵。従って、敗血症の血液バイオマーカーを同定することが極めて望ましい。プロカルシトニンは理想的な敗血症バイオマーカーとして認識されていますが、敗血症と無菌性疾患を区別できないため、診断効果は限られています⁶。

マウス盲腸結紮および穿刺(CLP)は、科学研究における敗血症のモデルを作成するために一般的に使用されます。CLPは、多微生物性腹膜炎を模倣し、炎症誘発性免疫応答と抗炎症性免疫応答の両方を活性化するため、最も広く使用されている敗血症モデルの1つです⁷。CLPは、細菌性エンドトキシンの注射などの代替技術よりも臨床的に関連性のある敗血症モデルを作成することは広く受け入れられています。したがって、CLPは、研究⁸で使用するための古典的な敗血症モデルと見なされます。ただし、CLPの主な欠点は、モデルの重症度が盲腸結紮の割合、針のサイズ、穿刺回数、開腹術などのいくつかの要因によって影響を受けるため、再現性です。したがって、CLP誘発敗血症モデルを標準化する必要がある。本研究では、CLP誘発敗血症モデルのプロトコルの詳細を説明し、標準化された手順を示し、その再現性を高めます。

炎症反応は敗血症の初期段階で起こり、好中球は臓器損傷を引き起こす過剰な量の酸化剤とプロテアーゼを放出します⁸。敗血症の病態生理における重要な要因は、DNA、シトルリン化ヒストン、抗菌プロテイナーゼなどの核および細胞質成分を放出する好中球細胞外トラップ(NET)の形成です⁹。最近の研究では、NETの過剰な生成が敗血症の病理を媒介することが示唆されています。一方、YW3-56やCl-アミジンなどの化学物質によるペプチジルアルギニンデイミナーゼ(PAD)の酵素的阻害によるNETの減少は、敗血症のマウスモデルで生存促進効果を発揮します^10,11。シトルリン化ヒストンH3(CitH3)は2011年に敗血症特異的タンパク質として同定され¹²、その後の出版物は、循環CitH3濃度が敗血症の信頼できる診断バイオマーカーであることを実証している^13,14。CitH3は、プロカルシトニンよりも感度が高く、長持ちするバイオマーカーと考えられており、炎症性サイトカインよりも敗血症の区別においてより特異的です¹³。

この研究では、敗血症のCLP誘発マウスモデルにおける敗血症の信頼できる診断バイオマーカーを評価しました。

プロトコル

すべての動物実験は、襄雅病院および中南大学の動物審査委員会(第202103149号)によって承認されたガイドラインに従って実施されました。

1. 事前準備

1. 雄のC57BL / 6Jマウス(体重:20〜25 g、年齢:8〜12週)を選択し、手順を実行する前に3日間ハウスします。
2. マウスの重量を量ります。
3. マウスを1.5%イソフルランで吸入麻酔し、つま先をつまんで麻酔の深さを確認します。
4. マウスを加熱パッドに固定します。脱毛クリームを腹部に塗り、クリームと髪を取り除く前に1分以内放置します。
   注:手術中は、麻酔をかけたマウスの下に温かいパッドを置くことで、正常な体温を維持する必要があります。

2. 運用

1. げっ歯類の動物の手術に適した滅菌手術器具を準備します。無菌状態を確保するために、滅菌手袋、フェイスマスク、手術用ガウンを着用してください。
2. 腹部の皮膚をヨウ素ワイプで少なくとも3回消毒します。手術部位を滅菌手術用ドレープで覆います。
3. 滅菌手術用ハサミを使用して、リネアアルバに沿って腹壁を約2cm切開します。
   注意: 臓器を傷つけないでください。
4. 滅菌ピンセットで腹腔から盲腸を識別して隔離します。
5. 盲腸の体積の75%を4-0の絹縫合糸で結睭化する。腸間膜血管を結紮しないでください。
   注:結紮された盲腸の割合は、敗血症の重症度を決定します。
6. 尾端と結紮セットの中間点に21 Gの針(片側から盲腸壁を通って反対側まで)で1つの貫通穿孔(2つの穴)を作成して盲腸を穿刺します。
7. 針を捨てます。浸透孔を通して盲腸から小滴の糞をそっと絞ります。
   注:腹腔に押し込まれる糞便の量は、敗血症の重症度も決定するため、一貫している必要があります。偽マウスの場合は、手順2.5〜2.7をスキップする必要があります。
8. 盲腸を腹腔内にそっと入れ替えます。
9. 6-0シルク縫合糸で腹筋と皮膚を別々に閉じます。
10. 切開部をヨウ素で消毒します。
11. 盲腸を避けるために、腹部の左下象限にケトプロフェン(5 mg / kg)を注射します。麻酔薬から完全に回復するまで、マウスを温かいパッドの上に置きます。
12. 温度管理された部屋(22°C)のケージにマウスを置き、餌と水に自由にアクセスできるようにします。術後最初の1週間は6時間ごとにマウスを確認してください。
    1. 敗血症の症状が事前に定義されたエンドポイントを満たしている場合は、二酸化炭素の過剰摂取によってマウスを安楽死させます。

