علم الوراثة العكسي لهندسة متغيرات فيروس الحمض النووي الريبي ذات الحس الإيجابي

Summary

يصف البروتوكول طريقة لإدخال التنوع الجيني الذي يمكن التحكم فيه في جينوم فيروس التهاب الكبد C من خلال الجمع بين تخليق الحمض النووي الريبي الطافر كامل الطول باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل المعرض للخطأ وعلم الوراثة العكسي. توفر الطريقة نموذجا لاختيار النمط الظاهري ويمكن استخدامها لجينومات فيروس الحمض النووي الريبي ذات الحس الإيجابي التي يبلغ طولها 10 كيلوبايت.

Abstract

أدى عدم وجود طريقة ملائمة للتوليد التكراري للمتغيرات الفيروسية المتنوعة كاملة الطول إلى إعاقة دراسة التطور الموجه في فيروسات الحمض النووي الريبي. من خلال دمج تفاعل البوليميراز المتسلسل الكامل المعرض لخطأ جينوم الحمض النووي الريبي وعلم الوراثة العكسي ، يمكن إحداث طفرات استبدال عشوائية على مستوى الجينوم. لقد طورنا طريقة باستخدام هذه التقنية لتجميع مكتبات متنوعة لتحديد الطفرات الفيروسية ذات الأنماط الظاهرية ذات الاهتمام. وتوفر هذه الطريقة، التي تسمى تخليق الحمض النووي الريبي الطافر الكامل الطول (FL-MRS)، المزايا التالية: (أ) القدرة على إنشاء مكتبة كبيرة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل عالي الكفاءة من خطوة واحدة عرضة للخطأ؛ (ب) القدرة على إنشاء مكتبة كبيرة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عالي الكفاءة من خطوة واحدة عرضة للخطأ؛ (ب) القدرة على إنشاء مكتبة كبيرة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عالي الكفاءة من خطوة واحدة عرضة للخطأ؛ (ب) القدرة على إنشاء مكتبة كبيرة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عالي الكفاءة من خطوة واحدة عرضة للخطأ؛ (ج) القدرة على (ii) القدرة على إنشاء مجموعات من المكتبات بمستويات متفاوتة من التنوع الجيني عن طريق التلاعب بإخلاص بوليميراز الحمض النووي؛ (iii) إنشاء منتج PCR كامل الطول يمكن أن يكون بمثابة نموذج مباشر لتخليق الحمض النووي الريبي الطافر ؛ و (iv) القدرة على إنشاء الحمض النووي الريبي الذي يمكن تسليمه إلى الخلايا المضيفة كتجمع إدخال غير محدد لفحص الطفرات الفيروسية للنمط الظاهري المطلوب. لقد وجدنا ، باستخدام نهج الوراثة العكسية ، أن FL-MRS هي أداة موثوقة لدراسة التطور الموجه للفيروسات في جميع مراحل دورة حياة فيروس التهاب الكبد C ، عزل JFH1. يبدو أن هذه التقنية أداة لا تقدر بثمن لتوظيف التطور الموجه لفهم التكيف والتكرار ودور الجينات الفيروسية في التسبب في المرض والمقاومة المضادة للفيروسات في فيروسات الحمض النووي الريبي ذات الحس الإيجابي.

Introduction

يبدأ الفحص الجيني الأمامي بنمط ظاهري فيروسي مثير للاهتمام ، ثم ، من خلال تسلسل جينومه ومقارنته بجينوم السلالة الأصلية ، يحاول تحديد الطفرة (الطفرات) التي تسبب هذا النمط الظاهري. في المقابل ، في الشاشات الجينية العكسية ، يتم إدخال طفرات عشوائية في الجين المستهدف ، يليها فحص النمط الظاهري (الأنماط الظاهرية) ^{الناتج1}. بالنسبة لنهج الوراثة العكسية ، فإن الطفرات في المختبر هي التقنية الأكثر استخداما لإنشاء مجموعة من المتغيرات التي يتم فحصها لاحقا بحثا عن الأنماط الظاهرية ذات الأهمية. تم الإبلاغ عن أدوات وراثية مختلفة لتحقيق طفرات عشوائية على مستوى الجينوم لفيروسات الحمض النووي الريبي ، بما في ذلك تفاعل البوليميراز المتسلسل المعرض للخطأ (ep-PCR) ^2,3 ، وتمديد البلمرة^{الدائري 4} ، وطفرات إدخال Mu-transposon ⁵،^6،7. تنتج الطريقتان الأخيرتان مكتبات تؤوي تنوعا محدودا في التسلسل وهي عرضة لإدخال عمليات إدراج وحذف كبيرة ، وهي قاتلة للغاية للفيروسات وتحد بشدة من استعادة المتغيرات الفيروسية المعدية.

