JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, otoimmün hastalığın gelişimi sırasında murin bağırsak mikrobiyota değişikliklerinin analizi için basit, uygun maliyetli bir DNA izolasyon yöntemi sağlar.

Özet

Bağırsak mikrobiyotası bağışıklık sisteminin eğitiminde önemli bir role sahiptir. Bu ilişki, sadece genetik faktörler tarafından yönlendirilen otoimmün hastalıkları değil, aynı zamanda hastalığın başlangıcını tetikleyebilecek ve / veya hastalığın seyrini kötüleştirebilecek çevresel faktörleri anlamak için son derece önemlidir. Lupus eğilimli MRL / lpr dişi farelerde bağırsak mikrobiyotasının dinamikleri üzerine daha önce yayınlanmış bir çalışma, bağırsak mikrobiyotasındaki değişikliklerin hastalığın ilerlemesini nasıl değiştirebileceğini göstermiştir. Burada, otoimmünite çalışmaları için bağırsak mikrobiyotasından temsili örneklerin çıkarılması için bir protokol açıklanmaktadır. Mikrobiyota örnekleri anüsten toplanır ve DNA'nın bir fenol-kloroform yöntemi kullanılarak ekstrakte edildiği ve alkol çökeltmesi ile saflaştırıldığı işlenir. PCR yapıldıktan sonra, saflaştırılmış amplikler Argonne Ulusal Laboratuvarı'nda Yeni Nesil Dizileme platformu kullanılarak sıralanır. Son olarak, 16S ribozomal RNA gen dizileme verileri analiz edilir. Örnek olarak, CX3CR1 olan veya olmayan MRL / lpr farelerinin bağırsak mikrobiyota karşılaştırmalarından elde edilen veriler gösterilmiştir. Sonuçlar, filum Proteobakteriler gibi patojenik bakteriler içeren cinslerde ve sağlıklı kommensal mikrobiyotanın bir parçası olarak kabul edilen Bifidobacterium cinsinde önemli farklılıklar göstermiştir. Özetle, bu basit, uygun maliyetli DNA izolasyon yöntemi güvenilirdir ve otoimmün hastalıklarla ilişkili bağırsak mikrobiyota değişikliklerinin araştırılmasına yardımcı olabilir.

Giriş

İnsanlar ve bakteriler uzun süredir bir arada var olmuşlardır. Konakçı immün yanıtlarını nicel ve nitel yollarla etkileyen karşılıklı yararlı etkilerle birlikte bağımlı bir ilişki kurmuşlardır1. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, bağırsak mikrobiyota bileşimi ile multipl skleroz 2, romatoid artrit3, tip2 diyabet4, İnflamatuar bağırsak hastalığı5 ve sistemik lupus eritematozus (SLE)6'yı içeren otoimmün hastalıkların patogenezi arasında bir ilişki olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, bağırsak mikrobiyotasının bu otoimmün hastalıkların ana nedeni mi yoksa ikincil bir etkisi mi olduğu hala belirsizdir7. Potansiyel olarak, bağırsak mikrobiyotası, otoimmün bozuklukların efektör fazı sırasında hastalığı şiddetlendirebilir veya bu hastalıkların indüksiyonunu düzenlemede rol oynayabilir8.

Lupus eğilimli dişi MRL/Mp-Faslpr (MRL/lpr) farelerde intestinal dysbiosis bildirilmiştir ve Lactobacilli'nin belirgin bir şekilde tükenmesiyle bağırsak mikrobiyota değişiklikleri gözlenmiştir9. Beş Lactobacillus suşunun bir karışımı oral yoldan uygulandığında, bu farelerde lupus benzeri semptomlar büyük ölçüde azaldı ve bu da SLE patogenezini düzenlemede mikrobiyotanın önemli bir rol oynadığını düşündürdü.

Aşağıdaki DNA ekstraksiyon tekniği, lupus eğilimli farelerde murin SLE benzeri hastalığın seyri sırasında mikrobiyota dalgalanmalarını takip etmeyi ve bunları kalitatif ve kantitatif olarak analiz etmeyi sağlar. Sağlıklı bağırsak mikrobiyotasını incelemek veya dysbiosis'i tanımlamak olsun, verilerin nasıl toplandığını ve doğru ve tekrarlanabilir olup olmadığını eleştirel olarak incelemek önemlidir10. Bu süreçte atılan her adım kritik öneme sahiptir. Mikrobiyal DNA'yı çıkarmak için uygun bir metodoloji kullanılmalıdır, çünkü DNA ekstraksiyon işlemi sırasında önyargılara neden olan olası herhangi bir sorun, yanlış mikrobiyal temsile neden olabilir. Fenol-kloroform yöntemi burada tarif edilirken, belirli durumlarda iyi çalışan bakterilerden DNA çıkarmak için ticari olarak temin edilebilen kitler vardır11. Bununla birlikte, kullanılabilirlikleri maliyet ve gerekli numune miktarı ile sınırlıdır.

Burada sunulan protokol uygun maliyetlidir ve sadece az miktarda örnek gerektirir. Her türlü dışkı örneği ile iyi çalışır ve zaman içinde bağırsak mikrobiyotasının dinamiklerini ve gruplar arasındaki karşılaştırmaları incelemede yararlıdır. DNA, fenol, kloroform ve izoamil alkol kullanan bir alkol saflaştırma yöntemi ile izole edilir. Alkol bazlı ekstraksiyon, DNA'nın son adımda çökeldiği protein ve lipit örneğinin temizlenmesine ve çıkarılmasına yardımcı olur. Önerilen yöntem önemli ölçüde yüksek verimlilik ve kaliteye sahiptir ve bakteri popülasyonlarının tanımlanmasında doğru olduğu kanıtlanmıştır. İşlem sırasında kritik bir not, DNA kontaminasyonunun meydana gelebileceği ve bu nedenle uygun numune elleçlemesinin gerekli olduğudur12.

DNA daha sonra Illumina MiSeq gibi 16S rRNA geni için Yeni Nesil Dizileme platformları tarafından analiz edilir. Özellikle, V4 hiper değişken bölgesi, yüksek dereceli taksonlar13 için daha iyi bir niceleme sağlamak üzere analiz edilir. Sonraki biyoinformatik analizler dış kaynaklı olup, bunu standart istatistiksel yöntemler kullanılarak kurum içi analiz izlemektedir. Aşağı akış dizilimi için çok sayıda açık kaynaklı biyoinformatik yazılım programı mevcuttur ve yapılan analizlerin türü büyük ölçüde ilgilenilen spesifik biyolojik soruya bağlıdır14. Bu protokol özellikle dizilemeden önceki deneysel adımlara odaklanır ve dışkı örneklerinden DNA elde etmek için daha çok yönlü, uygun maliyetli, karşılaştırılabilir ve verimli bir yöntem sağlar.

Protokol

B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J farelerinin Cx3cr1 gfp/gfp lokusu, MRL/lpr-CX3CR1 gfp/gfp fareleri üretmek için 10 nesil boyunca MRL/MpJ-Fas lpr/J'ye (MRL/lpr) geri döndürüldü. Tek nükleotid polimorfizmi (SNP) panelleri kullanılarak yapılan genom taraması, yeni üretilen farelerin genetik arka planının MRL / lpr'ninkiyle % 97'den fazla aynı olduğunu doğruladı. Bundan sonra, fareler Virginia Tech'teki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin (IACUC) özel gereksinimlerini takiben belirli bir patojensiz ortamda yetiştirildi ve muhafaza edildi. fareler 13, 14 ve 15 haftalıkken örnekler toplandı.

1. Farelerden mikrobiyota örneklerinin toplanması

  1. Her fareyi ayrı ayrı kafesinden çıkarın. Doğrudan anüsten bir dışkı peleti toplayın ve işlenene kadar -80 ° C'de saklayın. Numuneleri steril ve temiz forseps, tüp ve eldivenlerle işleyin.
    NOT: Fekal numuneyi beklerken fareyi yerleştirmek için bir kap (örneğin, bir beher) kullanılabilir. Kabı her fareden önce ve sonra etanol ile temizleyin.
  2. Önceden tartılmış 2 mL vidalı kapak tüpüne dondurulmuş bir pelet ekleyin. Fekal ağırlığı, dışkı peleti başına 0.02-0.05 g arasında olması gereken gram cinsinden kaydedin.
  3. Pelet üzerine ince bir 0,1 mm cam boncuk tabakası, 500 μL lizis tamponu (50 mM NaCl, 5 mM Tris ve 50 mM EDTA) ve 200 μL% 20 SDS ekleyin.
  4. Boncukla tüpü bir homojenizatörde (maksimum güçte) 4 dakika çırpın, ardından 3-5 dakika girdap yapın.
  5. Kabarcıkları ve köpüğü gidermek için kısa bir süre döndürün (santrifüj üzerindeki düğmeye 1.000-1.200 x g'ye ulaşana kadar basın ve ardından serbest bırakın).

2. DNA ekstraksiyonu

  1. Adım 1.5'te elde edilen 350 μL süpernatantı (herhangi bir döküntü taşımamak için) yeni bir 1.5 mL çıtçıtlı kapak tüpüne aktarın. 500 μL fenol-kloroform-izoamil alkol (PCI; 25:24:1, v/v) karışımı ve vorteksini 1 dakika boyunca ekleyin.
    NOT: Şu andan itibaren, numunelerin kimyasal bir başlık içinde işlenmesi gerekmektedir. PCI toksiktir.
  2. 4 ° C'de 3 dakika boyunca 6.000 x g'de döndürün. Sulu fazın 180 μL'sini (üst tabaka) yeni bir 1,5 mL çıtçıtlı kapak tüpüne aktarın. 180 μL (1:1) kloroform ekleyin, ters çevirin ve karıştırın.
    NOT: Üst katmanı aktarırken alt katmandan kaynaklanan kontaminasyonu en aza indirin.
  3. 4 ° C'de 3 dakika boyunca 18.400 x g'de döndürün. Sulu fazın 180 μL'sini yeni bir çıtçıtlı kapak tüpüne aktarın.
    NOT: PCI ve kloroform atıldıktan sonra, aşağıdaki adımlar biyolojik bir güvenlik kabininde gerçekleştirilebilir.
  4. 180 μL soğuk izopropanol ve 36 μL 5M NH4Ac. Karıştırmak için birkaç kez ters çevirin ve tüpü 20 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
  5. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 18.400 x g'de döndürün. Süper natantı atmak için dökün. Ters çevirirken peleti birkaç kez 500 μL soğuk% 70 etanol ile yıkayın.
    NOT: Etanol, çift deiyonize steril su ile seyreltilmelidir.
  6. 4 ° C'de 3 dakika boyunca 18.400 x g'de döndürün. Artık etanol çıkarmak için süpernatantı atın.
  7. Pelet berraklaşana kadar tüpü kağıt mendil üzerinde 20 dakika boyunca baş aşağı kurutun. Peleti 50 μL moleküler sınıf suya askıya alın. Büyük DNA peletlerini tamamen çözmek için sıvıyı 37 ° C'de 10 dakika ısıtın.
  8. Kapaktaki yoğuşma damlacıklarını geri kazanmak için ısıtmadan sonra tüpleri döndürün (1 dakika boyunca 3.400 x g).
  9. Konsantrasyonu ölçün ve bir spektrofotometre kullanarak 260/280 oranını elde edin. Moleküler sınıf suyu boş olarak kullanın. Kaliteli DNA, 1.8 ile 2 arasında değişen 260/280 oranlarına sahip olmalıdır.
    NOT: Beklenen DNA verimi dışkı peleti başına en az 0.03 g'dır.

3. 16S rRNA gen dizilimi için numune hazırlama

  1. DNA örneklerini kütüphane hazırlığından geçirildikleri ve Illumina Miseq'te sıralandıkları Argonne Ulusal Laboratuvarı'na gönderin.
    1. Numuneleri tam etekli 96 delikli plakalarda, numuneler sıralar halinde düzenlenmiş (A1-A12, B1-B12, vb.) ve folyo plaka contalarıyla kapatılmış olarak gönderin.
    2. Kuyucuk başına numune başına 1-50 ng/μL arasında değişen konsantrasyonda 20 μL'lik bir son hacim gönderin.
      NOT: Dillendirmeler moleküler sınıf su ile yapılmalıdır.
    3. Numuneleri hazırladıktan sonra, numuneleri 24 saat boyunca -80 °C'de dondurmadan önce oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 600 x g'da döndürün.
    4. Gece boyunca kuru buz üzerinde gönderin.

Sonuçlar

Argonne Ulusal Laboratuvarı'ndan elde edilen sonuçlar, nitelikli bir biyoinformatikçi tarafından analiz edilir ve ardından standart istatistiksel yöntemler kullanılarak verilerin kurum içi analizi yapılır. Tipik mikrobiyom analizleri, benzer dizilerin bir numunedeki farklı mikroorganizmalar için bir vekil olarak operasyonel taksonomik birimlere (OTU'lar) veya amplikon dizisi varyantlarına (ASV'ler) kümelenmesini içerir. Numuneler arasındaki OTU'ların veya ASV'lerin sayıları daha sonra numune içi (alfa...

