Scoprire le dinamiche nascoste delle strutture fotoniche naturali utilizzando l'imaging olografico

Riepilogo

Il documento si concentra principalmente sulla potenza combinata dei metodi ottici (lineari e non lineari) e olografici utilizzati per rivelare fenomeni su scala nanometrica. I risultati ottenuti dagli studi sulle reazioni chimiche biofotoniche e oscillatorie sono forniti come esempi rappresentativi, evidenziando la capacità dell'olografia di rivelare dinamiche su scala nanometrica.

Abstract

In questo metodo, viene sfruttato il potenziale dell'ottica e dell'olografia per scoprire dettagli nascosti della risposta dinamica di un sistema naturale su scala nanometrica. Nella prima parte vengono presentati gli studi ottici e olografici delle strutture fotoniche naturali e le condizioni per l'aspetto dell'effetto fotoforetico, vale a dire lo spostamento o la deformazione di una nanostruttura a causa di un gradiente termico indotto dalla luce, su scala nanometrica. Questo effetto è rivelato dall'interferometria olografica digitale in tempo reale che monitora la deformazione delle squame che coprono le ali degli insetti indotta dalla temperatura. Il legame tra geometria e nanocorrugazione che porta all'emergere dell'effetto fotoforetico è sperimentalmente dimostrato e confermato. Nella seconda parte, viene mostrato come l'olografia possa essere potenzialmente utilizzata per scoprire dettagli nascosti nel sistema chimico con dinamica non lineare, come il fenomeno di transizione di fase che si verifica in una complessa reazione oscillatoria di Briggs-Rauscher (BR). Il potenziale presentato dell'olografia su scala nanometrica potrebbe aprire enormi possibilità per il controllo e lo stampaggio dell'effetto fotoforetico e della formazione di modelli per varie applicazioni come l'intrappolamento e la levitazione di particelle, tra cui il movimento di idrocarburi incombusti nell'atmosfera e la separazione di diversi aerosol, la decomposizione delle microplastiche e il frazionamento delle particelle in generale e la valutazione della temperatura e della conduttività termica delle particelle di combustibile di dimensioni micron.

Introduzione

Per comprendere e notare appieno tutti i fenomeni unici nel nanomondo, è fondamentale impiegare tecniche in grado di rivelare tutti i dettagli riguardanti strutture e dinamiche su scala nanometrica. Per questo motivo, viene presentata la combinazione unica di metodi lineari e non lineari, combinata con il potere dell'olografia di rivelare le dinamiche del sistema su scala nanometrica.

La tecnica olografica descritta può essere vista come il metodo triple rec (rec è l'abbreviazione di registrazione), poiché in un dato momento il segnale viene registrato contemporaneamente da una fotocamera fotografica, una telecamera termica e un interferometro. La spettroscopia ottica lineare e non lineare e l'olografia sono tecniche ben note, i cui principi fondamentali sono ampiamente descritti nella letteratura ^1,2.

Per farla breve, l'interferometria olografica consente il confronto di fronti d'onda registrati in diversi momenti nel tempo per caratterizzare la dinamica del sistema. In precedenza era usato per misurare la dinamica vibrazionale ^3,4. La potenza dell'olografia come metodo interferometrico più semplice si basa sulla sua capacità di rilevare il più piccolo spostamento all'interno del sistema. In primo luogo, abbiamo sfruttato l'olografia per osservare e rivelare l'effetto fotoforetico⁵ (cioè lo spostamento della deformazione di una nanostruttura a causa di un gradiente termico indotto dalla luce), in diverse strutture biologiche. Per una vera presentazione del metodo, sono stati selezionati campioni rappresentativi da una serie di campioni biologici testati⁶. Ali della farfalla fritillaria della regina di Spagna, Issoria lathonia (Linneo, 1758; I. lathonia), sono stati utilizzati nel quadro di questo studio.

Dopo aver dimostrato con successo la presenza di fotoforesi su scala nanometrica nei tessuti biologici, è stato applicato un protocollo simile per monitorare il processo spontaneo di rottura della simmetria⁷ causato da una transizione di fase in una reazione chimica oscillatoria. In questa parte, è stata studiata la transizione di fase da una bassa concentrazione di ioduro e iodio (chiamato stato I) ad un'alta concentrazione di ioduro e iodio con formazione di iodio solido (definito come stato II) che si verifica in una reazione BR chimicamente non lineare ^8,9. Qui, abbiamo riportato per la prima volta un approccio olografico che consente di studiare una tale transizione di fase e dinamiche spontanee di rottura della simmetria su scala nanometrica che si verificano in sistemi condensati.

Protocollo

1. Precarizzazione

1. Eseguire una precarizzazione completa del campione.
   1. Eseguire tutti gli esperimenti su campioni secchi acquistati da una fonte commerciale. Conservare i campioni in laboratorio, in un luogo asciutto e buio, a temperatura ambiente.
   2. Prima delle misurazioni olografiche, eseguire una caratterizzazione completa del campione mediante microscopio elettronico a scansione (SEM), spettroscopia ottica lineare e microscopia ottica non lineare (NOM)¹⁰ (Figura 1).
   3. Oltre alle proprietà ottiche dei campioni misurati con tecniche lineari, raccogliere informazioni supplementari con raggi laser ad alta intensità che consentono la caratterizzazione delle loro proprietà ottiche non lineari.
   4. Utilizzare le corrispondenti suscettibilità ottiche non lineari per quantificare la risposta ottica non lineare e costituire la base di tecniche ottiche non lineari come la fluorescenza di eccitazione multifotonica non distruttiva e la seconda generazione armonica (SHG), che vengono utilizzate per caratterizzare vari campioni biologici.
   5. Per i fenomeni chimici non lineari che si verificano nella reazione BR oscillante, effettuare lo studio del monitoraggio interferometrico della transizione di fase in situ dallo stato I allo stato II con le seguenti concentrazioni di reagenti: [CH₂(COOH)₂]₀ = 0,0789 mol ^dm-3, [MnSO₄]₀ = 0,0075 mol ^dm-3, [HClO₄]₀ = 0,03 mol ^dm-3, [KIO₃] ₀ = 0,0752 mol ^dm-3 e [H₂O₂]₀ = 1,269 mol ^dm-3 (0 dopo la parentesi sta per la concentrazione iniziale all'inizio del processo). Rendere il volume totale utilizzato per la reazione BR pari a 2,5 ml.
      NOTA: I valori di concentrazione qui utilizzati sono uguali a quelli dello studio di Pagnacco et ^al.8, ma con volume di reazione diviso per 10.
2. Preparare il campione per l'esperimento.
   1. Usa le ali della farfalla fritillaria della regina di Spagna, I. lathonia, per questo esperimento. Posizionare l'ala su una superficie dura e creare una sezione con una fresa di 10 mm di diametro. Posizionare il campione nella scatola del campione, che può essere qualsiasi contenitore con un coperchio.

Figura 1: Sezione trasversale ondulata della scala dell'ala a farfalla. La sezione trasversale è stata registrata su un microscopio ottico a scansione non lineare (A, B). È stata fatta anche un'osservazione SEM (C) di un'ala della farfalla fritillaria della Regina di Spagna, I. lathonia. Questa cifra è stata modificata da¹⁴. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Configurazione sperimentale

1. Configurazione olografica
   NOTA: Le misure di interferometria olografica sono state eseguite con una configurazione ottica su misura (Figura 2).
   1. Regolare la temperatura di laboratorio in modo che sia compresa tra 23 °C ± 0,2 °C. Accendere il laser. Utilizzare un laser (dettagli forniti nella Tabella dei materiali) con una lunghezza d'onda di eccitazione di 532 nm per queste osservazioni olografiche.
   2. Controllare l'allineamento degli elementi ottici (Figura 2). Innanzitutto, verificare che l'installazione venga eseguita in base allo schema nella Figura 2.
   3. Allineare perfettamente il raggio laser con lo specchio concavo M. Controllare e regolare la posizione dell'espansore del fascio ottico (L).
   4. Determinare la parte del fascio che interferisce con il campione S e assicurarsi che formi un raggio riflesso O. Controllare se il resto del raggio è raccolto su uno specchio sferico CM, da utilizzare per generare il raggio di riferimento R. Controllare se il rilevatore C è posizionato all'interno della zona di interferenza dei due fasci specificati.
      NOTA: un sensore CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor) viene utilizzato come rilevatore.
   5. Impostare le telecamere in base alle istruzioni per la fotocamera utilizzata. Impostare una fotocamera ottica/fotografica per l'esperimento olografico come mostrato nella Figura 2 (C è la fotocamera; dettagli forniti nella Tabella dei materiali). Impostare una seconda telecamera ottico/fotografica per visualizzare i cambiamenti visibili nella reazione BR e una termocamera con una risoluzione termica di 50 mK e una lunghezza focale di 13 mm sopra la tavola ottica.
      NOTA: la fotocamera utilizzata nell'esperimento olografico non utilizza un obiettivo; la luce interferisce direttamente con il chip.
2. Preparare il campione in configurazione olografica.
   1. Preparare il campione di ala come al punto 1.2.1. Posizionare il campione preparato su un supporto metallico rotondo con un diametro di 15 mm. Il supporto ha tre fori esistenti per le viti a cui è fissato l'anello metallico che contiene il campione.
   2. Attaccare l'anello al supporto. Posizionare il campione allegato nella parte del supporto del campione situata sulla tavola ottica.
   3. Preparare il campione per il monitoraggio delle reazioni chimiche. Sul tavolo ottico, nel punto previsto, posizionare un supporto con una superficie adesiva piana su cui verrà posizionata la cuvetta/vaso.
   4. Preparare il reagente utilizzato per inizializzare la reazione come al punto 1.1.5. Riempire i reagenti nella cuvetta e mescolare in cuvetta nel seguente ordine di volumi e concentrazioni: 0,7 mL di 0,2817 mol ^dm-3 CH₂(COOH)₂; 0,5 mL di 0,0375 mol ^dm-3 MnSO₄; 0,5 mL di 0,15 mol ^dm-3 HClO₄; 0,5 mL di 0,376 mol ^dm-3 KIO₃ ; e 0,3 mL di 10,575 mol ^dm-3 H₂O₂.
   5. Assicurarsi che il volume totale nella cuvetta sia di 2,5 ml e posizionarlo sul supporto nella configurazione.
   6. Impostare strumenti aggiuntivi, se necessario. Per monitorare l'effetto fotoforetico, utilizzare un laser aggiuntivo (dettagli forniti nella Tabella dei materiali) per il riscaldamento locale.

