Analisi della dinamica del microbiota fecale in topi inclini al lupus utilizzando un metodo di isolamento del DNA semplice ed economico

Riepilogo

Questo protocollo fornisce un metodo di isolamento del DNA semplice ed economico per l'analisi delle alterazioni del microbiota intestinale murino durante lo sviluppo della malattia autoimmune.

Abstract

Il microbiota intestinale ha un ruolo importante nell'educazione del sistema immunitario. Questa relazione è estremamente importante per comprendere le malattie autoimmuni che non sono solo guidate da fattori genetici, ma anche da fattori ambientali che possono innescare l'insorgenza e / o peggiorare il decorso della malattia. Uno studio precedentemente pubblicato sulla dinamica del microbiota intestinale nei topi femmina MRL / lpr inclini al lupus ha mostrato come i cambiamenti del microbiota intestinale possono alterare la progressione della malattia. Qui, viene descritto un protocollo per estrarre campioni rappresentativi dal microbiota intestinale per studi di autoimmunità. I campioni di microbiota vengono raccolti dall'ano e lavorati, da cui il DNA viene estratto utilizzando un metodo fenolo-cloroformio e purificato mediante precipitazione alcolica. Dopo l'esecuzione della PCR, gli ampliconi purificati vengono sequenziati utilizzando una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione presso l'Argonne National Laboratory. Infine, vengono analizzati i dati di sequenziamento del gene RNA ribosomiale 16S. Ad esempio, vengono mostrati i dati ottenuti dai confronti del microbiota intestinale di topi MRL / lpr con o senza CX₃CR1. I risultati hanno mostrato differenze significative nei generi contenenti batteri patogeni come quelli del phylum Proteobacteria, così come il genere Bifidobacterium, che è considerato parte del microbiota commensale sano. In sintesi, questo metodo di isolamento del DNA semplice ed economico è affidabile e può aiutare lo studio dei cambiamenti del microbiota intestinale associati alle malattie autoimmuni.

Introduzione

Esseri umani e batteri hanno coesistito per molto tempo. Hanno stabilito una relazione codipendente con effetti benefici reciproci che influenza le risposte immunitarie dell'ospite in modi quantitativi e qualitativi¹. Studi recenti suggeriscono un'associazione tra la composizione del microbiota intestinale e la patogenesi delle malattie autoimmuni che includono la sclerosi multipla 2, l'artrite reumatoide³, il diabete di tipo^{2 4}, la malattia infiammatoria intestinale⁵ e il lupus eritematoso sistemico (LES)⁶. Tuttavia, non è an....

Protocollo

Il locus Cx3cr1 gfp/gfp dei topi B6.129P2(Cg)-Cx3cr1^tm1Litt/J è stato reincrociato con MRL/MpJ-Fas lpr/J (MRL/lpr) per 10 generazioni per generare topi MRL/^lpr-CX ₃ CR1 gfp^/gfp. Lo screening del genoma utilizzando pannelli di polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) ha confermato che il background genetico dei topi di nuova generazione era identico per oltre il 97% a quello di MRL / lpr. Successivamente, i topi sono stati allevati e mantenuti in uno specifico ambiente privo di agenti patogeni seguendo i requisiti specifici dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso Virginia Te....

Risultati

I risultati dell'Argonne National Laboratory sono analizzati da un bioinformatico qualificato, seguito da un'analisi interna dei dati utilizzando metodi statistici standard. Le tipiche analisi del microbioma comportano il raggruppamento di sequenze simili in unità tassonomiche operative (OTU) o varianti di sequenza ampliconica (ASV) come proxy per diversi microrganismi in un campione. I conteggi di OTU o ASV tra i campioni possono quindi essere utilizzati per verificare i cambiamenti nella diversità all'interno del cam.......

Discussione

Il microbiota intestinale equilibrato può proteggere il corpo umano dalle malattie. Una volta che questo equilibrio viene interrotto da fattori scatenanti esterni o interni, le conseguenze possono essere devastanti. Questo metodo presenta un modo per analizzare la dinamica del microbiota intestinale in modelli murini. Il metodo è adatto non solo per i confronti tra gruppi, ma anche per tracciare il microbiota intestinale nel tempo per identificare meglio i fattori dipendenti dal tempo che interrompono il microbiota int.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 mm glass beads	BioSpec Products	11079101
2 mL screw cap tubes	Thermo Fisher Scientific	3488
20% SDS	FisherScientific	BP1311-1	SDS 20%
96% Ethanol, Molecular Biology Grade	Thermo Fisher Scientific	T032021000CS
Ammonium Acetate (5 M)	Thermo Fisher Scientific	AM9071	NH4AC 5M
B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J	Jackson Laboratory	005582
Bullet Blender storm 24	Next Advance	4116-BBY24M	Homogenizer
Chloroform	FisherScientific	C298-500
DEPC-Treated Water	Thermo Fisher Scientific	AM9916
Ethylenediamine Tetraacetic Acid	FisherScientific	BP118-500	EDTA
Foil plate seal	FisherScientific	NC0302491
Kimwipes-Kimtech 34256	FisherScientific	06-666C
MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice	Jackson Laboratory	000485
Nanodrop 2000 spectrophotomer	Thermo Fisher Scientific	ND2000CLAPTOP
Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1)	FisherScientific	BP1752I-400	PCI
Scale with 4 decimals	Mettler Toledo	MS205DU
Skirted 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	AB-0800
Sodium chloride	FisherScientific	15528154	NaCl
Tris Hydrochloride	FisherScientific	BP1757-100
Vortex	Scientific Industries	SI-0236