JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لعزل الحمض النووي لتحليل تغيرات ميكروبات الأمعاء الفئرانية أثناء تطور أمراض المناعة الذاتية.

Abstract

الميكروبات المعوية لها دور مهم في تثقيف الجهاز المناعي. هذه العلاقة مهمة للغاية لفهم أمراض المناعة الذاتية التي لا تحركها العوامل الوراثية فحسب ، بل أيضا العوامل البيئية التي يمكن أن تؤدي إلى ظهور المرض و / أو تفاقم مسار المرض. أظهرت دراسة نشرت سابقا حول ديناميكيات ميكروبات الأمعاء في الفئران الإناث المعرضة للذئبة MRL / lpr كيف يمكن للتغيرات في ميكروبات الأمعاء أن تغير تطور المرض. هنا ، يتم وصف بروتوكول لاستخراج عينات تمثيلية من ميكروبات الأمعاء لدراسات المناعة الذاتية. يتم جمع عينات الميكروبات من فتحة الشرج ومعالجتها ، والتي يتم استخراج الحمض النووي منها باستخدام طريقة الفينول كلوروفورم وتنقيتها عن طريق هطول الأمطار الكحولية. بعد إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، يتم تسلسل الأمبليونات النقية باستخدام منصة تسلسل الجيل التالي في مختبر أرغون الوطني. أخيرا ، يتم تحليل بيانات تسلسل جين الحمض النووي الريبوسومي الريبوسومي 16S. على سبيل المثال ، يتم عرض البيانات التي تم الحصول عليها من مقارنات ميكروبات الأمعاء لفئران MRL / lpr مع أو بدون CX3CR1. أظهرت النتائج اختلافات كبيرة في الأجناس التي تحتوي على البكتيريا المسببة للأمراض مثل تلك الموجودة في فصيلة البروتيوباكتيريا ، وكذلك جنس Bifidobacterium ، الذي يعتبر جزءا من الميكروبات المصاحبة الصحية. باختصار ، هذه الطريقة البسيطة والفعالة من حيث التكلفة لعزل الحمض النووي موثوقة ويمكن أن تساعد في التحقيق في تغيرات ميكروبات الأمعاء المرتبطة بأمراض المناعة الذاتية.

Introduction

لقد تعايش البشر والبكتيريا لفترة طويلة. لقد أقاموا علاقة اعتماد متبادل مع تأثيرات متبادلة المنفعة تؤثر على الاستجابات المناعية للمضيف بطرق كمية ونوعية1. تشير الدراسات الحديثة إلى وجود ارتباط بين تكوين ميكروبات الأمعاء والتسبب في أمراض المناعة الذاتية التي تشمل التصلب المتعدد 2 ، والتهاب المفاصل الروماتويدي3 ، ومرض السكري من النوع2 4 ، ومرض التهاب الأمعاء5 ، والذئبة الحمامية الجهازية (SLE)6. ومع ذلك ، ما إذا كانت ميكروبات الأمعاء هي السبب الرئيسي أو التأثير الثانوي لهذه الأمراض المناعية الذاتية لا يزال غير واضح7. من المحتمل أن تؤدي ميكروبات الأمعاء إلى تفاقم المرض خلال المرحلة المستجيبة لاضطرابات المناعة الذاتية أو تلعب دورا في تنظيم تحريض هذه الأمراض8.

تم الإبلاغ عن dysbiosis المعوية في الفئران MRL / Mp-Faslpr (MRL / lpr) المعرضة للذئبة ، ولوحظت تغيرات ميكروبات الأمعاء مع استنفاد كبير من العصيات اللبنية9. عندما تم إعطاء خليط من خمس سلالات من Lactobacillus عن طريق الفم ، تم تخفيف الأعراض الشبيهة بالذئبة إلى حد كبير في هذه الفئران ، مما يشير إلى دور أساسي للميكروبات في تنظيم التسبب في مرض الذئبة الحمراء.

تسمح التقنية التالية لاستخراج الحمض النووي بمتابعة تقلبات الميكروبات وتحليلها نوعيا وكميا أثناء الإصابة بمرض يشبه الذئبة الحمراء الفئران في الفئران المعرضة للذئبة. سواء لفحص ميكروبات الأمعاء الصحية أو تعريف dysbiosis ، من المهم أن تدرس بشكل نقدي كيفية جمع البيانات وما إذا كانت دقيقة وقابلة للتكرار10. كل خطوة حاسمة في هذه العملية. يجب استخدام منهجية مناسبة لاستخراج الحمض النووي الميكروبي لأن أي مشكلة محتملة في إدخال تحيزات أثناء عملية استخراج الحمض النووي يمكن أن تؤدي إلى تمثيل ميكروبي غير دقيق. في حين يتم وصف طريقة الفينول كلوروفورم هنا ، هناك مجموعات متاحة تجاريا لاستخراج الحمض النووي من البكتيريا التي تعمل بشكل جيد في حالات معينة11. ومع ذلك ، فإن قابليتها للاستخدام محدودة بالتكلفة وكمية العينة المطلوبة.