3.治療

1. マウスを無作為に偽群、CLP群、CLP+YW3-56群(図2a)、CLP+Cl-アミジン群(図1)に分けます。
   注: 偽グループは、CLP を除く CLP グループと同じ手順を実行しました。YW3-56(5 mg / kg)またはCl-アミジン(40 mg / kg)は、筋肉と皮膚層を縫合するときに、ステップ2.9の1時間後に腹腔注射 で 投与されました。
2. サンプル収穫
   1. 手術後¹⁵ 24時間で球後神経叢から末梢血を採取する。
3. 遠心分離(1,000 x g、5分)で血清を調製し、使用するまで-80°Cで保存します。
4. ^前述の13の間接サンドイッチELISAキットを用いてCitH3濃度を測定する。
   1. 抗CitH3モノクローナル抗体を96ウェルプレートにコーティングして、CitH3タンパク質を捕捉します。
   2. 血清をDNase I(150ユニット/mL、37°で1時間)で処理し、ウェル(20 μL、室温)でインキュベートします。
   3. 抗CitH3ポリクローナル抗体(0.33 μg/mL、100 μL、2時間)を加えて、捕捉されたCitH3タンパク質を検出します。
   4. 抗ウサギペルオキシダーゼ標識二次抗体(0.02 μg/mL、100 μl、1時間)をウェルでインキュベートします。
   5. 十分に洗浄した後、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(100 μL、20分)でウェルを開発します。
      注:ELISAキットのプロトコルの詳細は、以前の出版物¹³に記載されています。
5. 統計解析
   1. 一元配置分散分析を実行して3つのグループ間の差を分析し、続いて多重比較のためのボンフェローニ事後検定を実行します。統計ソフトウェアを使用して分析を実行します。0.05以下の p 値は有意であると考えられた。

結果

図2Aに示すように、ウエスタンブロッティングにより偽群ではCitH3は検出されなかった。血清CitH3濃度はCLP後に有意に上昇し,この増加はPAD阻害剤であるYW3-56の投与によるNET形成の阻害によって阻止された¹⁰.図2Bは、ELISA法により測定した血清CitH3濃度を示す。CLP後24時間で、偽群と比較してCLP群でCitH3の血清濃度が増加し(p=0.000...

ディスカッション

CLPは病原体を腹部に導入して敗血症の前臨床モデルを作成します。CLPを実施する際には、外因性細菌の干渉を排除し、麻酔薬の正確な投与量を使用するために無菌条件を使用することが重要です¹⁶。敗血症モデルの重症度と再現性に影響を与えるCLPの3つの技術的側面は、結紮された盲腸の割合、盲腸穿刺に使用される針のサイズ、および腹腔内に押し込まれた糞便の量です?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
21G needle
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine	R&D Systems Inc	DY999
anti-CitH3 monoclonal antibody	laboratory self developed
anti-CitH3 polyclonal antibody	Abcam	ab5103
anti-rabbit secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	111-035-003
C57BL/6 mice	Xiangya School of Medicine, Central South University
Cl-amidine	Sigma Aldrich	SML2250
depilatory cream
Dnase I	Sigma Aldrich	11284932001
isoflurane	Sigma-Aldrich	26675-46-7
ketoprofen	Sigma Aldrich	PHR1375
silk sutures (4-0 & 6-0)
surgical instruments
YW3-56	GLPBIO	GC48263