بناء أقطاب كهربائية دقيقة محلية محتملة المجال للتسجيلات في الجسم الحي من هياكل دماغية متعددة في وقت واحد

Summary

يصف هذا البروتوكول بناء صفائف الأقطاب الكهربائية الدقيقة المصممة خصيصا لتسجيل إمكانات المجال المحلي في الجسم الحي من هياكل دماغية متعددة في وقت واحد.

Abstract

غالبا ما يحتاج الباحثون إلى تسجيل إمكانات المجال المحلي (LFPs) في وقت واحد من العديد من هياكل الدماغ. يتطلب التسجيل من مناطق الدماغ المرغوبة المتعددة تصميمات مختلفة للأقطاب الكهربائية الدقيقة ، ولكن صفائف الأقطاب الكهربائية الدقيقة المتاحة تجاريا غالبا ما لا توفر مثل هذه المرونة. هنا ، يحدد البروتوكول الحالي التصميم المباشر لمصفوفات الأقطاب الكهربائية الدقيقة المصممة خصيصا لتسجيل LFPs من هياكل دماغية متعددة في وقت واحد على أعماق مختلفة. يصف هذا العمل بناء الأقطاب الكهربائية الثنائية القشرية والمخططة والبطنية الجانبية والكهربائية الدقيقة كمثال. يوفر مبدأ التصميم المحدد المرونة ، ويمكن تعديل الأقطاب الكهربائية الدقيقة وتخصيصها لتسجيل LFPs من أي هيكل عن طريق حساب الإحداثيات المجسمة وتغيير البناء بسرعة وفقا لذلك لاستهداف مناطق الدماغ المختلفة في الفئران التي تتحرك بحرية أو تخديرها. يتطلب تجميع microelectrode أدوات ولوازم قياسية. تسمح صفائف الأقطاب الكهربائية الدقيقة المخصصة للمحققين بتصميم صفائف microelectrode بسهولة في أي تكوين لتتبع النشاط العصبي ، مما يوفر تسجيلات LFP بدقة مللي ثانية.

Introduction

إمكانات المجال المحلي (LFPs) هي الإمكانات الكهربائية المسجلة من الفضاء خارج الخلية في الدماغ. يتم إنشاؤها بواسطة اختلالات تركيز الأيونات خارج الخلايا العصبية وتمثل نشاط مجموعة صغيرة وموضعية من الخلايا العصبية ، مما يسمح بمراقبة نشاط منطقة معينة من الدماغ بدقة مقارنة بتسجيلات EEG على نطاق واسع¹. كتقدير ، تتوافق الأقطاب الكهربائية الدقيقة LFP المفصولة ب 1 مم مع مجموعتين مختلفتين تماما من الخلايا العصبية. في حين يتم ترشيح إشارة EEG بواسطة أنسجة المخ والسائل الدماغي الشوكي والجمجمة والعضلات والجلد ، فإن إشارة LFP هي علامة موثوقة للنشاط العصبي المحلي¹.

غالبا ما يحتاج الباحثون إلى تسجيل LFPs في وقت واحد من العديد من هياكل الدماغ ، ولكن صفائف الأقطاب الكهربائية الدقيقة المتاحة تجاريا غالبا ما لا توفر مثل هذه المرونة. هنا ، يصف البروتوكول الحالي الأقطاب الكهربائية الدقيقة القابلة للتخصيص بالكامل وسهلة البناء لتسجيل LFPs في وقت واحد من أي منطقة دماغية مرغوبة على أعماق مختلفة. على الرغم من أن LFPs قد استخدمت على نطاق واسع لتسجيل النشاط العصبي لمنطقة معينة في الدماغ²،³،⁴،⁵،⁶،^7،8،^{9 ،} فإن التصميم الحالي السهل القابل للتخصيص يسمح بتسجيل LFPs من أي مناطق دماغية سطحية أو عميقة متعددة^11,12 . يمكن أيضا تعديل البروتوكول لبناء أي مصفوفة ميكروكترود مرغوبة من خلال تحديد الإحداثيات المجسمة لمناطق الدماغ وتجميع المصفوفة وفقا لذلك. تسمح لنا هذه الأقطاب الكهربائية الدقيقة ذات معدل أخذ العينات 10 كيلو هرتز ومقاومة 60-70 kΩ (طول 2 سم) بتسجيل LFPs بدقة مللي ثانية. يمكن بعد ذلك تضخيم البيانات بواسطة مضخم صوت مكون من 16 قناة ، وتصفيته (تمرير منخفض 1 هرتز ، وتمرير مرتفع 5 كيلو هرتز) ، ورقمنت.

