ניתוח הדינמיקה של מיקרוביוטה בצואה בעכברים המועדים לזאבת באמצעות שיטת בידוד דנ"א פשוטה וחסכונית

Summary

פרוטוקול זה מספק שיטת בידוד דנ"א פשוטה וחסכונית לניתוח שינויים במיקרוביוטה של מורין במעיים במהלך התפתחות מחלות אוטואימוניות.

Abstract

למיקרוביוטה של המעיים יש תפקיד חשוב בחינוך מערכת החיסון. קשר זה חשוב ביותר להבנת מחלות אוטואימוניות שאינן מונעות רק על ידי גורמים גנטיים, אלא גם גורמים סביבתיים שיכולים לעורר את הופעת המחלה ו/או להחמיר אותה. מחקר שפורסם בעבר על הדינמיקה של מיקרוביוטה של המעיים אצל נקבות MRL/lpr המועדות לזאבת הראה כיצד שינויים במיקרוביוטה של המעיים יכולים לשנות את התקדמות המחלה. כאן מתואר פרוטוקול לחילוץ דגימות מייצגות מהמיקרוביוטה של המעיים למחקרים על אוטואימוניות. דגימות מיקרוביוטה נאספות מפי הטבעת ומעובדות, מהן מופק הדנ"א בשיטת פנול-כלורופורם ומטוהר על ידי משקעי אלכוהול. לאחר ביצוע PCR, אמפליקונים מטוהרים מרוצפים באמצעות פלטפורמת ריצוף מהדור הבא במעבדה הלאומית ארגון. לבסוף, נתוני ריצוף הגנים של RNA ריבוזומלי 16S מנותחים. לדוגמה, מוצגים נתונים שהתקבלו מהשוואות מיקרוביוטה של המעיים של עכברי MRL/lpr עם או בלי CX₃CR1. התוצאות הראו הבדלים משמעותיים בסוגים המכילים חיידקים פתוגניים כמו אלה שבגוף הפרוטאובקטריה, כמו גם בסוג ביפידובקטריום, שנחשב לחלק מהמיקרוביוטה הבריאה. לסיכום, שיטת בידוד הדנ"א הפשוטה והחסכונית הזו אמינה ויכולה לסייע בחקר שינויים במיקרוביוטה של המעיים הקשורים למחלות אוטואימוניות.

Introduction

בני אדם וחיידקים התקיימו בדו-קיום במשך זמן רב. הם יצרו מערכת יחסים של תלות הדדית עם השפעות מועילות הדדיות המשפיעות על תגובות החיסון של המארח בדרכים כמותיות ואיכותיות¹. מחקרים אחרונים מצביעים על קשר בין הרכב המיקרוביוטה של המעיים לבין הפתוגנזה של מחלות אוטואימוניות הכוללות טרשת נפוצה 2, דלקת מפרקים שגרונית³, סוכרת מסוג^{2 4}, מחלות מעי דלקתיות⁵ וזאבת אדמנתית מערכתית (SLE)⁶. עם זאת,^{עדיין לא ברור} אם המיקרוביוטה של המעיים היא הגורם העיקרי או ההשפעה המשנית של המחלות האוטואימוניות הללו. באופן פוטנציאלי, מיקרוביוטה של המעיים עלולה להחמיר את המחלה במהלך שלב ההשפעה של הפרעות אוטואימוניות או למלא תפקיד בוויסות האינדוקציה של מחלות אלה⁸.

דווח על דיסביוזיס במעיים אצל נקבות הנוטות לזאבת MRL/Mp-Faslpr (MRL/lpr),^{ונצפו שינויים} במיקרוביוטה של המעיים עם דלדול משמעותי של לקטובצילי 9. כאשר תערובת של חמישה זני לקטובצילוס ניתנה דרך הפה, תסמינים דמויי זאבת נחלשו במידה רבה בעכברים אלה, מה שמרמז על תפקיד חיוני של מיקרוביוטה בוויסות פתוגנזה של SLE.

הטכניקה הבאה של מיצוי DNA מאפשרת לעקוב אחר תנודות מיקרוביוטה ולנתח אותם איכותית וכמותית במהלך מחלת מורין SLE בעכברים נוטים זאבת. בין אם לבחון את המיקרוביוטה הבריאה של המעיים או להגדיר דיסביוזיס, חשוב לבחון באופן ביקורתי כיצד הנתונים נאספים והאם הם מדויקים וניתנים לשחזור¹⁰. כל שלב הוא קריטי בתהליך זה. יש להשתמש במתודולוגיה מתאימה כדי לחלץ דנ"א מיקרוביאלי, שכן כל בעיה אפשרית בהטיות במהלך תהליך מיצוי הדנ"א עלולה לגרום לייצוג מיקרוביאלי לא מדויק. בעוד ששיטת הפנול-כלורופורם מתוארת כאן, ישנן ערכות זמינות מסחרית לחילוץ דנ"א מחיידקים שעובדות היטב במקרים מסוימים¹¹. עם זאת, השימושיות שלהם מוגבלת על ידי העלות וכמות המדגם הנדרשת.

