构建局部场势微电极，用于同时从多个脑结构 进行体内 记录

摘要

本方案描述了定制微电极阵列的构建，以同时记录来自多个大脑结构 的体内 局部场电位。

摘要

研究人员通常需要同时记录来自几种大脑结构的局部场电位（LFP）。从多个所需的大脑区域进行记录需要不同的微电极设计，但市售的微电极阵列通常不提供这种灵活性。在这里，本协议概述了定制微电极阵列的简单设计，以在不同深度同时记录来自多个大脑结构的LFP。这项工作描述了双侧皮质，纹状体，腹外侧丘脑和黑质微电极的构造作为示例。概述的设计原理提供了灵活性，微电极可以通过计算立体定位坐标并相应地快速更改结构以针对自由移动或麻醉小鼠中的不同大脑区域进行修改和定制，以记录任何结构中的LFP。微电极组件需要标准工具和耗材。这些定制的微电极阵列使研究人员能够轻松设计任何配置的微电极阵列来跟踪神经元活动，从而提供毫秒级分辨率的LFP记录。

引言

局部场电位（LFP）是从大脑细胞外空间记录的电势。它们由神经元外部的离子浓度失衡产生，代表一小群局部神经元的活动，与宏观尺度的脑电图记录相比，可以精确地监测特定大脑区域的活动¹。据估计，相隔1毫米的LFP微电极对应于两个完全不同的神经元群体。脑电图信号由脑组织、脑脊液、颅骨、肌肉和皮肤过滤，而LFP信号是局部神经元活动的可靠标志物¹。

研究人员通常需要同时记录来自几种大脑结构的LFP，但市售的微电极阵列通常不提供这种灵活性。在这里，本方案描述了完全可定制，易于构建的微电极，以同时记录来自不同深度的任何所需大脑区域的LFP。虽然LFPs已被广泛用于记录特定大脑区域^2，3，⁴，^{5，6，7，8，9}的神经元活动，但当前易于定制的设计允许记录来自任何多个浅表或深部大脑区域的LFP^11，12.还可以修改该协议，通过确定大脑区域的立体定位坐标并相应地组装阵列来构建任何所需的微电极阵列。这些微电极具有10 kHz采样率和60-70 kΩ电阻（2 cm长度），使我们能够以毫秒级精度记录LFP。然后，数据可以通过16通道放大器放大，滤波（低通1 Hz，高通5 kHz）并数字化。

研究方案

本工作已获得弗吉尼亚大学动物护理和使用委员会的批准。C57Bl / 6两性小鼠（7-12周）用于实验。这些动物保持在12小时光照/ 12小时黑暗循环中，并 可以随意 获得食物和水。

1. 微电极结构

1. 要构建微电极，请使用50μm（直径）的透镜涂层镍铬丝（见 材料表）。在平台背面用胶带将电线的一端缠绕在平台上最近的旋钮上三次（图1A，C）。
   注意:这里使用了带有两个旋钮（2 x 5英寸）的亚克力平台，但可以使用任何平台。
   1. 将导线拉伸到最远的第二个旋钮周围，在旋钮之间形成两个环。将导线在第一个旋钮上再缠绕三次，以将导线固定到位，并在平台背面再次用胶带将电线末端缠绕。
      注:电线分离后（步骤1.2-1.3.1），每侧必须有两根电线（总共四根电线， 图1B）。
2. 将张力条放在电线下方，并用胶带缠绕在电线上（粘性面朝上）（图1C）。
   注意:三角形丙烯酸片用于张力棒，周围缠绕有胶带（粘性侧在外面以连接电线）。张力条外胶带的粘性一面将保持电线就位，以调整它们之间的距离。张力杆必须与旋钮保持约2.5厘米的距离，并且电线不得松动。
3. 使用显微镜和细镊子，在导线之间形成3毫米或4.5毫米的间隙（在导线之间形成3毫米的间隙以制造皮质（Ctx） - 腹外侧丘脑核（VL）微电极; 4.5毫米的间隙以制造纹状体（Str） - 黑质（SNR）微电极）（图1B）。
   1. 如果在显微镜上使用放大倍率，请确保计算并调整放大倍率的差异和导线之间的实际距离。
      注意:如果微电极是为此处使用的结构以外的结构构建的，则需要将导线之间的距离调整为结构之间的立体定位距离。 图2B 提供了如何组织导线的示例;因此，必须调整其他结构的立体定位坐标。
4. 切割四小块塑料（0.5毫米厚）〜6毫米（宽）x 3毫米（高）（图1C）。
   注意:任何塑料件只要厚度为0.5毫米，就可以使用;在这里，使用了出售销钉的方形管（销钉，见 材料表）。如果使用不同的厚度，请添加更多或更少的塑料片以适合所需的立体定位坐标。
5. 在塑料上涂上胶水（参见 材料表）并将其放在电线上（图1C）。将塑料块放在距离钢丝中间约1.0厘米的地方，距离张力棒1.0厘米。用棉签去除多余的超级胶水。
6. 超级胶水干燥后，用细剪刀切割电线，按 图1C所示的顺序。
7. 使用市售套件切割四个7 mm玻璃管（参见 材料表），并将电极线插入玻璃管中，如图 2A所示。
   1. 将VL和SNR电极对插入玻璃管中。
      注意:只有用于深层结构的导线需要插入玻璃管以支持手术植入。确保不要将皮质电极插入玻璃管。
8. 将胶水放在玻璃管的底部，将它们连接到塑料上。等待一段时间，直到胶水变干。
9. 使用手术刀切割玻璃管和电线，如 表1所示;确保微电极的长度是正确的。如果微电极针对不同的结构，请根据所需的立体定位坐标调整切割距离。