Tartışmalar

Dengeli bağırsak mikrobiyotası insan vücudunu hastalıklardan koruyabilir. Bu denge dış veya iç tetikleyiciler tarafından bozulduğunda, sonuçlar yıkıcı olabilir. Bu yöntem, murin modellerinde bağırsak mikrobiyotasının dinamiklerini analiz etmenin bir yolunu sunar. Yöntem sadece gruplar arasındaki karşılaştırmalar için değil, aynı zamanda bağırsak mikrobiyotasını bozan zamana bağlı faktörleri daha iyi tanımlamak için bağırsak mikrobiyotasını zaman içinde izlemek için de uygundur.<...

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Argonne Ulusal Laboratuvarı'nın ve işbirliği yapan biyoinformatikçilerimizin yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma çeşitli NIH ve dahili hibelerle desteklenmektedir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 mm glass beadsBioSpec Products11079101
2 mL screw cap tubesThermo Fisher Scientific3488
20% SDSFisherScientificBP1311-1SDS 20%
96% Ethanol, Molecular Biology GradeThermo Fisher ScientificT032021000CS
Ammonium Acetate (5 M)Thermo Fisher ScientificAM9071NH4AC 5M
B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/JJackson Laboratory005582
Bullet Blender storm 24Next Advance4116-BBY24MHomogenizer
ChloroformFisherScientificC298-500
DEPC-Treated WaterThermo Fisher ScientificAM9916
Ethylenediamine Tetraacetic AcidFisherScientificBP118-500EDTA
Foil plate sealFisherScientificNC0302491
Kimwipes-Kimtech 34256FisherScientific06-666C
MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) miceJackson Laboratory000485
Nanodrop 2000 spectrophotomerThermo Fisher ScientificND2000CLAPTOP
Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1)FisherScientificBP1752I-400PCI
Scale with 4 decimalsMettler ToledoMS205DU
Skirted 96-well platesThermo Fisher ScientificAB-0800
Sodium chlorideFisherScientific15528154NaCl
Tris HydrochlorideFisherScientificBP1757-100
VortexScientific IndustriesSI-0236

Referanslar

  1. Lee, Y. K., Mazmanian, S. K. Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system. Science. 330 (6012), 1768-1773 (2010).
  2. Lee, Y. K., Menezes, J. S., Umesaki, Y., Mazmanian, S. K. Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4615-4622 (2011).
  3. Yeoh, N., Burton, J. P., Suppiah, P., Reid, G., Stebbings, S. The role of the microbiome in rheumatic diseases. Current Rheumatology Reports. 15 (3), 314 (2013).
  4. Larsen, N., et al. Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults. PLoS One. 5 (2), 9085 (2010).
  5. Alam, M. T., et al. Microbial imbalance in inflammatory bowel disease patients at different taxonomic levels. Gut Pathogens. 12 (1), (2020).
  6. Vieira, S. M., Pagovich, O. E., Kriegel, M. A. Diet, microbiota and autoimmune diseases. Lupus. 23 (6), 518-526 (2014).
  7. Mu, Q., Zhang, H., Luo, X. M. SLE: another autoimmune disorder influenced by microbes and diet. Frontiers of Immunology. 6, 608 (2015).
  8. Tektonidou, M. G., Wang, Z., Dasgupta, A., Ward, M. M. Burden of serious infections in adults with systemic lupus erythematosus: a national population-based study. Arthritis Care & Research. 67 (8), 1078-1085 (2015).
  9. Mu, Q., et al. Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota. Microbiome. 5 (1), 73 (2017).
  10. Panek, M., et al. Methodology challenges in studying human gut microbiota - effects of collection, storage, DNA extraction and next generation sequencing technologies. Scientific Reports. 8 (1), 5143 (2018).
  11. Fiedorová, K., et al. The impact of dna extraction methods on stool bacterial and fungal microbiota community recovery. Frontiers in Microbiology. 10, 821 (2019).
  12. Gerasimidis, K., et al. The effect of DNA extraction methodology on gut microbiota research applications. BMC Research Notes. 9, 365 (2016).
  13. Bukin, Y. S., et al. The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results. Scientific Data. 6 (1), 190007 (2019).
  14. Galloway-Peña, J., Hanson, B. Tools for analysis of the microbiome. Digestive Diseases and Sciences. 65 (3), 674-685 (2020).
  15. Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Frontiers in Plant Science. 5, 209 (2014).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 183

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır