Análisis de la dinámica de la microbiota fecal en ratones propensos al lupus utilizando un método de aislamiento de ADN simple y rentable

Resumen

Este protocolo proporciona un método de aislamiento de ADN simple y rentable para el análisis de alteraciones de la microbiota intestinal murina durante el desarrollo de enfermedades autoinmunes.

Resumen

La microbiota intestinal tiene un papel importante en la educación del sistema inmunológico. Esta relación es extremadamente importante para comprender las enfermedades autoinmunes que no solo son impulsadas por factores genéticos, sino también por factores ambientales que pueden desencadenar la aparición y / o empeorar el curso de la enfermedad. Un estudio publicado anteriormente sobre la dinámica de la microbiota intestinal en ratones hembra LMR/lpr propensos al lupus mostró cómo los cambios en la microbiota intestinal pueden alterar la progresión de la enfermedad. Aquí, se describe un protocolo para extraer muestras representativas de la microbiota intestinal para estudios de autoinmunidad. Las muestras de microbiota se recogen del ano y se procesan, de las cuales se extrae el ADN utilizando un método de fenol-cloroformo y se purifica mediante precipitación de alcohol. Después de realizar la PCR, los amplicones purificados se secuencian utilizando una plataforma de secuenciación de próxima generación en el Laboratorio Nacional de Argonne. Finalmente, se analizan los datos de secuenciación del gen de ARN ribosómico 16S. Como ejemplo, se muestran los datos obtenidos de las comparaciones de la microbiota intestinal de ratones LMR/lpr con o sin CX₃CR1. Los resultados mostraron diferencias significativas en géneros que contienen bacterias patógenas, como las del filo Proteobacteria, así como el género Bifidobacterium, que se considera parte de la microbiota comensal sana. En resumen, este método de aislamiento de ADN simple y rentable es confiable y puede ayudar a la investigación de los cambios en la microbiota intestinal asociados con enfermedades autoinmunes.

Introducción

Los seres humanos y las bacterias han coexistido durante mucho tiempo. Han establecido una relación codependiente con efectos beneficiosos mutuos que influye en las respuestas inmunes del huésped de manera cuantitativa y cualitativa¹. Estudios recientes sugieren una asociación entre la composición de la microbiota intestinal y la patogénesis de enfermedades autoinmunes que incluyen la esclerosis múltiple 2, la artritis reumatoide³, la diabetes tipo^{2 4}, la enfermedad inflamatoria intestinal⁵ y el lupus eritematoso sistémico (LES)⁶. Sin embargo, aún no está claro si la microbiota intestinal es la causa principal o un efecto secundario de estas enfermedades autoinmunes⁷. Potencialmente, la microbiota intestinal podría exacerbar la enfermedad durante la fase efectora de los trastornos autoinmunes o desempeñar un papel en la regulación de la inducción de estas enfermedades⁸.

Se ha descrito disbiosis intestinal en ratones hembra propensos al lupus MRL/Mp-Faslpr (LMR/lpr), y se observaron cambios en la microbiota intestinal con un agotamiento significativo de los lactobacilos⁹. Cuando se administró por vía oral una mezcla de cinco cepas de Lactobacillus, los síntomas similares al lupus se atenuaron en gran medida en estos ratones, lo que sugiere un papel esencial de la microbiota en la regulación de la patogénesis del LES.

La siguiente técnica de extracción de ADN permite seguir las fluctuaciones de la microbiota y analizarlas cualitativa y cuantitativamente durante el curso de la enfermedad murina similar al LES en ratones propensos al lupus. Ya sea para examinar la microbiota intestinal sana o definir la disbiosis, es importante examinar críticamente cómo se recopilan los datos y si son precisos y reproducibles¹⁰. Cada paso es crítico en este proceso. Se debe utilizar una metodología adecuada para extraer ADN microbiano, ya que cualquier posible problema que introduzca sesgos durante el proceso de extracción de ADN podría resultar en una representación microbiana inexacta. Si bien el método fenol-cloroformo se describe aquí, existen kits disponibles comercialmente para extraer ADN de bacterias que funcionan bien en casos particulares¹¹. Sin embargo, su usabilidad está limitada por el costo y la cantidad de muestra requerida.