Figura 2: Configurazione olografica. La figura mostra come sono disposti i vari componenti per l'esperimento olografico. Abbreviazioni: L1 = laser a 532 nm, L = lente biconvessa, A = apertura, M = specchio piatto utilizzato per deviare il raggio laser, CM = specchio concavo, C = fotocamera CMOS, S = sezione alare farfalla, R = raggio di riferimento, O = fascio di oggetti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Configurazione del software utilizzato

NOTA: il software C++ costruito in casa basato sull'approssimazione di Fresnel¹¹ viene utilizzato per analizzare i dati degli esperimenti olografici. Il software sviluppato per lo studio presentato è disponibile all'indirizzo . ¹² I dettagli del software non possono essere pubblicati al momento; tuttavia, ulteriori informazioni saranno fornite su richiesta. L'approssimazione di Fresnel è estremamente utile nell'olografia digitale poiché si concentra su diverse superfici e ingrandisce l'area del primo ordine di diffrazione, che contiene informazioni complete sulla scena registrata.

1. Accendere il computer ed eseguire il software.
   NOTA: il passaggio per l'esecuzione del software dipende dal software stesso. Non esiste un software commerciale per questo scopo.

4. Esegui l'esperimento

1. Spegnere le luci esterne. Esegui l'intero esperimento in una stanza buia.
2. Sincronizzare le telecamere utilizzando un intervallo scelto. Per questo esperimento, avviare la fotocamera olografica dopo 60 s e le altre due fotocamere subito dopo, utilizzando un software o manualmente.
3. Premere i pulsanti di registrazione e definire nel software quando inizia la registrazione.
4. Indurre cambiamenti dinamici nel sistema di interesse. Il metodo di iniziazione dipende dal tipo di campione; in caso di effetto fotoforetico, riscaldare esternamente il campione utilizzando i laser disponibili: 450 nm, 532 nm, 660 nm, 980 nm. Nel caso della reazione BR, iniziare la reazione mescolando i reagenti chimici. Osserva l'esperimento olografico.
5. Impostare la telecamera fotografica e termica per seguire l'intero esperimento e determinare il momento della fine della registrazione olografica dalle misurazioni ottiche e termiche.
6. Pronuncia la fine del processo. La fine della registrazione è preprogrammata, in base alla durata stimata del processo. Per la reazione BR, utilizzare la solidificazione come fine della reazione. Nel caso dell'effetto fotoforetico, non esiste un momento così specifico. In ogni caso, questo passaggio sottolinea l'importanza della tripla registrazione.