EP-PCR هي تقنية طفرات قوية معروفة تستخدم على نطاق واسع في هندسة البروتين لتوليد إنزيمات متحولة لاختيار الأنماط الظاهرية ذات الخصائص المرغوبة ، مثل الاستقرار الحراري المعزز ، وخصوصية الركيزة ، والنشاط التحفيزي⁸،^9،10. هذه التقنية سهلة التنفيذ لأنها تتطلب معدات بسيطة ، ولا تنطوي على معالجات مملة ، وتستخدم الكواشف المتاحة تجاريا ، وهي سريعة ؛ علاوة على ذلك ، فإنه يولد مكتبات عالية الجودة.

هنا ، قمنا بتطوير طريقة جديدة لتخليق الحمض النووي الريبي الطافر الكامل الطول (FL-MRS) لتوليد جينومات كاملة لفيروس التهاب الكبد الوبائي سي (HCV) من خلال دمج ep-PCR ، والذي يحفز الطفرات البديلة العشوائية على مستوى الجينوم وعلم الوراثة العكسي. حتى إدخال أو حذف نيوكليوتيدات واحدة ضار للغاية لفيروسات الحمض النووي الريبي ذات الحس الإيجابي ([+]ssRNA) ؛ ومن ثم ، فإن الطفرات البديلة القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل هي الطريقة المفضلة للتوليد التكراري للمكتبات الكبيرة والمتنوعة من جينومات فيروس الحمض النووي الريبي (+) ss الكاملة ذات الصلاحية الجيدة.

FL-MRS هو نهج مباشر يمكن تطبيقه على أي فيروس RNA ذو إحساس إيجابي بطول جينوم ~ 10 كيلو بايت من خلال التصميم الدقيق لمجموعة التمهيدي التي ترتبط باستنساخ cDNA الفيروسي. pJFH1 هو استنساخ cDNA معدي يشفر النمط الجيني HCV 2a ويمكنه تلخيص جميع خطوات دورة حياة الفيروس. باستخدام نهج FL-MRS ، أظهرنا توليف مكتبات الجينوم الكامل المطفرة عشوائيا (المكتبات الطافرة [MLs]) لإنتاج متغيرات JFH1 ذات الكفاءة المتماثلة والتي لم تكن هناك معرفة مسبقة بالخصائص المرتبطة بالطفرات. عند التعرض لمضاد للفيروسات ، تغلبت بعض المتغيرات الفيروسية بسرعة على ضغط الدواء مع التغيير الظاهري المطلوب. باستخدام البروتوكول الموصوف هنا ، يمكن إنشاء عدد كبير من المتغيرات الفيروسية ، مما يخلق فرصا لدراسة تطور فيروسات ssRNA (+).

Protocol

ملاحظة: كانت سلالة JFH1 (WT) المستخدمة هنا هدية كريمة من تاكاجي واكيتا ، المعهد الوطني للأمراض المعدية. كان خط خلايا الورم الكبدي البشري ، Huh7.5 ، هدية لطيفة من تشارلز رايس ، جامعة روكفلر. يظهر رسم تخطيطي للطريقة في الشكل 1.

1. الطفرات البديلة على مستوى الجينوم ل JFH1 باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل المعرض للخطأ

1. لإجراء ep-PCR ، قم بإعداد المزيج الرئيسي لأربع مجموعات من التجارب باستخدام الاشعال J-For 5'-GTTTTCCCAGTCAGCACGTTGTAAAACGACGGC-3' و J-Rev 5'-CATGATCTGCAGAGAGACCAGTTACGGCACTCTC -3' (الشكل 1A) ، جنبا إلى جنب مع مكونات التفاعل الموضحة في الجدول 1 بدون قالب pJFH1 (البلازميد المعزول من سلالة JFH1).
2. قم بقسمة المزيج الرئيسي في أربعة أنابيب ، وأضف 100 نانوغرام و 50 نانوغرام و 25 نانوغرام و 10 نانوغرام من القالب إلى الأنابيب الفردية ، واضبط الحجم الكلي للتفاعل على 50 ميكرولتر. قم بتطبيق ظروف الدورة الموضحة في الجدول 2 لتضخيم جزء زوج قاعدة 9736 (bp) يتألف من مروج T7 وجينوم HCV كامل الطول (الشكل 2).
   ملاحظة: يجب أن يحتوي منتج ep-PCR على تسلسل المروج T7 لتسهيل النسخ في المختبر للجينوم الفيروسي. لذلك ، يجب أن يكون التمهيدي الأمامي موجودا في المنبع لمروج T7 لاستنساخ cDNA الفيروسي ، ويجب أن ينتهي تسلسل التمهيدي العكسي عند نهاية 3'-end من جينوم الفيروس لتسهيل جريان النسخ. قم بتحسين كل مكون من مكونات تفاعل ep-PCR ضمن النطاق الموصى به من قبل الشركة المصنعة لبوليميراز Taq DNA لتحقيق تضخيم عالي الغلة. بالإضافة إلى كميات القوالب المتنوعة ، يمكن أيضا استخدام dNTPs غير المتوازنة (خاصة تركيز dATP و / أو dGTP المنخفض) لزيادة التنوع في طول الجينومات الفيروسية من 6-8 كيلو بايت^{طويلة 3}.
3. قم بتقدير منتج ep-PCR الذي تم تضخيمه عن طريق تحميل كميات متساوية من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (5 ميكرولتر) ومقارنتها بكميات معروفة من سلم الحمض النووي 1 كيلو قاعدة (kb) عن طريق تشغيل 0.8٪ من هلام الأغاروز القائم على Tris-acetate-EDTA (TAE)¹¹. قم بتنقية المنتج باستخدام مجموعة تنقية العمود حسب توجيهات الشركة المصنعة.
4. تقدير تركيز المنتج المنقى عن طريق قياس الامتصاص عند 260 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي المجهري¹². قم بتركيز منتج ep-PCR بالتفريغ إذا لزم الأمر للحصول على تركيز المنتج ≥100 نانوغرام / ميكرولتر.
   ملاحظة: يمكن إجراء تقدير أكثر دقة عن طريق تحميل التخفيفات التسلسلية ذات شقين لمنتج ep-PCR ومقارنة شدتها بالكميات المعروفة من سلم الحمض النووي 1 كيلو بايت.

2. تخليق الحمض النووي الريبي الفيروسي

1. قم بإعداد تفاعل 40 ميكرولتر لهضم 5 ميكروغرام من pJFH1 النسيلي مع 4 U من إنزيم XbaI عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة ، متبوعا بتنقية العمود وقياس الامتصاص عند 260 نانومتر في مقياس الطيف الضوئي المجهري¹². قم بإعداد تفاعل نسخ 20 ميكرولتر في المختبر لمنتج ep-PCR المنقى بالعمود أو clnal-pJFH1 (WT) باستخدام نظام إنتاج الحمض النووي الريبي واسع النطاق المتاح تجاريا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
2. في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 200 ميكرولتر ، امزج ما يقرب من 1 ميكروغرام من منتج ep-PCR المنقى (المكتبات الطافرة) أو XbaI المهضوم النسيلي-pJFH1 ، و 10 ميكرولتر من 2x buffer يحتوي على ريبونوكليوتيدات ، و 2 ميكرولتر من مزيج إنزيم T7. امزج جميع المكونات وقم بتدوير المكونات لفترة وجيزة. احتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة ، متبوعا بإضافة 1 إنزيم DNase خال من U RNase والحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (الشكل 1C).
3. تنقية الحمض النووي الريبي المركب في المختبر باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، واستخلاص 40 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase و DNase ، وتقدير تركيز الحمض النووي الريبي المنقى عن طريق قياس الامتصاص عند 260 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي microvolume¹². قم بعمل الحصص حسب الحاجة (5 ميكروغرام أو 2 ميكروغرام) لتجنب تجميد الذوبان وتخزينها في -80 درجة مئوية. تحقق من سلامة وحجم النسخ الفيروسية باستخدام 2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي ل MOPS الفورمالديهايد 0.8٪ هلام الأغاروز الكهربائي¹³ (الشكل 3).