El protocolo presentado aquí es rentable y requiere solo una pequeña cantidad de muestra. Funciona bien con cualquier tipo de muestra de heces y es útil para estudiar la dinámica de la microbiota intestinal a lo largo del tiempo, así como las comparaciones entre grupos. El ADN se aísla con un método de purificación de alcohol, que utiliza fenol, cloroformo y alcohol isoamílico. La extracción a base de alcohol ayuda a limpiar y eliminar la muestra de proteínas y lípidos, donde el ADN se precipita en el paso final. El método propuesto tiene una eficiencia y calidad significativamente altas y ha demostrado ser preciso en la identificación de poblaciones bacterianas. Una nota crítica durante el procedimiento es que la contaminación del ADN puede ocurrir, y por lo tanto se requiere un manejo adecuado de la muestra¹².

Luego, el ADN es analizado por las plataformas de secuenciación de próxima generación para el gen 16S rRNA, como el Illumina MiSeq. En particular, la región hipervariable V4 se analiza para proporcionar una mejor cuantificación de los taxones de alto rango¹³. El análisis bioinformático posterior se subcontrata, seguido de un análisis interno utilizando métodos estadísticos estándar. Existen numerosos programas de software bioinformático de código abierto disponibles para la secuenciación posterior, y el tipo de análisis realizados depende en gran medida de la cuestión biológica específica de interés¹⁴. Este protocolo se centra específicamente en los pasos experimentales previos a la secuenciación y proporciona un método más versátil, rentable, comparable y eficiente para obtener ADN de muestras fecales.

Protocolo

El locus Cx3cr1 gfp/gfp de ratones B6.129P2(Cg)-Cx3cr1^tm1Litt/J se cruzó con MRL/MpJ-Fas lpr/J (MRL/lpr) durante 10 generaciones para generar ratones MRL/^lpr-CX ₃ CR1 gfp^/gfp. El cribado del genoma utilizando paneles de polimorfismo de nucleótido único (SNP) confirmó que el fondo genético de los ratones recién generados era más del 97% idéntico al de MRL / lpr. Después de eso, los ratones fueron criados y mantenidos en un ambiente específico libre de patógenos siguiendo los requisitos específicos del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en Virginia Tech. Las muestras se recolectaron cuando los ratones tenían 13, 14 y 15 semanas de edad.

1. Recogida de muestras de microbiota de ratones

1. Saque cada ratón individualmente de su jaula. Recoja un pellet fecal directamente del ano y guárdelo a -80 °C hasta que se procese. Procese las muestras con pinzas, tubos y guantes estériles y limpios.
   NOTA: Se puede usar un recipiente (por ejemplo, un vaso de precipitados) para colocar el mouse mientras espera la muestra fecal. Limpie el recipiente con etanol antes y después de cada ratón.
2. Agregue un pellet congelado a un tubo de tapón de rosca de 2 ml previamente pesado. Registre el peso fecal en gramos, que debe estar entre 0.02-0.05 g por pellet fecal.
3. Agregue al pellet una capa delgada de perlas de vidrio de 0,1 mm, 500 μL de tampón de lisis (50 mM de NaCl, 5 mM Tris y 50 mM de EDTA) y 200 μL de 20% de SDS.
4. Batir el tubo durante 4 minutos en un homogeneizador (a máxima potencia), seguido de 3-5 minutos de vórtice.
5. Gire durante un corto tiempo para eliminar las burbujas y la espuma (presione el botón de la centrífuga hasta que alcance 1,000-1,200 x g, y luego suéltelo).