5. Acquisizione dei risultati¹²

1. Salvare i risultati. Ordina con precisione i file in funzione del tempo per ricostruire gli ologrammi e approfondire l'analisi dei dati.
   NOTA: in questo passaggio, i dati vengono trasferiti dalla fotocamera utilizzata per l'olografia al computer (disco rigido) in cartelle denominate dopo le date di ripresa. Utilizzare i pulsanti copia/incolla e rinomina.
2. Controllare l'ologramma della sonda per le impostazioni appropriate. In questo modo, le impostazioni migliori vengono selezionate sul primo ologramma guardandolo e quindi utilizzate per la ricostruzione di tutti gli ologrammi.
   1. Scegli un ologramma facendo clic su uno di essi dalla cartella che hai creato in precedenza (passaggio 5.1) ed effettua una ricostruzione facendo clic sul pulsante Ricostruisci .
   2. Modificare le impostazioni per ottenere l'immagine migliore ed effettuare nuovamente la ricostruzione. Le opzioni per la regolazione di parametri come campionamento, offset e distanza di Fresnel appariranno sullo schermo (menu software). Ripetere questi passaggi fino a definire le impostazioni migliori.
   3. Eseguire le ricostruzioni. Scegli tutti gli ologrammi facendo clic sul pulsante Apri file e scegliendo tutti i file. Applicare i parametri desiderati per la ricostruzione numerica degli ologrammi; rimangono invariati dopo il passaggio 5.2.1, quindi questa volta non eseguire alcuna azione.
   4. Eseguire le ricostruzioni utilizzando il pulsante Ricostruisci e gli interferogrammi inserendo i nomi dei file nel campo inizio con/fine con e quindi facendo clic sul pulsante Batch. Gli interferogrammi vengono visualizzati nella cartella creata in precedenza (nel passaggio 5.1).
      NOTA: Dopo aver registrato una serie di ologrammi nel tempo, il primo ologramma rappresenta uno stato imperturbabile, mentre l'azione di una forza esterna provoca ologrammi successivi. È necessario ricostruire gli ologrammi usando la trasformata di Fresnel spostata¹³.
   5. Ottenere gli interferogrammi per sottrazione (in termini di numeri complessi) di un particolare ologramma nel tempo con il primo ologramma ottenuto.
      NOTA: questo protocollo consente di osservare l'effetto della forza sull'oggetto. Il cambiamento nel modello di interferenza in funzione del tempo è una conseguenza della deformazione o dello spostamento che si verifica all'interno del sistema durante la misurazione. Questi cambiamenti vengono utilizzati per monitorare le dinamiche del sistema su scala nanometrica.

6. Analisi dei risultati

1. Eseguire un'analisi visiva come prima fase di controllo qualità del processo. In questa fase, cercare i cambiamenti visibili nel modello di interferenza e cercare di abbinare i cambiamenti nel modello di interferenza con i risultati ottenuti da misurazioni ottiche e termiche.
2. Eseguire un esame incrociato di tutte le registrazioni. In questa seconda fase dell'analisi, analizzare a fondo le immagini visivamente sia dalle telecamere ottiche che termiche con le ricostruzioni olografiche al fine di rivelare le dinamiche su scala nanometrica. In questo modo, il momento di reazione viene visto contemporaneamente in immagini olografiche, termiche e fotografiche.
3. Fai una rappresentazione grafica dei risultati basata sull'analisi numerica / software e presentali sotto forma di grafici (1D, 2D o 3D), grafici, istogrammi ecc. Dopo un'analisi completa dei risultati, trarre conclusioni e anticipare ulteriori ricerche basate su questo.

Risultati

Un effetto fotoforetico è stato indotto e monitorato in un primo esperimento sull'ala di una farfalla Morpho menelaus ⁵. L'effetto è stato avviato dall'azione di laser a LED di diverse lunghezze d'onda (450 nm, 532 nm, 660 nm e 980 nm). Qui sono state utilizzate le ali di una farfalla I. lathonia ¹⁴ . Dopo la procedura di registrazione, l'immagine dell'ologramma è stata ricostruita.

...

Discussione

Nello studio biofotonico presentato, è dimostrato che un nuovo metodo olografico può essere utilizzato per rilevare uno spostamento morfologico minimo o una deformazione causata da radiazioni termiche di basso livello.

La fase più critica nella misurazione olografica con campioni biologici è la fase di preparazione. La preparazione del campione (taglio/incollaggio per adeguarsi alle dimensioni del supporto) dipende dalle proprietà meccaniche del campione e non è possibile avere un protoc...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Active Vibration Isolation, Four Optical Table Supports	Thorlabs	PTR502	High Load Capacity: 2,500 kg, Height 600 mm
Cuvette			Standard glass cuvette
Holographic camera (optical camera for holography)	Cannon	EOS 50D	Sensor Size 22.3 x 14.9 mm; Pixel pitch 4.69 µm; Max. resolution 4752 x 3168; JPEG file format
Hydrogen peroxide, H2O2	Merck (Darmstadt, Germany)
Laser	Laser Quantum	Torus 532 laser	Wavelength 532 nm; Power 390 mW; Coherence length 10 m
LED lasers
Malonic acid, C3H4O4	Acrs Organics (Geel, Belgium)
Manganese sulphate,  MnSO4	Fluka (Buchs, Switzerlend)
Nonlinear optical microscope	IPB
Optical accessories	Thorlab
Optical spectroscope
Optical table	Thorlabs	TOP450II PTR52509	dimensions 2000*1250*310 mm
Perchloric acid, HClO4	Merck (Darmstadt, Germany)
Potassium iodate, KIO3	Merck (Darmstadt, Germany)
Software			Home-build software made by one of the authors: Dusan Grujic. This software was conducted in partial fulfillment of the requirements for the PhD deegree of D.G.
Thermal camera	Flir	A65	640x512 pixel; Thermal resolution 50 mK
Video camera	Nikon	1v3	18.4 Mpixel; 60 fps