3. تقدير نسبة الطفرات في منتجات ep-PCR (المكتبات الطافرة)

ملاحظة: في هذه الخطوة، تتحور نسبة النيوكليوتيدات عن طريق استنساخ المنتج الذي تم الحصول عليه في الخطوة 2. لإثبات ميزة استخدام ep-PCR لإنشاء عدم تجانس جيني باستخدام مكتبتين متحولتين كاملتين للجينوم (ML50 و ML25) والحمض النووي الريبي الفيروسي المشتق من pJFH1. تم تقدير نسبة الطفرات في جين HCV NS5A ، والذي كان أيضا جين القراءة الظاهري (مقاومة الأدوية) في هذه الدراسة.

1. قم بإعداد تفاعل تخليق cDNA 20 ميكرولتر عن طريق إضافة ما يقرب من 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي الفيروسي الذي تم تصنيعه في الخطوة 2 ، والتمهيدي العكسي 5 ميكرومتر 5'-GTGTACCTAGTGTGTGCCGCTCTA-3 '، و 200 U النسخ العكسي وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
2. باستخدام cDNA ، قم بتضخيم جزء 2571 bp الذي يضم جين NS5A الكامل. للقيام بذلك ، قم بإعداد خليط تفاعل يحتوي على 0.5 ميكرومتر لبادئات 5272F و 7848R (التركيز النهائي ؛ الجدول 3) ، 1.5 mM MgCl₂ ، 1x PCR buffer ، و 1 U بوليميراز Taq عالي الدقة في حجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر وتشغيل دورة تضخيم باستخدام الظروف الموضحة في الجدول 4.
3. قم بتشغيل المنتج على جل أغاروز قائم على TAE بنسبة 0.8٪ لتأكيد حجم المنتج البالغ 2571 نقطة أساس ثم قم بتنقية المنتج باستخدام مجموعة تنقية العمود وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة. قم بإخراج المنتج المنقى بالعمود في 40 ميكرولتر من الماء المعقم.
4. لإضافة 3 'A متدلية إلى المنتج ، أضف 0.5 ميكرومتر dATP و 1 وحدة من بوليميراز Taq DNA منخفض الدقة واحتضان منتج PCR بالكامل عند 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة جنبا إلى جنب مع 1x PCR buffer و 1.5 mM MgCl₂ (التركيز النهائي). قم بتنقية الخليط باستخدام مجموعة تنقية العمود حسب توجيهات الشركة المصنعة
   ملاحظة: بدلا من ذلك ، قم بإخراج المنتج الطويل ~ 9.7 كيلو بايت من الجل من الخطوة 1.4. وإجراء الاستنساخ باستخدام مجموعة متاحة تجاريا لاستنساخ منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الطويل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة أو إجراء NGS لمنتج ep-PCR باستخدام منصة Illumina².
5. قم بإعداد تفاعل ربط عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من مخزن الربط 2x ، و 50 نانوغرام من الحمض النووي للناقل T ، وحوالي 3 أضعاف الفائض المولي من الحمض النووي المدرج الذي تم تصنيعه في الخطوة 3.4 ، و 3 وحدات فايس من T4 DNA ligase ، والماء الخالي من النيوكلياز إلى حجم إجمالي قدره 10 ميكرولتر. احتضان هذا التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعات ثم إضافة 100 ميكرولتر من الإشريكية القولونية DH5α مع الحمض النووي المربوط ؛ صدمة حرارية للخلايا عند 42 درجة مئوية لمدة 35 ثانية (الشكل 1 ب).
6. أضف 1 مل من وسط Luria-Bertani (LB) (بدون مضاد حيوي) واحتضانه مع رج لطيف لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية للتعافي. قم بطرد مركزي تعليق الخلية عند 13800 × جم ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد التعليق في 200 ميكرولتر من وسط LB الجديد.
7. صفيحة 100 ميكرولتر من خلايا الإشريكية القولونية DH5α المحولة على صفيحة LB تحتوي على 50 ميكروغرام / مل أمبيسلين وتحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. قم بإعداد minipreps من 25-30 مستعمرة في 5 مل من LB متوسط + 50 ميكروغرام / مل أمبيسلين وتنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
8. في اليوم التالي ، استخرج البلازميدات باستخدام مجموعة تنقية البلازميد وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وقم بإجراء هضم إنزيم التقييد بحجم 10 ميكرولتر مع 200 نانوغرام من البلازميدات المعزولة ، و 2 U من EcoR1 ، و 1x عازلة تقييد لجميع المستعمرات.
9. بعد احتضان مخاليط الهضم عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات ، قم بتحليل المنتجات على 0.8٪ من جل الأغاروز القائم على TAE لتأكيد إدخال الحمض النووي البلازميد.
10. قم بإجراء تسلسل سانجر لبلازميدات 25 مستنسخا إيجابيا باستخدام الاشعال M13 Forward و M13 العكسي و 6208-SPF و 6748-SPF (الجدول 3) لتحديد نسبة الطفرات (معبرا عنها بنسبة النيوكليوتيدات المتحورة) في الحمض النووي الريبي الفيروسي المشتق من المكتبات و pJFH1 النسيلي (الشكل 1B والشكل 4).

