الكشف عن الديناميكيات الخفية للهياكل الضوئية الطبيعية باستخدام التصوير المجسم

Summary

تركز الورقة في المقام الأول على القوة المشتركة للطرق البصرية (الخطية وغير الخطية) والثلاثية الأبعاد المستخدمة للكشف عن الظواهر على المستوى النانوي. يتم إعطاء النتائج التي تم الحصول عليها من دراسات التفاعلات الكيميائية البيوفوتونية والمتذبذبة كأمثلة تمثيلية ، مما يسلط الضوء على قدرة التصوير المجسم على الكشف عن الديناميكيات على نطاق نانوي.

Abstract

في هذه الطريقة ، يتم استغلال إمكانات البصريات والتصوير المجسم للكشف عن التفاصيل الخفية للاستجابة الديناميكية للنظام الطبيعي على نطاق النانو. في الجزء الأول ، يتم تقديم الدراسات البصرية والثلاثية الأبعاد للهياكل الضوئية الطبيعية بالإضافة إلى شروط ظهور التأثير الضوئي ، أي إزاحة أو تشوه بنية نانوية بسبب تدرج حراري يسببه الضوء ، على مقياس النانو. يتم الكشف عن هذا التأثير من خلال قياس التداخل الرقمي المجسم في الوقت الفعلي الذي يراقب تشوه المقاييس التي تغطي أجنحة الحشرات الناجمة عن درجة الحرارة. يتم إثبات وتأكيد العلاقة بين الهندسة والتموج النانوي الذي يؤدي إلى ظهور التأثير الضوئي تجريبيا. في الجزء الثاني ، يظهر كيف يمكن استخدام التصوير المجسم للكشف عن التفاصيل الخفية في النظام الكيميائي ذات الديناميكيات غير الخطية ، مثل ظاهرة انتقال الطور التي تحدث في تفاعل Briggs-Rauscher (BR) المتذبذب المعقد. ويمكن للإمكانات المعروضة للتصوير المجسم على المستوى النانوي أن تفتح إمكانيات هائلة للتحكم في التأثير الضوئي وتشكيل الأنماط وتشكيلها لمختلف التطبيقات مثل احتجاز الجسيمات ورفعها، بما في ذلك حركة الهيدروكربونات غير المحترقة في الغلاف الجوي وفصل الهباء الجوي المختلف، وتحلل اللدائن الدقيقة وتجزئة الجسيمات بشكل عام، وتقييم درجة الحرارة والتوصيل الحراري لجزيئات الوقود بحجم ميكرون.

Introduction

لفهم وملاحظة جميع الظواهر الفريدة في عالم النانو بشكل كامل ، من الأهمية بمكان استخدام تقنيات قادرة على الكشف عن جميع التفاصيل المتعلقة بالهياكل والديناميات على نطاق النانو. على هذا الحساب ، يتم تقديم مزيج فريد من الطرق الخطية وغير الخطية ، جنبا إلى جنب مع قوة التصوير المجسم للكشف عن ديناميكيات النظام على نطاق النانو.

يمكن النظر إلى التقنية الثلاثية الأبعاد الموصوفة على أنها طريقة التسجيل الثلاثي (rec هو اختصار للتسجيل) ، لأنه في وقت معين يتم تسجيل الإشارة في وقت واحد بواسطة كاميرا فوتوغرافية وكاميرا حرارية ومقياس تداخل. يعد التحليل الطيفي البصري الخطي وغير الخطي والتصوير المجسم من التقنيات المعروفة جيدا ، والتي يتم وصف مبادئها الأساسية على نطاق واسع في الأدبيات ^1,2.

لاختصار قصة طويلة ، يسمح قياس التداخل الثلاثي الأبعاد بمقارنة الجبهات الموجية المسجلة في لحظات مختلفة من الوقت لتوصيف ديناميكيات النظام. كان يستخدم سابقا لقياس ديناميكيات الاهتزاز ^3,4. تعتمد قوة التصوير المجسم كأبسط طريقة لقياس التداخل على قدرته على اكتشاف أصغر إزاحة داخل النظام. أولا، استغلنا التصوير المجسم لمراقبة وكشف التأثير الضوئي⁵ (أي إزاحة تشوه بنية نانوية بسبب تدرج حراري يسببه الضوء)، في هياكل بيولوجية مختلفة. وللحصول على عرض حقيقي للطريقة، تم اختيار عينات تمثيلية من عدد من العينات البيولوجية المختبرة⁶. أجنحة فراشة ملكة إسبانيا ، إيسوريا لاثونيا (لينيوس ، 1758; I. lathonia)، استخدمت في إطار هذه الدراسة.