البروتوكول المعروض هنا فعال من حيث التكلفة ولا يتطلب سوى كمية صغيرة من العينة. وهو يعمل بشكل جيد مع أي نوع من عينات البراز وهو مفيد في دراسة ديناميكيات ميكروبات الأمعاء بمرور الوقت وكذلك المقارنات بين المجموعات. يتم عزل الحمض النووي بطريقة تنقية الكحول ، والتي تستخدم الفينول والكلوروفورم وكحول الأيزواميل. يساعد الاستخراج القائم على الكحول على تنظيف وإزالة عينة البروتينات والدهون ، حيث يتم ترسيب الحمض النووي في الخطوة النهائية. تتميز الطريقة المقترحة بكفاءة وجودة عالية بشكل كبير وقد ثبت أنها دقيقة في تحديد مجموعات البكتيريا. إحدى الملاحظات الهامة أثناء الإجراء هي أن تلوث الحمض النووي يمكن أن يحدث ، وبالتالي يلزم التعامل مع العينات المناسبة12.

ثم يتم تحليل الحمض النووي بواسطة منصات تسلسل الجيل التالي لجين 16S rRNA ، مثل Illumina MiSeq. على وجه الخصوص ، يتم تحليل منطقة V4 فائقة التغير لتوفير تقدير كمي أفضل للأصناف عالية الرتبة13. يتم الاستعانة بمصادر خارجية لتحليل المعلوماتية الحيوية اللاحق ، يليه تحليل داخلي باستخدام الأساليب الإحصائية القياسية. هناك العديد من برامج المعلوماتية الحيوية مفتوحة المصدر المتاحة للتسلسل النهائي ، ويعتمد نوع التحليلات التي يتم إجراؤها بشكل كبير على المسألة البيولوجية المحددة ذات الأهمية14. يركز هذا البروتوكول بشكل خاص على الخطوات التجريبية قبل التسلسل ويوفر طريقة أكثر تنوعا وفعالية من حيث التكلفة وقابلة للمقارنة وفعالة للحصول على الحمض النووي من عينات البراز.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم عبور موضع Cx3cr1 gfp / gfp لفئران B6.129P2 (Cg) - Cx3cr1tm1Litt / J إلى MRL / MpJ-Fas lpr / J (MRL / lpr) لمدة 10 أجيال لإنشاء فئران MRL / lpr-CX3 CR1gfp / gfp. أكد فحص الجينوم باستخدام لوحات تعدد أشكال النيوكليوتيدات المفردة (SNP) أن الخلفية الجينية للفئران المتولدة حديثا كانت أكثر من 97٪ مطابقة لتلك الموجودة في MRL / lpr. بعد ذلك ، تم تربية الفئران وصيانتها في بيئة محددة خالية من مسببات الأمراض وفقا للمتطلبات المحددة للجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في Virginia Tech. تم جمع العينات عندما كان عمر الفئران 13 و 14 و 15 أسبوعا.

1. جمع عينات الميكروبات من الفئران

  1. خذ كل فأر على حدة من قفصه. جمع بيليه البراز مباشرة من فتحة الشرج وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى تتم معالجتها. قم بمعالجة العينات باستخدام ملقط وأنابيب وقفازات معقمة ونظيفة.
    ملاحظة: يمكن استخدام حاوية (على سبيل المثال، دورق) لوضع الماوس أثناء انتظار عينة البراز. تنظيف الحاوية مع الإيثانول قبل وبعد كل ماوس.
  2. أضف حبيبة مجمدة إلى أنبوب غطاء لولبي 2 مل موزون مسبقا. سجل وزن البراز بالجرام ، والذي يجب أن يتراوح بين 0.02-0.05 جم لكل حبيبة برازية.
  3. أضف إلى الكريات طبقة رقيقة من الخرز الزجاجي 0.1 مم ، و 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل (50 mM NaCl و 5 mM Tris و 50 mM EDTA) ، و 200 ميكرولتر من 20٪ SDS.
  4. تغلب الخرزة على الأنبوب لمدة 4 دقائق في مجانس (بأقصى طاقة) ، تليها 3-5 دقائق من الدوامة.
  5. تدور لفترة قصيرة للقضاء على الفقاعات والرغوة (اضغط على الزر الموجود على جهاز الطرد المركزي حتى يصل إلى 1000-1200 × جم ، ثم حرره).