图 1:微电极结构示意图。 （A） 在平台上设置电线，电线下方有张力条。（B）导线之间的间隙。（C）将四块塑料粘在电线上。 请点击此处查看此图的大图。

	断续器	Str	断续器	信 噪 比
AP（前/后）	2.2	1.2	-1.3	-3.3
ML（内侧/外侧）	1.8	1.5	1	1.5
DV（背侧/腹侧）	0.5	3.5	4	4.75
电极长度	4	4.75	5.25	6

表1:立体定位植入微电极的坐标和尺寸。

2. 微电极阵列组装

1. 使用胶水按目标区域的所需顺序粘附塑料。皮质、丘脑、纹状体和黑粒电极的示例如图 2B，C所示。
   1. 将Ctx-VL电极对面朝下放置（电极丝的一侧必须面朝下），并用胶水将两个6 mm x 3 mm的空塑料片连接在上面。
   2. 在三块塑料的顶部，放置第二个Ctx-VL电极对，电极朝上（使用显微镜并确保VL电极对齐）。
      注意:双侧电极的对准（此处为左右VL电极的对准）对于适当地定位所需的双边结构至关重要。
   3. 使用胶水将SNR电极连接到顶部，SNR电极距离VL电极2.0 mm，距离皮质电极约5.0 mm（SNR电极线必须朝上）。
   4. 重复步骤 2.1.3。对于另一侧（SNR电极线必须面向微电极阵列的外部）。
2. 在塑料周围涂上环氧树脂，将电极粘合在一起。避免在电极上放置环氧树脂。
3. 取一根粗线，在一端做一个环。将环浸入环氧溶液中并将其放在塑料上，确保粗线平放（图2D），以便在接下来的步骤中，该线可以用作手柄。等到电极完全干燥。
4. 将电线切割成2厘米，如图 2E所示。

（A）用剪刀切割导线后形成的四对电极，如图1C所示（2对Ctx-VL电极和2对Str-SNR电极）。将深层结构电极（VL和SNR）插入玻璃管中，并将其底座粘合到塑料（红点）上。（B）顶视图:将（A）的电极对粘合成堆叠以形成微电极芯。红线表示胶水线。（C） （B） 正面视图。（D）将粗线连接到微电极上。（E）电线按指示分组，隔离的末端被刮掉并切成2厘米。

3. 微电极与耳机的连接

1. 如图 2E 所示对电线进行分组，并用手术刀刮掉1 mm的隔离端。
2. 弯曲皮质电极，如图 3A所示。分离导线，如图 3B所示。使用精细的镊子，在每根导线的末端做一个环（图3B）。
3. 用止血器握住 10 针耳机（参见 材料表），并使用棉签的木端在针脚上施加最少量的助焊剂（图 3C）。确保不要将磁通量放在引脚外，以防止引脚之间短路。
4. 使用棉签的木端，将助焊剂涂在线环上。
5. 将导线环路焊接到 10 针耳机，如图 3C 所示。焊接后，干燥耳机以防止引脚之间短路。
6. 取一根细线（0.005-0.008英寸）作为参考线和地线，并从一端剥离塑料。在导线的另一端做一个循环。
7. 将基准电压源和地线的剥离侧焊接到各自的引脚上（图3A，C）。
8. 保持粗线（图2D），在微电极周围涂上颅骨成形水泥，特别是在电线连接到引脚的地方。避免将实际的电极末端与水泥接触。
9. 水泥干燥后，将环氧树脂放在玻璃管的底部，纹状体微电极丝和整个电极上。避免用环氧树脂接触实际的电极末端。等到电极完全干燥。
10. 电极已准备就绪。使用牙钻在小鼠的头骨上钻孔（根据所需的立体定位坐标），并通过降低头戴式耳机，将头戴式耳机朝向颅骨和适当的孔，如图 3D 所示。耳机可以连接到立体定位臂上，以便在植入过程中提供支撑。

图3:微电极植入。 （A）皮质电极按指示弯曲。（B）将导线分开，在两端形成环路。（C） 将助焊剂（红点处）和环形导线焊接到 10 针头戴式设备上，确保每根导线都连接到其适当的引脚。（D） 植入耳机以记录 LFP。 请点击此处查看此图的放大版本。

4. 记录后标记电极位置

1. 在LFP记录结束时，通过在电极尖端施加电流以产生病变并等待30分钟以灌注小鼠来确认电极在目标区域中的正确位置。
   注:用于确认电极尖端位置的病变设置:单脉冲，40 μA，0.75 ms 单相方波脉冲，50 Hz，30 s。
2. 用异氟醚麻醉小鼠（直到小鼠入睡），并在^0.1M磷酸钠缓冲液中用4%多聚甲醛（PFA）经心灌注10。在低温恒温器上切开大脑（40μm厚）（参见 材料表）并用DAPI染色（PBS中为0.02%）。通过电极尖端病变的存在来确认电极的正确位置，如图 4B，C所示。
   注意:异氟醚的百分比需要按照各个机构的指导方针进行应用。

5. 测量电极电阻

1. 测量电极的电阻，并使用多量程欧姆表检查电极之间的短路（参见 材料表）。将电阻刻度设置为R x 10，000，表示指针中的单位偏转对应于1 kΩ电阻。2 cm长的电极需要具有60-70 kΩ的电阻。
2. 通过取十个单独的引脚来定制头戴式耳机（请参见 材料表）。在电缆中用一根细的多股铜线焊接每个引脚。
   1. 将焊接引脚及其相应的电缆尾部压入 10 引脚双排配接插座（匹配插座）。将配接插座的开放式针脚按压到 LFP 头戴式耳机中。通过这种方式，每个LFP电极在组件中都有一个指定的电缆线。
3. 将每个LFP电极的尖端（其电阻待测）浸入0.9%NaCl盐水溶液（血液中的NaCl浓度）中。将与LFP电极对应的电缆线端连接到欧姆表的正端。
   1. 使用低电阻（̴100 Ω）电线，一面在盐水中，另一面作为开口端。将低电阻导线的开口端连接到欧姆表指针的接地。
      注:此排列完成电路并提示欧姆表指针偏转。
4. 确保头戴式设备上的任何两个电极之间没有电气连接。检查成对LFP电极的电气绝缘（接地:一根电缆对应于一个电极;正:另一根电缆对应于另一个电极）。在这种情况下，如果观察到任何偏转，请丢弃电极。

结果

在这项工作中，LFP微电极用于绘制通过基底神经节¹¹扩散的癫痫发作。从右侧运动前皮层（癫痫发作焦点所在）和左侧VL，纹状体和SNR同时进行LFP记录（图4）。癫痫发作开始被确定为电压迹线的偏转至少是基线的两倍（图4A，红色箭头）。功率谱图¹¹显示了记录的LFP的频率分布（图4A）。可以以?...

讨论

从历史上看，微电极阵列已被广泛用于记录来自感兴趣的特定大脑区域^2，3，⁴，^{5，6，7，8，9，13}的神经元活动。但是，我们简单的微电极设计允许同时从多个结构记录

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplifier 16-Channel	A-M Systems	Model 3600	Amplifier
Cranioplasty cement	Coltene	Perm Reeline/Repair Resin Type II Class I Shade - Clear	Cement to hold microelectrodes
Cryostat Microtome	Precisionary	CF-6100	To slice brain
Diamel-coatednickel-chromium wire	Johnson Matthey Inc.	50 µm	Microelectrode wire
Dremel	Dremel	300 Series	To drill holes in mouse skull
Epoxy	CEC Corp	C-POXY 5	Fast setting adhesive
Hemostat	Any		To hold the headset
Forceps	Any		To hold microelectrodes
Light microscope	Nikon	SMZ-10	To see alignment
Ohmmeter	Any		To measurre resistance
Pins (Headers and matching Sockets)	Mill-Max	Interconnects, 833 series, 2 mm grid gull wing surface mount headers and sockets	To attach microelectrodes to
Polymicro Tubing Kit	Neuralynx	ID 100 ± 04 µm, OD 164 ± 06 µm, coating thickness 12 µm	Glass tubes
Pulse Stimulator	A-M Systems	Model 2100	To mark the microelectrode location at the end of the recordings
Scissors	Any		To cut microelectrodes
Superglue	Gorilla		Adhesive
Thick wire 0.008 in. – 0.011 in.	A-M Systems	791900	Tick wire to hold the microelectrode array
Thin wire 0.005 in. - 0.008 in.	A-M Systems	791400	Thin wire for reference and ground