2. Extracción de ADN

1. Transfiera 350 μL de sobrenadante obtenido en el paso 1.5 (asegurándose de no transportar residuos) a un nuevo tubo de tapa a presión de 1,5 ml. Añadir 500 μL de mezcla de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (PCI; 25:24:1, v/v) y vórtice durante 1 min.
   NOTA: A partir de ahora, las muestras deben manipularse dentro de una campana química. La PCI es tóxica.
2. Girar a 6.000 x g durante 3 min a 4 °C. Transfiera 180 μL de la fase acuosa (capa superior) a un nuevo tubo de tapa de presión de 1,5 ml. Añadir 180 μL (1:1) de cloroformo, invertir y mezclar.
   NOTA: Minimice la contaminación de la capa inferior al transferir la capa superior.
3. Girar a 18.400 x g durante 3 min a 4 °C. Transfiera 180 μL de la fase acuosa a un nuevo tubo de tapa a presión.
   NOTA: Después de desechar PCI y cloroformo, los siguientes pasos se pueden realizar en un gabinete de seguridad biológica.
4. Agregue 180 μL de isopropanol frío y 36 μL de 5M NH₄Ac. Invierta varias veces para mezclar y coloque el tubo en hielo durante 20 min.
5. Girar a 18.400 x g durante 20 min a 4 °C. Vierta para desechar el sobrenadante. Lave el pellet varias veces con 500 μL de etanol frío al 70% mientras invierte.
   NOTA: El etanol debe diluirse con agua estéril doblemente desionizada.
6. Girar a 18.400 x g durante 3 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante para eliminar el etanol residual.
7. Seque al aire el tubo boca abajo sobre papel de seda durante 20 minutos, hasta que el pellet se vuelva transparente. Suspender el pellet en 50 μL de agua de grado molecular. Calentar el líquido a 37 °C durante 10 minutos para disolver completamente los gránulos grandes de ADN.
8. Girar los tubos después del calentamiento para recuperar las gotas de condensación en la tapa (3.400 x g durante 1 min).
9. Mida la concentración y obtenga la relación 260/280 utilizando un espectrofotómetro. Use agua de grado molecular como un espacio en blanco. El ADN de buena calidad debe tener proporciones 260/280 que oscilan entre 1,8 y 2.
   NOTA: El rendimiento esperado de ADN es de al menos 0,03 g por pellet fecal.

3. Preparación de la muestra para la secuenciación del gen 16S rRNA

1. Envíe las muestras de ADN al Laboratorio Nacional de Argonne, donde se someten a la preparación de la biblioteca y se secuencian en el Illumina Miseq.
   1. Envíe las muestras en placas de 96 pocillos completamente faldadas, con muestras dispuestas en filas (A1-A12, B1-B12, etc.) y selladas con sellos de placa de aluminio.
   2. Enviar un volumen final de 20 μL por muestra por pocillo, con una concentración de 1 a 50 ng/μL.
      NOTA: Las diluciones deben hacerse con agua de grado molecular.
   3. Después de preparar las muestras, hilar a 600 x g durante 1 min a temperatura ambiente antes de congelar las muestras a -80 °C durante 24 h.
   4. Enviar durante la noche en hielo seco.

Resultados

Los resultados del Laboratorio Nacional de Argonne son analizados por un bioinformático calificado, seguido de un análisis interno de los datos utilizando métodos estadísticos estándar. Los análisis típicos del microbioma implican la agrupación de secuencias similares en unidades taxonómicas operativas (OTU) o variantes de secuencia de amplicón (ASV) como un proxy para diferentes microorganismos en una muestra. Los recuentos de OTU o ASV en todas las muestras se pueden usar para verificar los cambios en la dive...

Discusión

Una microbiota intestinal equilibrada puede proteger al cuerpo humano de las enfermedades. Una vez que este equilibrio se ve interrumpido por desencadenantes externos o internos, las consecuencias pueden ser devastadoras. Este método presenta una forma de analizar la dinámica de la microbiota intestinal en modelos murinos. El método es adecuado no solo para comparaciones entre grupos, sino también para rastrear la microbiota intestinal a lo largo del tiempo para identificar mejor los factores dependientes del tiempo ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 mm glass beads	BioSpec Products	11079101
2 mL screw cap tubes	Thermo Fisher Scientific	3488
20% SDS	FisherScientific	BP1311-1	SDS 20%
96% Ethanol, Molecular Biology Grade	Thermo Fisher Scientific	T032021000CS
Ammonium Acetate (5 M)	Thermo Fisher Scientific	AM9071	NH4AC 5M
B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J	Jackson Laboratory	005582
Bullet Blender storm 24	Next Advance	4116-BBY24M	Homogenizer
Chloroform	FisherScientific	C298-500
DEPC-Treated Water	Thermo Fisher Scientific	AM9916
Ethylenediamine Tetraacetic Acid	FisherScientific	BP118-500	EDTA
Foil plate seal	FisherScientific	NC0302491
Kimwipes-Kimtech 34256	FisherScientific	06-666C
MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice	Jackson Laboratory	000485
Nanodrop 2000 spectrophotomer	Thermo Fisher Scientific	ND2000CLAPTOP
Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1)	FisherScientific	BP1752I-400	PCI
Scale with 4 decimals	Mettler Toledo	MS205DU
Skirted 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	AB-0800
Sodium chloride	FisherScientific	15528154	NaCl
Tris Hydrochloride	FisherScientific	BP1757-100
Vortex	Scientific Industries	SI-0236