بعد أن أثبتت بنجاح حدوث الرحلان الضوئي على المستوى النانوي في الأنسجة البيولوجية ، تم تطبيق بروتوكول مماثل لمراقبة عملية كسر التماثل التلقائي⁷ الناجمة عن انتقال الطور في تفاعل كيميائي متذبذب. في هذا الجزء ، تمت دراسة انتقال الطور من تركيز منخفض من اليوديد واليود (يسمى الحالة الأولى) إلى تركيز عال من اليوديد واليود مع تكوين اليود الصلب (يعرف باسم الحالة II) الذي يحدث في تفاعل BR غير الخطي كيميائيا ^8,9. هنا ، أبلغنا لأول مرة عن نهج ثلاثي الأبعاد يسمح بدراسة مثل هذا الانتقال المرحلي وديناميكيات كسر التماثل التلقائي على مقياس النانو الذي يحدث في الأنظمة المكثفة.

Protocol

1. التوصيف المسبق

1. قم بإجراء توصيف مسبق كامل للعينة.
   1. إجراء جميع التجارب على العينات الجافة المشتراة من مصدر تجاري. تخزين العينات في المختبر، في مكان جاف ومظلم، في درجة حرارة الغرفة.
   2. قبل القياسات ثلاثية الأبعاد، قم بإجراء توصيف كامل للعينة عن طريق المجهر الإلكتروني الماسح (SEM)، والتحليل الطيفي البصري الخطي، والمجهر الضوئي غير الخطي (NOM)¹⁰ (الشكل 1).
   3. بالإضافة إلى الخصائص البصرية للعينات التي تقاس بواسطة التقنيات الخطية ، قم بجمع معلومات تكميلية مع حزم ليزر عالية الكثافة تسمح بتوصيف خصائصها البصرية غير الخطية.
   4. استخدم الحساسيات البصرية غير الخطية المقابلة لتحديد الاستجابة البصرية غير الخطية وتشكيل أساس التقنيات البصرية غير الخطية مثل تألق الإثارة متعدد الفوتونات غير المدمر والجيل التوافقي الثاني (SHG) ، والتي تستخدم لتوصيف العينات البيولوجية المختلفة.
   5. بالنسبة للظواهر الكيميائية غير الخطية التي تحدث في تفاعل BR المتذبذب، قم بإجراء دراسة للرصد التداخل لانتقال الطور في الموقع من الحالة الأولى إلى الحالة الثانية مع التركيزات التالية من المواد المتفاعلة: [CH 2(COOH)₂]0 = 0.0789 mol dm-3، [MnSO 4]0 = 0.0075 mol dm-3، [HClO₄]0 = _0.03 mol ^dm-3، [كيو₃] 0 = 0.0752 mol ^dm-3 ، و [H 2 O₂]0= 1.269 mol ^dm-3 (₀ بعد القوس يرمز إلى التركيز الأولي في بداية العملية). اجعل الحجم الإجمالي المستخدم لتفاعل BR يساوي 2.5 مل.
      ملاحظة: قيم التركيز المستخدمة هنا تساوي تلك الموجودة في الدراسة التي أجراها Pagnacco et ^al.8 ، ولكن مع حجم التفاعل مقسوما على 10.
2. قم بإعداد العينة للتجربة.
   1. استخدم أجنحة الفراشة الفريتيلية ملكة إسبانيا ، I. lathonia ، لهذه التجربة. ضع الجناح على سطح صلب واصنع قسما بقاطع قطره 10 مم. ضع العينة في صندوق العينة ، والذي يمكن أن يكون أي حاوية ذات غطاء.

الشكل 1: مقطع عرضي متموج من مقياس جناح الفراشة. تم تسجيل المقطع العرضي على مجهر ضوئي غير خطي (A,B). كما تم إجراء مراقبة SEM (C) لجناح من فراشة ملكة إسبانيا ، I. lathonia. وقد عدل هذا الرقم من¹⁴. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. الإعداد التجريبي

1. الإعداد المجسم
   ملاحظة: تم إجراء قياسات قياس التداخل الثلاثي الأبعاد باستخدام إعداد بصري مصمم خصيصا (الشكل 2).
   1. اضبط درجة حرارة المختبر لتكون 23 درجة مئوية ± 0.2 درجة مئوية. قم بتشغيل الليزر. استخدم ليزر (التفاصيل الواردة في جدول المواد) بطول موجي مثير يبلغ 532 نانومتر لهذه الملاحظات المجسمة.
   2. تحقق من محاذاة العناصر البصرية (الشكل 2). أولا ، تحقق من أن الإعداد يتم وفقا للمخطط في الشكل 2.
   3. قم بمحاذاة شعاع الليزر بشكل مثالي مع المرآة المقعرة M. تحقق واضبط موضع موسع الشعاع البصري (L).
   4. حدد جزء الشعاع الذي يصطدم بالعينة S وتأكد من أنه يشكل شعاعا منعكسا O. تحقق مما إذا كان يتم جمع بقية الشعاع على مرآة كروية CM ، لاستخدامها في توليد الشعاع المرجعي R. تحقق مما إذا كان الكاشف C قد تم وضعه داخل منطقة التداخل بين الحزمتين المحددتين.
      ملاحظة: يتم استخدام مستشعر أشباه الموصلات التكميلي لأكسيد المعادن (CMOS) ككاشف.
   5. قم بإعداد الكاميرات وفقا لتعليمات الكاميرا المستخدمة. قم بإعداد كاميرا بصرية / فوتوغرافية للتجربة ثلاثية الأبعاد كما هو موضح في الشكل 2 (C هي الكاميرا ؛ التفاصيل الواردة في جدول المواد). قم بإعداد كاميرا بصرية/فوتوغرافية ثانية لعرض التغيرات المرئية في تفاعل BR وكاميرا حرارية بدقة حرارية تبلغ 50 مللي كلفن وبعد بؤري يبلغ 13 مم فوق الطاولة البصرية.
      ملاحظة: الكاميرا المستخدمة في التجربة الثلاثية الأبعاد لا تستخدم عدسة موضوعية. الضوء يصطدم مباشرة على الشريحة.
2. قم بإعداد العينة في إعداد ثلاثي الأبعاد.
   1. قم بإعداد عينة الجناح كما في الخطوة 1.2.1. ضع العينة المحضرة على دعامة معدنية مستديرة يبلغ قطرها 15 مم. يحتوي الدعامة على ثلاثة ثقوب موجودة للمسامير التي تعلق عليها الحلقة المعدنية التي تحمل العينة.
   2. قم بتوصيل الحلقة بالدعم. ضع العينة المرفقة في جزء حامل العينة الموجود على الطاولة البصرية.
   3. إعداد العينة لرصد التفاعلات الكيميائية. على الطاولة البصرية ، في المكان المقصود ، ضع دعامة بسطح لاصق مسطح يتم وضع الكوفيت / الوعاء عليه.
   4. قم بإعداد الكاشف المستخدم لتهيئة التفاعل كما في الخطوة 1.1.5. املأ المواد المتفاعلة في الكوفيت ، واخلطها في كوفيت بالترتيب التالي للأحجام والتركيزات: 0.7 مل من 0.2817 مول ^dm-3 CH 2 (COOH)₂ ؛ 0.5 مل من 0.0375 مول ^dm-3 MnSO₄ ؛ 0.5 مل من 0.15 مول ^dm-3 HClO₄ ؛ 0.5 مل من 0.376 مول ^dm-3 KIO₃ ؛ و 0.3 مل من 10.575 مول ^dm-3 H 2 O₂.
   5. تأكد من أن إجمالي حجم الصوت في cuvette هو 2.5 مل ، وضعه على الدعم في الإعداد.
   6. قم بإعداد أدوات إضافية إذا لزم الأمر. لمراقبة التأثير الضوئي ، استخدم ليزر إضافي (التفاصيل الواردة في جدول المواد) للتدفئة المحلية.

الشكل 2: الإعداد المجسم. يوضح الشكل كيف يتم ترتيب المكونات المختلفة للتجربة ثلاثية الأبعاد. الاختصارات: L1 = ليزر عند 532 نانومتر ، L = عدسة محدبة ، A = فتحة ، M = مرآة مسطحة تستخدم لتحويل شعاع الليزر ، CM = مرآة مقعرة ، C = كاميرا CMOS ، S = قسم جناح الفراشة ، R = شعاع مرجعي ، O = شعاع كائن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. إعداد البرنامج المستخدم

ملاحظة: يتم استخدام برنامج C++ المصمم في المنزل استنادا إلى تقريب Fresnel¹¹ لتحليل البيانات من التجارب ثلاثية الأبعاد. يمكن العثور على البرنامج الذي تم تطويره للدراسة المقدمة في . ¹² لا يمكن نشر تفاصيل البرنامج في الوقت الحالي. ومع ذلك ، سيتم تقديم معلومات إضافية عند الطلب. يعد تقريب فريسنل مفيدا للغاية في التصوير المجسم الرقمي لأنه يركز على الأسطح المختلفة ويكبر على منطقة ترتيب الحيود الأول ، والذي يحتوي على معلومات كاملة حول المشهد المسجل.

1. قم بتشغيل الكمبيوتر وتشغيل البرنامج.
   ملاحظة: تعتمد خطوة تشغيل البرنامج على البرنامج نفسه. لا يوجد برنامج تجاري لهذا الغرض.

4. إجراء التجربة

1. أطفئ الأنوار الخارجية. نفذ التجربة بأكملها في غرفة مظلمة.
2. مزامنة الكاميرات باستخدام فاصل زمني مختار. بالنسبة لهذه التجربة ، ابدأ تشغيل الكاميرا ثلاثية الأبعاد بعد 60 ثانية ، والكاميرتين الأخريين بعدها مباشرة ، إما باستخدام برنامج أو يدويا.
3. اضغط على أزرار التسجيل وحدد في البرنامج عند بدء التسجيل.
4. إحداث تغييرات ديناميكية في نظام الاهتمام. تعتمد طريقة البدء على نوع العينة. في حالة التأثير الضوئي ، قم بتسخين العينة خارجيا باستخدام أشعة الليزر المتاحة: 450 نانومتر ، 532 نانومتر ، 660 نانومتر ، 980 نانومتر. في حالة تفاعل BR ، ابدأ التفاعل عن طريق خلط المواد المتفاعلة الكيميائية. راقب التجربة ثلاثية الأبعاد.
5. اضبط الكاميرا الفوتوغرافية والحرارية لمتابعة التجربة بأكملها وتحديد لحظة نهاية التسجيل الثلاثي الأبعاد من القياسات البصرية والحرارية.
6. نطق نهاية العملية. يتم برمجة نهاية التسجيل مسبقا ، وفقا للمدة المقدرة للعملية. بالنسبة لتفاعل BR ، استخدم التصلب كنهاية للتفاعل. في حالة التأثير الضوئي ، لا توجد مثل هذه اللحظة المحددة. على أي حال ، تؤكد هذه الخطوة على أهمية التسجيل الثلاثي.

5. الحصول على النتائج¹²

1. احفظ النتائج. فرز الملفات بدقة كدالة للوقت لإعادة بناء الصور المجسمة وتحليل البيانات بشكل أعمق.
   ملاحظة: في هذه الخطوة، يتم نقل البيانات من الكاميرا المستخدمة في التصوير المجسم إلى الكمبيوتر (القرص الثابت) في مجلدات مسماة بعد تواريخ التصوير. استخدم أزرار النسخ / اللصق وإعادة التسمية.
2. تحقق من الهولوغرام الخاص بالمسبار لمعرفة الإعدادات المناسبة. وبهذه الطريقة ، يتم تحديد أفضل الإعدادات على الهولوغرام الأول من خلال النظر إليه ، ثم استخدامه لإعادة بناء جميع الصور المجسمة.
   1. اختر صورة ثلاثية الأبعاد واحدة بالنقر فوق أحدها من المجلد الذي قمت بإنشائه مسبقا (الخطوة 5.1) وقم بإعادة البناء بالنقر فوق الزر إعادة بناء .
   2. قم بتغيير الإعدادات لتحقيق أفضل صورة وإجراء إعادة الإعمار مرة أخرى. ستظهر خيارات لضبط المعلمات مثل أخذ العينات والإزاحة ومسافة Fresnel على الشاشة (قائمة البرامج). كرر هذه الخطوات حتى يتم تحديد أفضل الإعدادات.
   3. إجراء عمليات إعادة الإعمار. اختر جميع الصور المجسمة بالنقر فوق الزر فتح ملف واختيار جميع الملفات. تطبيق المعلمات المطلوبة لإعادة البناء العددي للصور المجسمة ؛ تبقى دون تغيير بعد الخطوة 5.2.1 ، لذلك لا تقم بتنفيذ أي إجراء هذه المرة.
   4. قم بإجراء عمليات إعادة البناء باستخدام زر إعادة الإنشاء ، و interferograms عن طريق إدراج أسماء الملفات في حقل البداية / النهاية مع ثم بالنقر فوق الزر دفعة. تظهر صور التداخل في المجلد الذي تم إنشاؤه مسبقا (في الخطوة 5.1).
      ملاحظة: بعد تسجيل سلسلة من الصور المجسمة في الوقت المناسب، يمثل الهولوغرام الأول حالة غير مضطربة، في حين أن عمل قوة خارجية يسبب صورا ثلاثية الأبعاد لاحقة. من الضروري إعادة بناء الصور المجسمة باستخدام تحويل فريسنل¹³ المتحول.
   5. احصل على صور التداخل عن طريق الطرح (من حيث الأعداد المركبة) لصورة ثلاثية الأبعاد معينة في الوقت المناسب مع أول صورة ثلاثية الأبعاد تم الحصول عليها.
      ملاحظة: يسمح هذا البروتوكول بمراقبة تأثير القوة على الجسم. التغيير في نمط التداخل كدالة للوقت هو نتيجة للتشوه أو الإزاحة التي تحدث داخل النظام أثناء القياس. تستخدم هذه التغييرات لمراقبة ديناميكيات النظام على المستوى النانوي.

6. تحليل النتائج

1. قم بإجراء تحليل مرئي كخطوة مراقبة الجودة الأولى للعملية. في هذه الخطوة، ابحث عن التغييرات المرئية في نمط التداخل وحاول مطابقة التغييرات في نمط التداخل مع النتائج التي تم الحصول عليها عن طريق القياسات البصرية والحرارية.
2. إجراء استجواب مضاد لجميع التسجيلات. في هذه المرحلة الثانية من التحليل ، قم بتحليل الصور بدقة بصريا من كل من الكاميرات البصرية والحرارية مع إعادة البناء الثلاثية الأبعاد من أجل الكشف عن الديناميكيات على نطاق النانو. وبهذه الطريقة ، يتم رؤية لحظة التفاعل في وقت واحد في الصور الثلاثية الأبعاد والحرارية والفوتوغرافية.
3. قم بعمل تمثيل رسومي للنتائج استنادا إلى التحليل العددي / البرمجي وتقديمها في شكل رسوم بيانية (1D أو 2D أو 3D) أو مخططات أو رسوم بيانية وما إلى ذلك. بعد تحليل كامل للنتائج ، استخلص الاستنتاجات وتوقع المزيد من الأبحاث بناء على ذلك.

النتائج

تم تحفيز تأثير ضوئي ومراقبته في تجربة أولى على جناح فراشة Morpho menelaus ⁵. بدأ التأثير من خلال عمل ليزر LED بأطوال موجية مختلفة (450 نانومتر ، 532 نانومتر ، 660 نانومتر ، و 980 نانومتر). هنا ، تم استخدام الأجنحة من فراشة I. lathonia ¹⁴ . بعد إجراء التسجيل ، تمت إعادة بناء صورة ا...

Discussion

في الدراسة البيوفوتونية المقدمة ، تبين أنه يمكن استخدام طريقة ثلاثية الأبعاد جديدة للكشف عن الحد الأدنى من الإزاحة المورفولوجية أو التشوه الناجم عن الإشعاع الحراري منخفض المستوى.

الخطوة الأكثر أهمية في القياس المجسم مع العينات البيولوجية هي خطوة التحضير. يعتمد إعداد العي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Active Vibration Isolation, Four Optical Table Supports	Thorlabs	PTR502	High Load Capacity: 2,500 kg, Height 600 mm
Cuvette			Standard glass cuvette
Holographic camera (optical camera for holography)	Cannon	EOS 50D	Sensor Size 22.3 x 14.9 mm; Pixel pitch 4.69 µm; Max. resolution 4752 x 3168; JPEG file format
Hydrogen peroxide, H2O2	Merck (Darmstadt, Germany)
Laser	Laser Quantum	Torus 532 laser	Wavelength 532 nm; Power 390 mW; Coherence length 10 m
LED lasers
Malonic acid, C3H4O4	Acrs Organics (Geel, Belgium)
Manganese sulphate,  MnSO4	Fluka (Buchs, Switzerlend)
Nonlinear optical microscope	IPB
Optical accessories	Thorlab
Optical spectroscope
Optical table	Thorlabs	TOP450II PTR52509	dimensions 2000*1250*310 mm
Perchloric acid, HClO4	Merck (Darmstadt, Germany)
Potassium iodate, KIO3	Merck (Darmstadt, Germany)
Software			Home-build software made by one of the authors: Dusan Grujic. This software was conducted in partial fulfillment of the requirements for the PhD deegree of D.G.
Thermal camera	Flir	A65	640x512 pixel; Thermal resolution 50 mK
Video camera	Nikon	1v3	18.4 Mpixel; 60 fps