2. استخراج الحمض النووي

  1. نقل 350 ميكرولتر من المادة الفائقة التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.5 (لضمان عدم حمل أي حطام) إلى أنبوب غطاء مفاجئ جديد سعة 1.5 مل. أضف 500 ميكرولتر من خليط الفينول والكلوروفورم والأيزواميل (PCI ؛ 25: 24: 1 ، v / v) والدوامة لمدة دقيقة واحدة.
    ملاحظة: من الآن فصاعدا ، يجب التعامل مع العينات داخل غطاء كيميائي. PCI سامة.
  2. تدور في 6000 × غرام لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. انقل 180 ميكرولتر من الطور المائي (الطبقة العليا) إلى أنبوب غطاء مفاجئ جديد بسعة 1.5 مل. أضف 180 ميكرولتر (1:1) من الكلوروفورم ، وقلبه ، واخلطه.
    ملاحظة: تقليل التلوث من الطبقة السفلية عند نقل الطبقة العليا.
  3. تدور عند 18,400 × g لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. انقل 180 ميكرولتر من الطور المائي إلى أنبوب غطاء مفاجئ جديد.
    ملاحظة: بعد التخلص من PCI والكلوروفورم ، يمكن تنفيذ الخطوات التالية في خزانة السلامة البيولوجية.
  4. أضف 180 ميكرولتر من الأيزوبروبانول البارد و 36 ميكرولتر من 5M NH4Ac. اقلب عدة مرات للخلط ، وضع الأنبوب على الجليد لمدة 20 دقيقة.
  5. تدور على حرارة 18,400 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. صب للتخلص من supernatant. اغسل الكريات عدة مرات باستخدام 500 ميكرولتر من الإيثانول البارد بنسبة 70٪ أثناء الانعكاس.
    ملاحظة: يجب تخفيف الإيثانول بماء معقم مزدوج منزوع الأيونات.
  6. تدور عند 18,400 × g لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الفائقة لإزالة الإيثانول المتبقي.
  7. جفف الأنبوب رأسا على عقب رأسا على عقب على المناديل الورقية لمدة 20 دقيقة، حتى تصبح الكريات واضحة. تعليق بيليه في 50 ميكرولتر من الماء الجزيئي. سخني السائل على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لإذابة كريات الحمض النووي الكبيرة بالكامل.
  8. قم بتدوير الأنابيب بعد التسخين لاستعادة قطرات التكثيف على الغطاء (3400 × جم لمدة 1 دقيقة).
  9. قياس التركيز والحصول على نسبة 260/280 باستخدام مقياس الطيف الضوئي. استخدم الماء الجزيئي كفراغ. يجب أن يحتوي الحمض النووي عالي الجودة على نسب 260/280 تتراوح بين 1.8 و 2.
    ملاحظة: العائد المتوقع للحمض النووي لا يقل عن 0.03 غرام لكل حبيبة برازية.

3. إعداد عينة لتسلسل جين 16S rRNA

  1. أرسل عينات الحمض النووي إلى مختبر أرغون الوطني ، حيث تخضع لإعداد المكتبة ويتم تسلسلها على Illumina Miseq.
    1. أرسل العينات في ألواح 96 بئرا كاملة التفاف، مع عينات مرتبة في صفوف (A1-A12، B1-B12، إلخ)، ومختومة بأختام ألواح الرقائق المعدنية.
    2. أرسل حجما نهائيا قدره 20 ميكرولتر لكل عينة لكل بئر ، يتراوح تركيزه من 1-50 نانوغرام / ميكرولتر.
      ملاحظة: يجب أن يتم التخفيف بالماء الجزيئي.
    3. بعد تحضير العينات ، تدور عند 600 × g لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل تجميد العينات عند -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    4. أرسل بين عشية وضحاها على الثلج الجاف.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يتم تحليل النتائج من مختبر أرغون الوطني من قبل أخصائي معلوماتية حيوية مؤهل ، يليه تحليل داخلي للبيانات باستخدام الأساليب الإحصائية القياسية. تتضمن تحليلات الميكروبيوم النموذجية تجميع تسلسلات مماثلة في وحدات تصنيفية تشغيلية (OTUs) أو متغيرات تسلسل أمبليكون (ASVs) كبديل للكائنات الحية الدقيق?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يمكن للميكروبات المعوية المتوازنة حماية جسم الإنسان من الأمراض. بمجرد أن يتعطل هذا التوازن بسبب المحفزات الخارجية أو الداخلية ، يمكن أن تكون العواقب مدمرة. تقدم هذه الطريقة طريقة لتحليل ديناميكيات ميكروبات الأمعاء في نماذج الفئران. هذه الطريقة مناسبة ليس فقط للمقارنات بين المجموعات ولك?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه لا يوجد تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نحن نقدر المساعدة المقدمة من مختبر أرغون الوطني وأخصائيي المعلوماتية الحيوية المتعاونين معنا. يتم دعم هذا العمل من خلال العديد من المعاهد الوطنية للصحة والمنح الداخلية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 mm glass beadsBioSpec Products11079101
2 mL screw cap tubesThermo Fisher Scientific3488
20% SDSFisherScientificBP1311-1SDS 20%
96% Ethanol, Molecular Biology GradeThermo Fisher ScientificT032021000CS
Ammonium Acetate (5 M)Thermo Fisher ScientificAM9071NH4AC 5M
B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/JJackson Laboratory005582
Bullet Blender storm 24Next Advance4116-BBY24MHomogenizer
ChloroformFisherScientificC298-500
DEPC-Treated WaterThermo Fisher ScientificAM9916
Ethylenediamine Tetraacetic AcidFisherScientificBP118-500EDTA
Foil plate sealFisherScientificNC0302491
Kimwipes-Kimtech 34256FisherScientific06-666C
MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) miceJackson Laboratory000485
Nanodrop 2000 spectrophotomerThermo Fisher ScientificND2000CLAPTOP
Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1)FisherScientificBP1752I-400PCI
Scale with 4 decimalsMettler ToledoMS205DU
Skirted 96-well platesThermo Fisher ScientificAB-0800
Sodium chlorideFisherScientific15528154NaCl
Tris HydrochlorideFisherScientificBP1757-100
VortexScientific IndustriesSI-0236

References

  1. Lee, Y. K., Mazmanian, S. K. Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system. Science. 330 (6012), 1768-1773 (2010).
  2. Lee, Y. K., Menezes, J. S., Umesaki, Y., Mazmanian, S. K. Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Suppl 1 4615-4622 (2011).
  3. Yeoh, N., Burton, J. P., Suppiah, P., Reid, G., Stebbings, S. The role of the microbiome in rheumatic diseases. Current Rheumatology Reports. 15 (3), 314(2013).
  4. Larsen, N., et al. Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults. PLoS One. 5 (2), 9085(2010).
  5. Alam, M. T., et al. Microbial imbalance in inflammatory bowel disease patients at different taxonomic levels. Gut Pathogens. 12 (1), (2020).
  6. Vieira, S. M., Pagovich, O. E., Kriegel, M. A. Diet, microbiota and autoimmune diseases. Lupus. 23 (6), 518-526 (2014).
  7. Mu, Q., Zhang, H., Luo, X. M. SLE: another autoimmune disorder influenced by microbes and diet. Frontiers of Immunology. 6, 608(2015).
  8. Tektonidou, M. G., Wang, Z., Dasgupta, A., Ward, M. M. Burden of serious infections in adults with systemic lupus erythematosus: a national population-based study. Arthritis Care & Research. 67 (8), 1078-1085 (2015).
  9. Mu, Q., et al. Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota. Microbiome. 5 (1), 73(2017).
  10. Panek, M., et al. Methodology challenges in studying human gut microbiota - effects of collection, storage, DNA extraction and next generation sequencing technologies. Scientific Reports. 8 (1), 5143(2018).
  11. Fiedorová, K., et al. The impact of dna extraction methods on stool bacterial and fungal microbiota community recovery. Frontiers in Microbiology. 10, 821(2019).
  12. Gerasimidis, K., et al. The effect of DNA extraction methodology on gut microbiota research applications. BMC Research Notes. 9, 365(2016).
  13. Bukin, Y. S., et al. The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results. Scientific Data. 6 (1), 190007(2019).
  14. Galloway-Peña, J., Hanson, B. Tools for analysis of the microbiome. Digestive Diseases and Sciences. 65 (3), 674-685 (2020).
  15. Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Frontiers in Plant Science. 5, 209(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

183

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved