Analisi della dinamica del microbiota fecale in topi inclini al lupus utilizzando un metodo di isolamento del DNA semplice ed economico

Riepilogo

Questo protocollo fornisce un metodo di isolamento del DNA semplice ed economico per l'analisi delle alterazioni del microbiota intestinale murino durante lo sviluppo della malattia autoimmune.

Abstract

Il microbiota intestinale ha un ruolo importante nell'educazione del sistema immunitario. Questa relazione è estremamente importante per comprendere le malattie autoimmuni che non sono solo guidate da fattori genetici, ma anche da fattori ambientali che possono innescare l'insorgenza e / o peggiorare il decorso della malattia. Uno studio precedentemente pubblicato sulla dinamica del microbiota intestinale nei topi femmina MRL / lpr inclini al lupus ha mostrato come i cambiamenti del microbiota intestinale possono alterare la progressione della malattia. Qui, viene descritto un protocollo per estrarre campioni rappresentativi dal microbiota intestinale per studi di autoimmunità. I campioni di microbiota vengono raccolti dall'ano e lavorati, da cui il DNA viene estratto utilizzando un metodo fenolo-cloroformio e purificato mediante precipitazione alcolica. Dopo l'esecuzione della PCR, gli ampliconi purificati vengono sequenziati utilizzando una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione presso l'Argonne National Laboratory. Infine, vengono analizzati i dati di sequenziamento del gene RNA ribosomiale 16S. Ad esempio, vengono mostrati i dati ottenuti dai confronti del microbiota intestinale di topi MRL / lpr con o senza CX₃CR1. I risultati hanno mostrato differenze significative nei generi contenenti batteri patogeni come quelli del phylum Proteobacteria, così come il genere Bifidobacterium, che è considerato parte del microbiota commensale sano. In sintesi, questo metodo di isolamento del DNA semplice ed economico è affidabile e può aiutare lo studio dei cambiamenti del microbiota intestinale associati alle malattie autoimmuni.

Introduzione

Esseri umani e batteri hanno coesistito per molto tempo. Hanno stabilito una relazione codipendente con effetti benefici reciproci che influenza le risposte immunitarie dell'ospite in modi quantitativi e qualitativi¹. Studi recenti suggeriscono un'associazione tra la composizione del microbiota intestinale e la patogenesi delle malattie autoimmuni che includono la sclerosi multipla 2, l'artrite reumatoide³, il diabete di tipo^{2 4}, la malattia infiammatoria intestinale⁵ e il lupus eritematoso sistemico (LES)⁶. Tuttavia, non è ancora chiaro se il microbiota intestinale sia la causa principale o un effetto secondario di queste malattie autoimmuni⁷. Potenzialmente, il microbiota intestinale potrebbe esacerbare la malattia durante la fase effettrice dei disturbi autoimmuni o svolgere un ruolo nella regolazione dell'induzione di queste malattie⁸.

La disbiosi intestinale è stata riportata in topi MRL/Mp-Faslpr (MRL/lpr) femminili inclini al lupus e sono stati osservati cambiamenti del microbiota intestinale con una significativa deplezione di lattobacilli⁹. Quando una miscela di cinque ceppi di Lactobacillus è stata somministrata per via orale, i sintomi simili al lupus sono stati ampiamente attenuati in questi topi, suggerendo un ruolo essenziale del microbiota nella regolazione della patogenesi del LES.

La seguente tecnica di estrazione del DNA consente di seguire le fluttuazioni del microbiota e analizzarle qualitativamente e quantitativamente durante il decorso della malattia murina simile al LES nei topi inclini al lupus. Sia che si tratti di esaminare il microbiota intestinale sano o di definire la disbiosi, è importante esaminare criticamente come vengono raccolti i dati e se sono accurati e riproducibili¹⁰. Ogni fase è fondamentale in questo processo. È necessario utilizzare una metodologia appropriata per estrarre il DNA microbico poiché qualsiasi possibile problema che introduce distorsioni durante il processo di estrazione del DNA potrebbe comportare una rappresentazione microbica imprecisa. Mentre il metodo fenolo-cloroformio è descritto qui, ci sono kit disponibili in commercio per estrarre il DNA da batteri che funzionano bene in casi particolari¹¹. Tuttavia, la loro usabilità è limitata dal costo e dalla quantità di campione richiesta.

Il protocollo qui presentato è conveniente e richiede solo una piccola quantità di campione. Funziona bene con qualsiasi tipo di campione di feci ed è utile nello studio delle dinamiche del microbiota intestinale nel tempo e nei confronti tra gruppi. Il DNA viene isolato con un metodo di purificazione dell'alcol, che utilizza fenolo, cloroformio e alcol isoamilico. L'estrazione a base alcolica aiuta a pulire e rimuovere il campione di proteine e lipidi, dove il DNA viene precipitato nella fase finale. Il metodo proposto ha un'efficienza e una qualità significativamente elevate e si è dimostrato accurato nell'identificazione delle popolazioni batteriche. Una nota critica durante la procedura è che può verificarsi una contaminazione del DNA e quindi è necessaria un'appropriata gestione del campione¹².

Il DNA viene quindi analizzato dalle piattaforme Next Generation Sequencing per il gene rRNA 16S, come l'Illumina MiSeq. In particolare, la regione iper-variabile V4 viene analizzata per fornire una migliore quantificazione per i taxa di alto rango¹³. La successiva analisi bioinformatica viene esternalizzata, seguita da un'analisi interna utilizzando metodi statistici standard. Esistono numerosi programmi software bioinformatici open source disponibili per il sequenziamento a valle e il tipo di analisi eseguite dipende fortemente dalla specifica questione biologica di interesse¹⁴. Questo protocollo si concentra specificamente sulle fasi sperimentali prima del sequenziamento e fornisce un metodo più versatile, economico, confrontabile ed efficiente per ottenere DNA da campioni fecali.

Protocollo

Il locus Cx3cr1 gfp/gfp dei topi B6.129P2(Cg)-Cx3cr1^tm1Litt/J è stato reincrociato con MRL/MpJ-Fas lpr/J (MRL/lpr) per 10 generazioni per generare topi MRL/^lpr-CX ₃ CR1 gfp^/gfp. Lo screening del genoma utilizzando pannelli di polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) ha confermato che il background genetico dei topi di nuova generazione era identico per oltre il 97% a quello di MRL / lpr. Successivamente, i topi sono stati allevati e mantenuti in uno specifico ambiente privo di agenti patogeni seguendo i requisiti specifici dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso Virginia Tech. I campioni sono stati raccolti quando i topi avevano 13, 14 e 15 settimane.

1. Raccolta di campioni di microbiota da topi

1. Porta ogni topo individualmente fuori dalla sua gabbia. Raccogliere un pellet fecale direttamente dall'ano e conservarlo a -80 ° C fino alla lavorazione. Elaborare i campioni con pinze, tubi e guanti sterili e puliti.
   NOTA: Un contenitore (ad esempio, un becher) può essere utilizzato per posizionare il mouse in attesa del campione fecale. Pulire il contenitore con etanolo prima e dopo ogni topo.
2. Aggiungere un pellet congelato a un tubo a vite prepesato da 2 ml. Registra il peso fecale in grammi, che dovrebbe essere compreso tra 0,02-0,05 g per pellet fecale.
3. Aggiungere al pellet un sottile strato di perle di vetro da 0,1 mm, 500 μL di tampone di lisi (50 mM NaCl, 5 mM Tris e 50 mM EDTA) e 200 μL di SDS al 20%.
4. Bead-beat il tubo per 4 minuti in un omogeneizzatore (alla massima potenza), seguito da 3-5 minuti di vortice.
5. Ruotare per un breve periodo per eliminare le bolle e la schiuma (premere il pulsante sulla centrifuga fino a raggiungere 1.000-1.200 x g, quindi rilasciare).

2. Estrazione del DNA

1. Trasferire 350 μL di surnatante ottenuto nella fase 1.5 (assicurandosi di non trasportare detriti) in un nuovo tubo con tappo a scatto da 1,5 ml. Aggiungere 500 μL di miscela di alcool fenolo-cloroformio-isoamilico (PCI; 25:24:1, v/v) e vortice per 1 min.
   NOTA: D'ora in poi, i campioni devono essere gestiti all'interno di una cappa chimica. PCI è tossico.
2. Centrifugare a 6.000 x g per 3 minuti a 4 °C. Trasferire 180 μL della fase acquosa (strato superiore) in un nuovo tubo con tappo a scatto da 1,5 ml. Aggiungere 180 μL (1:1) di cloroformio, capovolgere e mescolare.
   NOTA: ridurre al minimo la contaminazione dallo strato inferiore durante il trasferimento dello strato superiore.
3. Centrifugare a 18.400 x g per 3 minuti a 4 °C. Trasferire 180 μL della fase acquosa in un nuovo tubo a pressione.
   NOTA: dopo aver eliminato PCI e cloroformio, è possibile eseguire i seguenti passaggi in un armadio di sicurezza biologica.
4. Aggiungere 180 μL di isopropanolo freddo e 36 μL di 5M NH₄Ac. Capovolgere alcune volte per mescolare e posizionare il tubo sul ghiaccio per 20 minuti.
5. Centrifugare a 18.400 x g per 20 minuti a 4 °C. Versare per scartare il surnatante. Lavare il pellet più volte con 500 μL di etanolo freddo al 70% invertendo.
   NOTA: L'etanolo deve essere diluito con acqua sterile a doppia deionizzazione.
6. Centrifugare a 18.400 x g per 3 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante per rimuovere l'etanolo residuo.
7. Asciugare all'aria il tubo capovolto su carta velina per 20 minuti, fino a quando il pellet diventa trasparente. Sospendere il pellet in 50 μL di acqua molecolare. Riscaldare il liquido a 37 °C per 10 minuti per sciogliere completamente grandi pellet di DNA.
8. Spingere i tubi dopo il riscaldamento per recuperare le goccioline di condensa sul coperchio (3.400 x g per 1 min).
9. Misurare la concentrazione e ottenere il rapporto 260/280 utilizzando uno spettrofotometro. Usa acqua di grado molecolare come uno spazio vuoto. Il DNA di buona qualità dovrebbe avere rapporti 260/280 compresi tra 1,8 e 2.
   NOTA: La resa del DNA prevista è di almeno 0,03 g per pellet fecale.

3. Preparazione del campione per il sequenziamento del gene rRNA 16S

1. Invia i campioni di DNA all'Argonne National Laboratory, dove vengono sottoposti alla preparazione della biblioteca e vengono sequenziati sull'Illumina Miseq.
   1. Inviare i campioni in piastre a 96 pozzetti completamente gonfie, con campioni disposti in file (A1-A12, B1-B12, ecc.) e sigillati con guarnizioni a piastre di alluminio.
   2. Inviare un volume finale di 20 μL per campione per pozzetto, in concentrazione compresa tra 1 e 50 ng/μL.
      NOTA: Le diluizioni devono essere eseguite con acqua di grado molecolare.
   3. Dopo aver preparato i campioni, centrifugare a 600 x g per 1 minuto a temperatura ambiente prima di congelare i campioni a -80 °C per 24 ore.
   4. Invia durante la notte su ghiaccio secco.

Risultati

I risultati dell'Argonne National Laboratory sono analizzati da un bioinformatico qualificato, seguito da un'analisi interna dei dati utilizzando metodi statistici standard. Le tipiche analisi del microbioma comportano il raggruppamento di sequenze simili in unità tassonomiche operative (OTU) o varianti di sequenza ampliconica (ASV) come proxy per diversi microrganismi in un campione. I conteggi di OTU o ASV tra i campioni possono quindi essere utilizzati per verificare i cambiamenti nella diversità all'interno del cam...

Discussione

Il microbiota intestinale equilibrato può proteggere il corpo umano dalle malattie. Una volta che questo equilibrio viene interrotto da fattori scatenanti esterni o interni, le conseguenze possono essere devastanti. Questo metodo presenta un modo per analizzare la dinamica del microbiota intestinale in modelli murini. Il metodo è adatto non solo per i confronti tra gruppi, ma anche per tracciare il microbiota intestinale nel tempo per identificare meglio i fattori dipendenti dal tempo che interrompono il microbiota int...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 mm glass beads	BioSpec Products	11079101
2 mL screw cap tubes	Thermo Fisher Scientific	3488
20% SDS	FisherScientific	BP1311-1	SDS 20%
96% Ethanol, Molecular Biology Grade	Thermo Fisher Scientific	T032021000CS
Ammonium Acetate (5 M)	Thermo Fisher Scientific	AM9071	NH4AC 5M
B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J	Jackson Laboratory	005582
Bullet Blender storm 24	Next Advance	4116-BBY24M	Homogenizer
Chloroform	FisherScientific	C298-500
DEPC-Treated Water	Thermo Fisher Scientific	AM9916
Ethylenediamine Tetraacetic Acid	FisherScientific	BP118-500	EDTA
Foil plate seal	FisherScientific	NC0302491
Kimwipes-Kimtech 34256	FisherScientific	06-666C
MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice	Jackson Laboratory	000485
Nanodrop 2000 spectrophotomer	Thermo Fisher Scientific	ND2000CLAPTOP
Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1)	FisherScientific	BP1752I-400	PCI
Scale with 4 decimals	Mettler Toledo	MS205DU
Skirted 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	AB-0800
Sodium chloride	FisherScientific	15528154	NaCl
Tris Hydrochloride	FisherScientific	BP1757-100
Vortex	Scientific Industries	SI-0236