簡単で費用対効果の高いDNA単離法を用いたループス発生マウスの糞便微生物叢動態の解析(英語)

要約

このプロトコルは、自己免疫疾患の発症中のマウス腸内細菌叢の変化を分析するためのシンプルで費用効果の高いDNA単離方法を提供します。

要約

腸内細菌叢は、免疫系の教育に重要な役割を果たしています。この関係は、遺伝的要因だけでなく、発症の引き金となったり、病気の経過を悪化させたりする可能性のある環境要因によって引き起こされる自己免疫疾患を理解するために非常に重要です。狼瘡が発生しやすいMRL / lpr雌マウスの腸内細菌叢の動態に関する以前に発表された研究は、腸内細菌叢の変化が病気の進行をどのように変えることができるかを示しました。ここでは、自己免疫の研究のために腸内細菌叢から代表的なサンプルを抽出するためのプロトコルについて説明します。微生物叢サンプルは肛門から収集され、処理され、そこからフェノール - クロロホルム法を用いてDNAが抽出され、アルコール沈殿によって精製される。PCRを実行した後、精製されたアンプリコンは、アルゴンヌ国立研究所の次世代シーケンシングプラットフォームを使用してシーケンスされます。最後に、16SリボソームRNA遺伝子シーケンシングデータを解析します。例として、CX₃CR1の有無にかかわらずMRL/lprマウスの腸内細菌叢の比較から得られたデータが示されている。結果は、プロテオバクテリア門などの病原性細菌を含む属と、健康な共生微生物叢の一部と考えられている ビフィズス菌属に有意差を示しました。要約すると、このシンプルで費用効果の高いDNA単離方法は信頼性が高く、自己免疫疾患に関連する腸内細菌叢の変化の調査に役立ちます。

概要

人間とバクテリアは長い間共存してきました。彼らは、宿主の免疫応答に定量的および定性的な方法で影響を与える相互有益な効果との共依存関係を確立しました¹。最近の研究では、腸内細菌叢の組成と、多発性硬化症2、関節リウマチ³、²型糖尿病⁴、炎症性腸疾患⁵、全身性エリテマトーデス(SLE)⁶などの自己免疫疾患の病因との関連が示唆されています。しかし、腸内細菌叢がこれらの自己免疫疾患の主な原因なのか二次的な影響なのかはまだ不明です⁷。潜在的に、腸内細菌叢は自己免疫疾患のエフェクター段階で病気を悪化させたり、これらの病気の誘発を調節する役割を果たす可能性があります⁸。

腸内細菌叢症は、狼瘡が発生しやすいMRL/Mp-Faslpr(MRL/lpr)マウスで報告されており、乳酸菌の有意な枯渇を伴う腸内細菌叢の変化が観察されました⁹。5種類のラクトバチルス菌株を混合して経口投与したところ、狼瘡様症状は大きく軽減され、SLEの病態調節における微生物叢の重要な役割が示唆された。

以下のDNA抽出技術は、狼瘡を起こしやすいマウスのマウスSLE様疾患の過程で微生物叢の変動を追跡し、定性的および定量的に分析することを可能にする。健康な腸内細菌叢を調べるか、嚥下障害を定義するかにかかわらず、データがどのように収集され、それが正確で再現性があるかどうかを批判的に検討することが重要です¹⁰。このプロセスでは、すべてのステップが重要です。DNA抽出プロセス中にバイアスを導入する可能性のある問題は、微生物の表現が不正確になる可能性があるため、微生物DNAを抽出するには適切な方法論を使用する必要があります。フェノール-クロロホルム法がここに記載されているが、特定のケースでうまく機能する細菌からDNAを抽出するための市販のキットがあります¹¹。ただし、それらの使いやすさは、コストと必要なサンプル量によって制限されます。

ここで紹介するプロトコルは費用対効果が高く、少量のサンプルしか必要としません。あらゆる種類の便サンプルで問題なく機能し、時間の経過に伴う腸内細菌叢のダイナミクスの研究やグループ間の比較に役立ちます。DNAは、フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコールを使用するアルコール精製法で単離されます。アルコールベースの抽出は、最終ステップでDNAが沈殿するタンパク質や脂質のサンプルを洗浄して除去するのに役立ちます。提案手法は、効率と品質が著しく高く、細菌集団の同定において正確であることが証明されています。手順中の重要な注意点の1つは、DNA汚染が発生する可能性があるため、適切なサンプルの取り扱いが必要であることです¹²。

次に、DNAは、イルミナMiSeqなどの16S rRNA遺伝子の次世代シーケンシングプラットフォームによって分析されます。特に、V4超可変領域は、高ランク分類群¹³のより良い定量化を提供するために分析されます。その後のバイオインフォマティクス解析は外部委託し、その後、標準的な統計手法を用いた社内解析を行います。ダウンストリームシーケンシングに利用できるオープンソースのバイオインフォマティクスソフトウェアプログラムは多数あり、実行される分析の種類は、関心のある特定の生物学的問題に大きく依存します¹⁴。このプロトコルは、シーケンシング前の実験ステップに特に焦点を当てており、糞便サンプルからDNAを取得するためのより用途が広く、費用効果が高く、比較可能で効率的な方法を提供します。

プロトコル

B6.129P2(Cg)-Cx3cr1^tm1Litt/JマウスのCx3cr1 gfp/^gfp遺伝子座をMRL/MpJ-Fas lpr/J(MRL/lpr)に10世代にわたってバッククロスさせ、MRL/^lpr-CX ₃CR1 gfp^/gfpマウスを作製した。一塩基多型(SNP)パネルを用いたゲノムスクリーニングにより、新たに作製したマウスの遺伝的背景はMRL/LPRと97%以上同一であることが確認された。その後、マウスは、バージニア工科大学の施設内動物管理使用委員会(IACUC)の特定の要件に従って、特定の病原体のない環境で飼育および維持され、サンプルは、マウスが13、14、および15週齢のときに収集されました。

1.マウスからの微生物叢サンプルの収集

1. 各マウスを個別にケージから取り出します。糞便ペレットを肛門から直接採取し、処理されるまで-80°Cで保管します。滅菌済みの清潔な鉗子、チューブ、手袋でサンプルを処理します。
   注意: 容器(ビーカーなど)を使用して、糞便サンプルを待っている間にマウスを置くことができます。各マウスの前後にエタノールで容器を洗浄します。
2. 凍結ペレットを事前に計量した2 mLスクリューキャップチューブに追加します。糞便重量をグラム単位で記録し、糞便ペレットあたり0.02〜0.05 gにする必要があります。
3. 0.1 mmガラスビーズの薄層、500 μLの溶解バッファー(50 mM NaCl、5 mM Tris、および50 mM EDTA)、および200 μLの20% SDSをペレットに加えます。
4. チューブをホモジナイザーで4分間(最大出力で)ビーズビートした後、3〜5分間ボルテックスします。
5. 泡と泡を取り除くために短時間回転します(遠心分離機のボタンを1,000〜1,200 x gに達するまで押してから解放します)。

2.DNA抽出

1. ステップ1.5で得られた上清350 μL(破片を運ばないように)を新しい1.5 mLスナップキャップチューブに移します。500 μLのフェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール(PCI;25:24:1、v / v)混合物を加え、1分間ボルテックスします。
   注:今後、サンプルは化学フード内で取り扱う必要があります。PCIは有毒です。
2. 6,000 x g で4°Cで3分間スピンします。 180 μLの水相(最上層)を新しい1.5 mLスナップキャップチューブに移します。180 μL(1:1)のクロロホルムを加え、反転させて混合します。
   注意: 最上層を転送するときは、最下層からの汚染を最小限に抑えてください。
3. 18,400 x g で4°Cで3分間スピンします。 180 μLの水相を新しいスナップキャップチューブに移します。
   注意: PCIとクロロホルムを廃棄した後、生物学的安全キャビネットで次の手順を実行できます。
4. 180 μLの冷イソプロパノールと36 μLの5M NH₄Acを加え、数回反転させて混合し、チューブを氷上に20分間置きます。
5. 18,400 x g で4°Cで20分間スピンします。 上清を捨てるために注ぐ。反転させながら、500μLの冷たい70%エタノールでペレットを数回洗浄します。
   注:エタノールは二重脱イオン滅菌水で希釈する必要があります。
6. 18,400 x g で4°Cで3分間スピンします。 上清を廃棄して残留エタノールを除去する。
7. ペレットが透明になるまで、ティッシュペーパー上でチューブを逆さまに20分間風乾します。ペレットを50 μLの分子グレードの水に懸濁します。液体を37°Cで10分間加熱して、大きなDNAペレットを完全に溶解します。
8. 加熱後にチューブを回転させて、蓋の結露液滴を回収します(3,400 x g で1分間)。
9. 濃度を測定し、分光光度計を使用して260/280比を取得します。ブランクとして分子グレードの水を使用してください。良質のDNAは、1.8から2の範囲の260/280の比率を持つ必要があります。
   注:予想されるDNA収量は、糞便ペレットあたり少なくとも0.03gです。

3. 16S rRNA遺伝子シーケンシングのためのサンプル調製

1. DNAサンプルをアルゴンヌ国立研究所に送り、そこでライブラリの準備を行い、イルミナミセックで配列決定します。
   1. サンプルをフルスカートの96ウェルプレートで送り、サンプルを列(A1-A12、B1-B12など)に配置し、ホイルプレートシールで密封します。
   2. 1ウェルあたりサンプルあたり20 μLの最終容量を、1〜50 ng / μLの濃度で送ります。
      注:希釈は分子グレードの水で行う必要があります。
   3. サンプルを調製した後、室温で600 x g で1分間回転してから、サンプルを-80°Cで24時間凍結します。
   4. ドライアイスで一晩送ってください。

結果

アルゴンヌ国立研究所の結果は、資格のあるバイオインフォマティシャンによって分析され、続いて標準的な統計的手法を使用して社内でデータが分析されます。典型的なマイクロバイオーム分析では、サンプル中のさまざまな微生物の代理として、類似した配列を操作分類単位(OTU)またはアンプリコン配列バリアント(ASV)にクラスター化します。次に、サンプル全体のOTUまたはASVの数を使用...

ディスカッション

バランスの取れた腸内細菌叢は、人体を病気から守ることができます。このバランスが外部または内部のトリガーによって乱されると、結果は壊滅的なものになる可能性があります。この方法は、マウスモデルにおける腸内細菌叢の動態を分析する方法を提示します。この方法は、グループ間の比較だけでなく、腸内細菌叢を経時的に追跡して、腸内細菌叢を破壊する時間依存の要因をより?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 mm glass beads	BioSpec Products	11079101
2 mL screw cap tubes	Thermo Fisher Scientific	3488
20% SDS	FisherScientific	BP1311-1	SDS 20%
96% Ethanol, Molecular Biology Grade	Thermo Fisher Scientific	T032021000CS
Ammonium Acetate (5 M)	Thermo Fisher Scientific	AM9071	NH4AC 5M
B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J	Jackson Laboratory	005582
Bullet Blender storm 24	Next Advance	4116-BBY24M	Homogenizer
Chloroform	FisherScientific	C298-500
DEPC-Treated Water	Thermo Fisher Scientific	AM9916
Ethylenediamine Tetraacetic Acid	FisherScientific	BP118-500	EDTA
Foil plate seal	FisherScientific	NC0302491
Kimwipes-Kimtech 34256	FisherScientific	06-666C
MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice	Jackson Laboratory	000485
Nanodrop 2000 spectrophotomer	Thermo Fisher Scientific	ND2000CLAPTOP
Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1)	FisherScientific	BP1752I-400	PCI
Scale with 4 decimals	Mettler Toledo	MS205DU
Skirted 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	AB-0800
Sodium chloride	FisherScientific	15528154	NaCl
Tris Hydrochloride	FisherScientific	BP1757-100
Vortex	Scientific Industries	SI-0236