הפרוטוקול המוצג כאן הוא חסכוני ודורש רק כמות קטנה של דגימה. הוא עובד מצוין עם כל סוג של דגימת צואה, והוא שימושי בחקר הדינמיקה של המיקרוביוטה של המעיים לאורך זמן, כמו גם בהשוואות בין קבוצות. הדנ"א מבודד בשיטה של טיהור אלכוהול, המשתמשת בפנול, כלורופורם ואלכוהול איזואמיל. מיצוי על בסיס אלכוהול מסייע לנקות ולהסיר את הדגימה של חלבונים ושומנים, שם DNA הוא זירז בשלב האחרון. השיטה המוצעת היא בעלת יעילות ואיכות גבוהות משמעותית והוכחה כמדויקת בזיהוי אוכלוסיות חיידקים. הערה קריטית אחת במהלך ההליך היא שזיהום DNA יכול להתרחש, ולכן נדרש טיפול מתאים בדגימה¹².

לאחר מכן, הדנ"א מנותח על ידי פלטפורמות הריצוף של הדור הבא עבור הגן 16S rRNA, כגון Illumina MiSeq. בפרט, אזור ההיפר-משתנה V4 מנותח כדי לספק כימות טוב יותר עבור טקסה^{בדרגה גבוהה 13}. ניתוח הביואינפורמטיקה שלאחר מכן הוא במיקור חוץ, ואחריו ניתוח פנימי בשיטות סטטיסטיות סטנדרטיות. ישנן תוכנות ביואינפורמטיקה רבות בקוד פתוח הזמינות לריצוף במורד הזרם, וסוג הניתוחים המבוצעים תלוי במידה רבה בשאלה הביולוגית הספציפית המעניינת¹⁴. פרוטוקול זה מתמקד באופן ספציפי בשלבי הניסוי לפני הריצוף ומספק שיטה רב-תכליתית, חסכונית, דומה ויעילה יותר להשגת דנ"א מדגימות צואה.

Protocol

לוקוס Cx3cr1 gfp/gfp של עכברי B6.129P2(Cg)-Cx3cr1^tm1Litt/J הוחזר לעכברי MRL/MpJ-Fas lpr/J (MRL/lpr) במשך 10 דורות כדי ליצור עכברי MRL/^lpr-CX ₃ CR1^gfp/gfp. בדיקת גנום באמצעות לוחות פולימורפיזם של נוקלאוטיד יחיד (SNP) אישרה כי הרקע הגנטי של עכברים חדשים שנוצרו היה זהה ביותר מ-97% לזה של MRL/lpr. לאחר מכן, עכברים גודלו ותוחזקו בסביבה ספציפית נטולת פתוגנים בהתאם לדרישות הספציפיות של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) בווירג'יניה טק.

1. איסוף דגימות מיקרוביוטה מעכברים

1. הוציאו כל עכבר בנפרד מהכלוב שלו. לאסוף כדור צואה ישירות מפי הטבעת ולאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס עד לעיבוד. מעבדים את הדגימות בעזרת מלקחיים, צינורות וכפפות סטריליים ונקיים.
   הערה: ניתן להשתמש במכל (לדוגמה,) כדי למקם את העכבר בזמן ההמתנה לדגימת הצואה. נקו את המיכל עם אתנול לפני ואחרי כל עכבר.
2. הוסף גלולה קפואה לצינור מכסה בורג במשקל 2 מ"ל ששקל מראש. להקליט את משקל הצואה בגרמים, אשר צריך להיות בין 0.02-0.05 גרם לכל גלולה צואה.
3. הוסיפו לכדור שכבה דקה של חרוזי זכוכית בקוטר 0.1 מ"מ, 500 מיקרון ליטר של חיץ ליזה (50 mM NaCl, 5 mM Tris ו-50 mM EDTA), ו-200 μL של 20% SDS.
4. חרוז-להכות את הצינור במשך 4 דקות הומוגנייזר (בעוצמה מקסימלית), ואחריו 3-5 דקות של מערבולת.
5. סובבו לזמן קצר כדי לחסל את הבועות והקצף (לחצו על הכפתור בצנטריפוגה עד שהיא מגיעה ל-1,000-1,200 x גרם, ואז שחררו).

2. מיצוי דנ"א

1. העבר 350 μL של supernatant שהושגו בשלב 1.5 (תוך הקפדה שלא לשאת פסולת) לצינור חדש של מכסה הצמדה של 1.5 מ"ל. הוסיפו 500 μL של תערובת פנול-כלורופורם-איזואמיל אלכוהול (PCI; 25:24:1, v/v) ומערבולת למשך דקה אחת.
   הערה: מעתה והלאה, יש לטפל בדגימות בתוך מכסה מנוע כימי. PCI הוא רעיל.
2. סובב ב- 6,000 x g למשך 3 דקות ב- 4 °C. העבר 180 μL מהפאזה המימית (השכבה העליונה) לצינור חדש של מכסה הצמדה של 1.5 מ"ל. מוסיפים 180 μL (1:1) של כלורופורם, היפוך וערבוב.
   הערה: צמצם את הזיהום מהשכבה התחתונה בעת העברת השכבה העליונה.
3. סובבו ב-18,400 x גרם למשך 3 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. העבר 180 μL של הפאזה המימית לתוך צינור מכסה הצמדה חדש.
   הערה: לאחר השלכת PCI וכלורופורם, ניתן לבצע את השלבים הבאים בארון בטיחות ביולוגי.
4. הוסיפו 180 μL של איזופרופנול קר ו-36 μL של 5M NH₄Ac. הפוך כמה פעמים כדי לערבב, והניחו את הצינור על קרח למשך 20 דקות.
5. סובב ב 18,400 x גרם במשך 20 דקות ב 4 °C. יוצקים כדי להשליך את הסופרנטנט. לשטוף את הכדור מספר פעמים עם 500 μL של קר 70% אתנול תוך היפוך.
   הערה: אתנול צריך להיות מדולל עם מים סטריליים דה-יוניזציה כפולה.
6. סובבו ב-18,400 x גרם למשך 3 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט כדי להסיר אתנול שיורי.
7. יש לייבש באוויר את הצינור במהופך על נייר טישו למשך 20 דקות, עד שהכדור מתבהר. להשעות את הכדור ב 50 μL של מים ברמה מולקולרית. מחממים את הנוזל בטמפרטורה של 37°C למשך 10 דקות כדי להמיס באופן מלא כדורי DNA גדולים.
8. סובבו צינורות לאחר חימום כדי לשחזר טיפות עיבוי על המכסה (3,400 x גרם למשך דקה אחת).
9. מדוד את הריכוז וקבל את היחס 260/280 באמצעות ספקטרופוטומטר. השתמש במים ברמה מולקולרית כריק. דנ"א באיכות טובה צריך להיות בעל יחסים של 260/280 הנעים בין 1.8 ל-2.
   הערה: תפוקת הדנ"א הצפויה היא לפחות 0.03 גרם לכל כדור צואה.

3. הכנת דגימה לריצוף גנים 16S rRNA

1. שלח את דגימות הדנ"א למעבדה הלאומית ארגון, שם הן עוברות הכנה לספרייה ומרוצפות על האילומינה מיסק.
   1. שלח דגימות בלוחות 96 בארות מלאים, עם דגימות מסודרות בשורות (A1-A12, B1-B12 וכו '), ואטום עם אטמי לוחות נייר כסף.
   2. שלח נפח סופי של 20 μL לכל דגימה לכל באר, בריכוז הנע בין 1-50 ng/μL.
      הערה: דילולים צריכים להיעשות עם מים ברמה מולקולרית.
   3. לאחר הכנת הדגימות, סובבו ב-600 x g למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר לפני הקפאת הדגימות ב-80°C- למשך 24 שעות.
   4. יש לשלוח למשך הלילה על קרח יבש.

תוצאות

התוצאות מהמעבדה הלאומית של ארגון מנותחות על ידי ביואינפורמטיקאי מוסמך, ולאחר מכן ניתוח פנימי של הנתונים בשיטות סטטיסטיות סטנדרטיות. ניתוחי מיקרוביום טיפוסיים כוללים אשכולות של רצפים דומים ליחידות טקסונומיות תפעוליות (OTUs) או וריאנטים של רצפי אמפליקון (ASVs) כפרוקסי למיקרואורגניזמים שונים ...

Discussion

מיקרוביוטה מאוזנת של המעיים יכולה להגן על גוף האדם מפני מחלות. ברגע שאיזון זה מופר על ידי טריגרים חיצוניים או פנימיים, התוצאות יכולות להיות הרסניות. שיטה זו מציגה דרך לנתח את הדינמיקה של מיקרוביוטה של המעיים במודלים של מורין. השיטה מתאימה לא רק להשוואות בין קבוצות, אלא גם למעקב אחר המיקרוב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 mm glass beads	BioSpec Products	11079101
2 mL screw cap tubes	Thermo Fisher Scientific	3488
20% SDS	FisherScientific	BP1311-1	SDS 20%
96% Ethanol, Molecular Biology Grade	Thermo Fisher Scientific	T032021000CS
Ammonium Acetate (5 M)	Thermo Fisher Scientific	AM9071	NH4AC 5M
B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J	Jackson Laboratory	005582
Bullet Blender storm 24	Next Advance	4116-BBY24M	Homogenizer
Chloroform	FisherScientific	C298-500
DEPC-Treated Water	Thermo Fisher Scientific	AM9916
Ethylenediamine Tetraacetic Acid	FisherScientific	BP118-500	EDTA
Foil plate seal	FisherScientific	NC0302491
Kimwipes-Kimtech 34256	FisherScientific	06-666C
MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice	Jackson Laboratory	000485
Nanodrop 2000 spectrophotomer	Thermo Fisher Scientific	ND2000CLAPTOP
Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1)	FisherScientific	BP1752I-400	PCI
Scale with 4 decimals	Mettler Toledo	MS205DU
Skirted 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	AB-0800
Sodium chloride	FisherScientific	15528154	NaCl
Tris Hydrochloride	FisherScientific	BP1757-100
Vortex	Scientific Industries	SI-0236