Protocol

تمت الموافقة على هذا العمل من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات بجامعة فرجينيا. تم استخدام C57Bl / 6 فئران من كلا الجنسين (7-12 أسبوعا) للتجارب. تم الحفاظ على الحيوانات في دورة مظلمة مدتها 12 ساعة / 12 ساعة من الضوء وكان لديها إمكانية الوصول إلى الطعام والماء.

1. بناء القطب الدقيق

1. لبناء الأقطاب الكهربائية الدقيقة ، استخدم سلك النيكل والكروم المطلي بالديميل 50 ميكرومتر (انظر جدول المواد). قم بشريط أحد طرفي السلك في الجزء الخلفي من المنصة ولف السلك ثلاث مرات حول أقرب مقبض على المنصة (الشكل 1A ، C).
   ملاحظة: تم استخدام منصة أكريليك مع مقبضين (2 × 5 بوصات) هنا ، ولكن يمكن استخدام أي منصة.
   1. قم بتمديد السلك حول أبعد مقبض ثان لإنشاء حلقتين بين المقابض. لف السلك ثلاث مرات أخرى حول المقبض الأول لإصلاح السلك في مكانه وربط النهاية مرة أخرى في الجزء الخلفي من المنصة.
      ملاحظة: بعد فصل الأسلاك (الخطوات 1.2-1.3.1)، يجب أن يكون هناك سلكان على كل جانب (أربعة أسلاك في المجموع، الشكل 1B).
2. ضع قضبان التوتر تحت الأسلاك مع الشريط ملفوف حولها (الجانب اللزج لأعلى) (الشكل 1C).
   ملاحظة: تم استخدام قطع الأكريليك المثلثة لقضبان التوتر ، مع شريط ملفوف حولها (جانب لزج في الخارج لتوصيل الأسلاك). الجانب اللزج من الشريط خارج قضبان التوتر سيبقي الأسلاك في مكانها لضبط المسافة بينهما. يجب أن تكون قضبان التوتر على بعد ~ 2.5 سم من المقابض ، ويجب ألا تكون الأسلاك فضفاضة.
3. باستخدام المجهر والملقط الناعم ، قم بعمل فجوة 3 مم أو 4.5 مم بين الأسلاك (فجوة 3 مم بين الأسلاك لصنع أقطاب دقيقة قشرية (Ctx) - نواة المهاد البطني الجانبي (VL) ؛ فجوة 4.5 مم لصنع أقطاب دقيقة مخططة (Str) - nigral (SNR) ) (الشكل 1B).
   1. إذا تم استخدام التكبير على المجهر ، فتأكد من حساب وضبط الفرق في التكبير والمسافة الفعلية بين الأسلاك.
      ملاحظة: إذا تم بناء أقطاب كهربائية دقيقة لهياكل أخرى غير تلك المستخدمة هنا ، فيجب ضبط المسافة بين الأسلاك على المسافة المجسمة بين الهياكل. ويقدم الشكل 2 باء مثالا على كيفية تنظيم الأسلاك؛ وفقا لذلك ، يجب تعديل الإحداثيات المجسمة للهياكل الأخرى.
4. قطع أربع قطع صغيرة من البلاستيك (بسماكة 0.5 مم) ~ 6 مم (عرض) × 3 مم (ارتفاع) (الشكل 1C).
   ملاحظة: يمكن استخدام أي قطع بلاستيكية طالما أن سمكها 0.5 مم ؛ هنا ، تم استخدام الأنابيب المربعة التي تم فيها بيع المسامير (دبابيس ، انظر جدول المواد). إذا تم استخدام سمك مختلف ، فيرجى إضافة المزيد أو أقل من قطع البلاستيك لتناسب الإحداثيات المجسمة المطلوبة.
5. ضع الغراء (انظر جدول المواد) على البلاستيك وضعه على الأسلاك (الشكل 1C). ضع القطع البلاستيكية على بعد 1.0 سم تقريبا من منتصف السلك ، وهو على بعد 1.0 سم من شريط التوتر. إزالة الفائض من الغراء الفائق مع قطعة قطن.
6. بعد أن يجف الغراء الفائق ، اقطع الأسلاك باستخدام مقص دقيق ، بالترتيب الموضح في الشكل 1C.
7. قم بقطع أربعة أنابيب زجاجية مقاس 7 مم باستخدام مجموعة متاحة تجاريا (انظر جدول المواد) وأدخل أسلاك القطب الكهربائي في الأنابيب الزجاجية كما هو موضح في الشكل 2A.
   1. أدخل أزواج أقطاب VL و SNR في الأنابيب الزجاجية.
      ملاحظة: يجب إدخال أسلاك الهياكل العميقة فقط في الأنابيب الزجاجية لدعم الزرع الجراحي. تأكد من عدم إدخال أقطاب كهربائية قشرية في الأنبوب الزجاجي.
8. ضع الغراء في قاعدة الأنابيب الزجاجية لتوصيلها بالبلاستيك. انتظر بعض الوقت حتى يجف الغراء.
9. قطع الأنابيب والأسلاك الزجاجية باستخدام مشرط كما هو موضح في الجدول 1 ؛ تأكد من أن أطوال الأقطاب الكهربائية الدقيقة صحيحة. إذا كانت الأقطاب الكهربائية الدقيقة تستهدف هياكل مختلفة ، فاضبط مسافة القطع وفقا للإحداثيات المجسمة المطلوبة.

الشكل 1: مخطط بناء القطب الدقيق . (أ) إعداد الأسلاك على المنصة مع قضبان التوتر أسفل الأسلاك. (ب) الفجوة بين الأسلاك. (ج) يتم لصق أربع قطع من البلاستيك على الأسلاك. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

	سي تي إكس	شارع	في إل	SNR
AP (الأمامي / الخلفي)	2.2	1.2	-1.3	-3.3
ML (الإنسي / الجانبي)	1.8	1.5	1	1.5
DV (الظهرية / البطنية)	0.5	3.5	4	4.75
طول القطب الكهربائي	4	4.75	5.25	6

الجدول 1: إحداثيات وأبعاد الزرع المجسمة للأقطاب الكهربائية الدقيقة.

2. تجميع صفيف القطب الصغير

1. استخدم الغراء لإرفاق البلاستيك بالترتيب المطلوب للمناطق المستهدفة. ويظهر مثال على الأقطاب الكهربائية القشرية والثالاميك والمخططة والنيجيرية في الشكل 2B,C.
   1. ضع زوج القطب الكهربائي Ctx-VL وجها لأسفل (الجانب مع أسلاك القطب الكهربائي يجب أن يكون متجها لأسفل) وقم بتوصيل قطعتين فارغتين من البلاستيك مقاس 6 مم × 3 مم في الأعلى بالغراء.
   2. فوق القطع الثلاث من البلاستيك ، ضع زوج القطب الكهربائي Ctx-VL الثاني مع الأقطاب الكهربائية المتجهة لأعلى (استخدم المجهر وتأكد من محاذاة أقطاب VL).
      ملاحظة: تعد محاذاة الأقطاب الكهربائية الثنائية (هنا ، محاذاة أقطاب VL اليسرى واليمنى) ضرورية لاستهداف الهياكل الثنائية المطلوبة بشكل مناسب.
   3. استخدم الغراء لتوصيل أقطاب SNR في الأعلى مع أقطاب SNR الكهربائية على بعد 2.0 مم من أقطاب VL و ~ 5.0 مم بعيدا عن الأقطاب الكهربائية القشرية (يجب أن تواجه أسلاك قطب SNR لأعلى).
   4. كرر الخطوة 2.1.3. للجانب الآخر (يجب أن تواجه أسلاك القطب SNR خارج صفيف القطب الدقيق).
2. ضع راتنجات الايبوكسي حول البلاستيك لربط الأقطاب الكهربائية معا. تجنب وضع راتنجات الايبوكسي على الأقطاب الكهربائية.
3. خذ سلك سميك واصنع حلقة على طرف واحد. اغمس الحلقة في محلول الإيبوكسي وضعها على البلاستيك ، مما يضمن أن السلك السميك مستلقيا بشكل مسطح (الشكل 2D) بحيث يمكن استخدام هذا السلك كمقبض للخطوات التالية. انتظر حتى تجف الأقطاب الكهربائية تماما.
4. قطع الأسلاك إلى 2 سم ، كما هو موضح في الشكل 2E.

الشكل 2: بناء القطب الدقيق وأبعاده. (أ) أربعة أزواج من الأقطاب الكهربائية التي تشكلت بعد قطع الأسلاك بالمقص ، كما هو موضح في الشكل 1C (زوجان من أقطاب Ctx-VL وزوجان من أقطاب Str-SNR). أدخل أقطاب كهربائية عميقة البنية (VL و SNR) في الأنابيب الزجاجية وقم بلصق قواعدها بالبلاستيك (النقاط الحمراء). (B) المنظر العلوي: يتم لصق أزواج القطب الكهربائي من (A) في كومة لإنشاء قلب القطب الدقيق. تشير الخطوط الحمراء إلى خطوط الغراء. (ج) منظر جانبي أمامي للرقم (ب). (د) تم توصيل السلك السميك بالأقطاب الكهربائية الدقيقة. (ه) يتم تجميع الأسلاك كما هو موضح ، ويتم كشط الأطراف المعزولة وتقطيعها إلى 2 سم.

3. اتصال Microelectrode بسماعة الرأس

1. قم بتجميع الأسلاك كما هو موضح في الشكل 2E وكشط 1 مم من الأطراف المعزولة بمشرط.
2. ثني الأقطاب الكهربائية القشرية كما هو موضح في الشكل 3A. افصل الأسلاك كما هو موضح في الشكل 3B. باستخدام ملقط ناعم ، قم بعمل حلقة في نهاية كل سلك (الشكل 3B).
3. أمسك سماعة رأس ذات 10 سنون مع مرقئ (انظر جدول المواد) واستخدم الطرف الخشبي لقطعة قطن لتطبيق الحد الأدنى من التدفق على المسامير (الشكل 3C). تأكد من عدم وضع التدفق خارج المسامير لمنع ماس كهربائى بين الدبابيس.
4. باستخدام النهاية الخشبية لقطعة قطن ، ضع التدفق على حلقات الأسلاك.
5. قم بلحام حلقات السلك بسماعة الرأس ذات 10 سنون كما هو موضح في الشكل 3C. بعد اللحام ، جفف سماعة الرأس لمنع حدوث ماس كهربائى بين المسامير.
6. خذ سلكا رفيعا (0.005-0.008 بوصة) للإشارة والأسلاك الأرضية وقم بتجريد البلاستيك من طرف واحد. قم بعمل حلقة على الطرف الآخر من السلك.
7. لحام الجانب المجرد من المرجع والأسلاك الأرضية إلى دبابيس كل منها (الشكل 3A ، C).
8. عند الإمساك بالسلك السميك (الشكل 2D) ، ضع أسمنت رأب القحف حول الأقطاب الكهربائية الدقيقة ، خاصة عندما تتصل الأسلاك بالمسامير. تجنب لمس القطب الكهربائي الفعلي مع الأسمنت.
9. بعد أن يجف الأسمنت ، ضع راتنجات الإيبوكسي في قاعدة الأنابيب الزجاجية ، وأسلاك القطب الدقيق المخططة ، والقطب بأكمله. تجنب لمس القطب الكهربائي الفعلي مع راتنجات الايبوكسي. انتظر حتى تجف الأقطاب الكهربائية تماما.
10. الأقطاب الكهربائية جاهزة. حفر ثقوب في جمجمة الماوس (وفقا للإحداثيات المجسمة المطلوبة) باستخدام مثقاب الأسنان وزرع سماعة الرأس كما هو موضح في الشكل 3D عن طريق خفض سماعة الرأس مع الأقطاب الكهربائية الدقيقة التي تواجه الجمجمة والثقوب المناسبة. يمكن توصيل سماعة الرأس بالذراع المجسمة للحصول على الدعم أثناء الزرع.

الشكل 3: زرع القطب الدقيق . (أ) يتم ثني الأقطاب الكهربائية القشرية كما هو موضح. (ب) يتم فصل الأسلاك لإنشاء حلقات في النهايات. (ج) يتم لحام التدفق (عند النقاط الحمراء) والأسلاك الحلقية بسماعة الرأس ذات ال 10 سنون، مما يضمن انتقال كل سلك إلى الدبوس المناسب له. (د) يتم زرع سماعة الرأس لتسجيل LFPs. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. وضع علامة على موقع القطب الكهربائي بعد التسجيلات

1. في نهاية تسجيلات LFP ، تأكد من الموضع الصحيح للأقطاب الكهربائية في المنطقة المستهدفة عن طريق تطبيق تيار على أطراف القطب الكهربائي لعمل آفة والانتظار لمدة 30 دقيقة قبل اختراق الماوس.
   ملاحظة: إعدادات الآفة لتأكيد موقع أطراف القطب الكهربائي: انفجار واحد، 40 ميكروأمبير، 0.75 مللي ثانية نبضة موجة مربعة أحادية الطور، 50 هرتز، 30 ثانية.
2. تخدير الفئران مع الايزوفلوران (حتى نام الفأر) و perfuse¹⁰ عبر القلب مع 4 ٪ paraformaldehyde (PFA) في 0.1 M فوسفات الصوديوم العازلة. قسم الأدمغة (بسماكة 40 ميكرومتر) على كريوستات (انظر جدول المواد) ووصمة عار مع DAPI (0.02٪ في PBS). تأكد من الموقع الصحيح للأقطاب الكهربائية من خلال وجود آفات طرف القطب الكهربائي كما هو موضح في الشكل 4B ، C.
   ملاحظة: يجب تطبيق النسبة المئوية للإيسوفلوران باتباع المبادئ التوجيهية لكل مؤسسة على حدة.

5. قياس مقاومة القطب الكهربائي

1. قم بقياس مقاومة الأقطاب الكهربائية وتحقق من الدائرة القصيرة بين الأقطاب الكهربائية باستخدام مقياس متعدد النطاقات (انظر جدول المواد). اضبط مقياس المقاومة على R × 10000 ، مما يشير إلى أن انحراف الوحدة في المؤشر يتوافق مع مقاومة 1 kΩ. تحتاج الأقطاب الكهربائية التي يبلغ طولها 2 سم إلى مقاومة 60-70 kΩ.
2. قم بتخصيص سماعة الرأس عن طريق أخذ عشرة دبابيس فردية (انظر جدول المواد). لحام كل دبوس بسلك نحاسي رفيع متعدد الخيوط في كابل.
   1. اضغط على الدبابيس الملحومة مع ذيول الكابلات المقابلة لها في مقبس التزاوج ذي الصف المزدوج المكون من 10 سنون (المقابس المطابقة). اضغط على المسامير المفتوحة لمقبس التزاوج في سماعة الرأس LFP. وبهذه الطريقة ، يحتوي كل قطب LFP على سلك كابل معين في التجميع.
3. اغمس طرف كل قطب LFP (الذي يجب قياس مقاومته) في محلول ملحي كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪ (تركيز كلوريد الصوديوم في الدم). قم بتوصيل طرف سلك الكابل الذي يتوافق مع قطب LFP بالطرف الموجب للأومتر.
   1. استخدم سلك منخفض المقاومة (̴100 Ω) مع جانب واحد في المياه المالحة والجانب الآخر كنهاية مفتوحة. قم بتوصيل الطرف المفتوح للسلك منخفض المقاومة بأرض مؤشر الأومتر.
      ملاحظة: يكمل هذا الترتيب الدائرة ويدفع إلى انحراف مؤشر الأومتر.
4. تأكد من عدم وجود اتصال كهربائي بين أي قطبين كهربائيين على سماعة الرأس. تحقق من العزل الكهربائي لأقطاب LFP الزوجية (الأرض: كابل واحد يتوافق مع قطب كهربائي واحد ؛ موجب: كابل آخر يتوافق مع قطب آخر). تخلص من الأقطاب الكهربائية إذا لوحظ أي انحراف في هذه الحالة.

النتائج

في هذا العمل ، تم استخدام الأقطاب الكهربائية الدقيقة LFP لرسم خريطة للنوبة المنتشرة عبر العقد القاعدية¹¹. تم إجراء تسجيلات LFP المتزامنة من القشرة المخية اليمنى قبل الحركية (حيث كان تركيز النوبة) و VL الأيسر والمخطط و SNR (الشكل 4). تم تحديد بداية النوبة على أنها انحرا...

Discussion

تاريخيا ، تم استخدام صفائف الأقطاب الكهربائية الدقيقة على نطاق واسع لتسجيل النشاط العصبي من منطقة معينة في الدماغ ذات أهمية²،³،⁴،⁵،⁶،^7،8،^9،

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplifier 16-Channel	A-M Systems	Model 3600	Amplifier
Cranioplasty cement	Coltene	Perm Reeline/Repair Resin Type II Class I Shade - Clear	Cement to hold microelectrodes
Cryostat Microtome	Precisionary	CF-6100	To slice brain
Diamel-coatednickel-chromium wire	Johnson Matthey Inc.	50 µm	Microelectrode wire
Dremel	Dremel	300 Series	To drill holes in mouse skull
Epoxy	CEC Corp	C-POXY 5	Fast setting adhesive
Hemostat	Any		To hold the headset
Forceps	Any		To hold microelectrodes
Light microscope	Nikon	SMZ-10	To see alignment
Ohmmeter	Any		To measurre resistance
Pins (Headers and matching Sockets)	Mill-Max	Interconnects, 833 series, 2 mm grid gull wing surface mount headers and sockets	To attach microelectrodes to
Polymicro Tubing Kit	Neuralynx	ID 100 ± 04 µm, OD 164 ± 06 µm, coating thickness 12 µm	Glass tubes
Pulse Stimulator	A-M Systems	Model 2100	To mark the microelectrode location at the end of the recordings
Scissors	Any		To cut microelectrodes
Superglue	Gorilla		Adhesive
Thick wire 0.008 in. – 0.011 in.	A-M Systems	791900	Tick wire to hold the microelectrode array
Thin wire 0.005 in. - 0.008 in.	A-M Systems	791400	Thin wire for reference and ground