4. نقل الحمض النووي الريبي الفيروسي لخط خلية Huh7.5

ملاحظة: استخدم مواد زراعة الأنسجة الخالية من RNase / DNase واعمل في خزانة معقمة للسلامة البيولوجية من الفئة الثانية. العمل في مرفق الاحتواء الموصى به وفقا لإرشادات السلامة البيولوجية للمنظمة.

1. الحفاظ على خلايا Huh7.5 عن طريق الحضانة في حاضنة CO₂ بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية في دورق زراعة الأنسجة T75 سم² يحتوي على 15 مل من وسط النسر المعدل الكامل من Dulbecco (DMEM) المكمل ب 10٪ (حجم / حجم) مصل بقري جنيني ، بنسلين (100 وحدة / مل) ، وستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل ؛ الشكل 1 د).
2. قم بتقسيم الخلايا بنسبة 1: 3 عندما يصل الالتقاء إلى 90٪. اغسل الخلايا بمحلول ملحي مسخن بالفوسفات 1x (PBS ؛ درجة الحموضة 7.4). أضف 5 مل من محلول 1x trypsin-EDTA لتغطية طبقة الخلية بالكامل ، وقم بتدوير القارورة برفق ، ثم احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   ملاحظة: قد يختلف وقت الحضانة. احتضان الخلايا حتى يتم فصل طبقة الخلية تماما عن سطح قارورة زراعة الخلايا.
3. أضف 10 مل من 1x DMEM الكامل المسخن مسبقا ، وقم بتفريق الخلايا عن طريق تكرار السحب ، واجمع تعليق الخلية في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل أو 50 مل. جهاز طرد مركزي تعليق الخلية عند 252 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 6 مل من DMEM الكامل ، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة مع 5٪ CO₂.
4. للصيانة المستمرة لخلايا Huh7.5 الساذجة أو المنقولة أو المصابة بالفيروس ، كرر الخطوة 4.2. والخطوة 4.3.
5. قبل يوم واحد من النقل ، قم بتقسيم الخلايا كما هو موضح في الخطوات 4.1.-4.3 ، واحسب عدد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس الدم ، وزرع خلايا Huh7.5 بكثافة 0.6 × 10⁶ في أطباق 35 مم في 2 مل من DMEM الكامل ، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة مع 5٪ CO₂.
6. في اليوم التالي ، قم بإعداد مجمع الدهون النص. للقيام بذلك ، قم بتخفيف 10 ميكرولتر من كاشف النقل في 50 ميكرولتر من الحد الأدنى من الوسط الأساسي ، وقم بتخفيف 5 ميكروغرام من النسخ الفيروسية بشكل منفصل في 50 ميكرولتر من الحد الأدنى من الوسط الأساسي.
7. احتضان كلا الخليطين في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، ثم امزجهما في أنبوب طرد مركزي معقم واحد واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة لتشكيل مركب الدهون النسخة.
8. بعد 16 ساعة من حضانة الخلايا ، قم بإزالة وسط الاستزراع من طبق الاستزراع ، واغسل الخلايا 2x باستخدام 1x PBS المسخن مسبقا ، وأضف 1.5 مل من الحد الأدنى من الوسط الأساسي. أضف ببطء مركب الدهون النصية إلى الطبق وقم بتدوير اليدين برفق لضمان توزيع موحد للمجمعات.
9. احتضان الخلايا في حاضنة CO₂ 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 10 ساعات. بعد ذلك ، قم بإزالة الوسط ، واغسل الخلايا المنقولة 2x ب 1 مل من 1x PBS المسخن مسبقا ، وأضف 2 مل من DMEM الكامل.

5. إنتاج الفيروسات

1. قم بتقسيم خلايا Huh7.5 المنقولة كل يومين أو 3 أيام عندما تصل إلى التقاء 90٪. اجمع طاف الفيروس عند كل انقسام وقم بتخزينه في درجة حرارة -80 درجة مئوية لمزيد من التحليل.
2. في كل انقسام ، راقب انتشار الفيروس باستخدام مقايسة تشكيل التركيز (FFA) كما هو موضح في الخطوة 6.2. احصد الفيروس حتى يصل انتشار الفيروس إلى >80٪ من الخلايا المنقولة (الشكل 1 د).
   ملاحظة: قم بتقسيم الخلايا المنقولة بنسبة 1: 1 للمقاطع القليلة الأولى لإنقاذ أكبر عدد ممكن من المتغيرات الفيروسية. يتباطأ انتشار الفيروس وتقل قابلية البقاء مع زيادة نسب الطفرات في MLs الجينوم^{الكامل 2}.

6. القياس الكمي لعيارات الفيروس

1. القياس الكمي للحمض النووي الريبي الفيروسي
   1. اعزل الحمض النووي الريبي الفيروسي من 140 ميكرولتر من طاف الثقافة باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي الريبي الفيروسي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   2. قم بإعداد تفاعل qRT-PCR سعة 10 ميكرولتر باستخدام مجموعة qRT-PCR تجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استخدم التمهيدي الأمامي R6-130-S17 ، التمهيدي العكسي R6-290-R19 (التركيز النهائي 0.2 ميكرومتر لكل منهما) ، والمسبار R9-148-S21FT (التركيز النهائي 0.3 ميكرومتر) لقياس كمية HCV RNA (الجدول 3). اضبط ظروف التشغيل على 48 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، و 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم 45 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
      ملاحظة: يجب أن يحتوي المسبار على صبغة مراسل الفلورسنت 6-كربوكسي فلوريسئين (FAM) وصبغة التبريد 6-كربوكسي-رباعي ميثيل رودامين (TAMRA) عند نهايات 5 'و 3' ، على التوالي.
   3. قم بتشغيل ردود الفعل في جهاز PCR في الوقت الفعلي. إعداد ضوابط سلبية ، أي الحمض النووي الريبي المستخرج من طاف الخلايا المصابة وهمية والمياه الخالية من النيوكلياز في وقت واحد لضمان عدم وجود تلوث متبادل.
   4. في موازاة ذلك ، قم بإنشاء منحنى قياسي باستخدام عدد نسخ معروف مخفف بشكل متسلسل بمقدار 10 أضعاف من نسخ HCV (1 × 10⁸ إلى 0) لقياس كمية الحمض النووي الريبي الفيروسي. إجراء القياس الكمي في ثلاث نسخ (الشكل 1D).
2. القياس الكمي لعيار الفيروسات المعدية باستخدام جرعة معدية لزراعة الأنسجة بنسبة 50٪ (TCID₅₀)
   1. قبل حوالي 16 ساعة من إضافة الفيروس ، لوحة 6.5 × 10³ خلايا Huh7.5 / بئر في لوحة 96 بئر واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO₂ بنسبة 5٪.
   2. في خزانة السلامة الأحيائية من الفئة الثانية، قم بإجراء تخفيفات تسلسلية بمقدار 10 أضعاف (1 مل لكل منها) تغطي 1 × 10−¹ إلى 1 × 10⁻⁶ تخفيفات (ثمانية تخفيفات) للفيروس المحصود (يتم الحصول عليها عندما يصل انتشار الفيروس إلى >80٪ من الخلايا كما هو موضح في الخطوة 5). أضف 100 ميكرولتر / بئر (مع ثمانية تكرارات) من الفيروس المخفف لإصابة خلايا Huh7.5 والحفاظ على اللوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ لمدة 3 أيام.
   3. بعد 3 أيام ، اغسل الخلايا المصابة 3x ب 0.1 مل من PBS في كل مرة ، وقم بإصلاح الخلايا ونفاذها ب 0.1 مل من الميثانول المثلج البارد عند -20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. اغسل الآبار باستخدام 1x PBS 3x ثم 1x باستخدام PBS-T (1x PBS / 0.1٪ [v / v] Tween-20).
   4. بعد إزالة PBS-T ، قم بسد الخلايا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام 0.1 مل من 1٪ من ألبومين مصل الأبقار (BSA) الذي يحتوي على 0.2٪ حليب منزوع الدسم في PBST. قم بإزالة محلول الحجب وعالج الخلايا لمدة 5 دقائق باستخدام 0.1 مل من 3٪ H 2 O₂محضر في 1x PBS.
   5. مرة أخرى ، اغسل الخلايا 2x باستخدام 1x PBS و 1x باستخدام PBS-T ، ثم أضف 50 ميكرولتر / بئر من anti-NS5A 9E10 mAb (1: 10000 ، مخزون 1 مجم / مل ؛ هدية كريمة من تشارلز رايس ، جامعة روكفلر) ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. اغسل الآبار مرة أخرى 3x باستخدام 1x PBS و 1x باستخدام PBS-T.
   6. أضف 50 ميكرولتر / بئر من IgG الثانوي المضاد للفأر من الماعز المترافق HRP (1: 4000) ، واحتضانه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بإزالة الجسم المضاد غير المرتبط عن طريق غسل الآبار ب 0.1 مل من 1x PBS.
   7. أضف 30 ميكرولتر من الركيزة الملونة DAB (ديامينوبنزيدين رباعي هيدروكلوريد) واحتضن اللوحة بتأرجح لطيف لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تطور الركيزة راسبا بنيا على سطح البئر يشير إلى مستضد HCV NS5A. قم بإزالة محلول DAB واغسل الآبار 2x باستخدام 1x PBS و 1x بالماء المقطر. أضف 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.03٪ أزيد الصوديوم.
   8. افحص كل بئر تحت مجهر ضوئي مقلوب باستخدام هدف 10x. احسب عدد الآبار الإيجابية. إذا كان البئر يحتوي على واحد أو أكثر من الخلايا الإيجابية NS5A ، فهو إيجابي ؛ إذا أظهر البئر عدم وجود خلايا إيجابية NS5A ، فهذا يعني أنه سلبي. استخدم حاسبة Reed and Muench لتقدير تخفيف نقطة النهاية الذي يصيب 50٪ من الآبار (TCID₅₀) ^14,15. مقلوب التخفيف المطلوب لإنتاج TCID₅₀ هو عيار عدوى الفيروس (وحدات تشكيل البؤر) لكل وحدة حجم.
      ملاحظة: تختلف عيارات عدوى الفيروس باختلاف المكتبات الطافرة.

7. اختيار المتغير الفيروسي المقاوم للأدوية

1. قم بإذابة بيبرينتاسفير (PIB) ، وهو مثبط NS5A ، في DMSO بنسبة 100٪ إلى تركيز 1 mM وقم بتخفيفه في DMEM الكامل إلى تركيز 10 نانومتر.
2. لتحديد التركيز الفعال بنسبة 50٪ من PIB ، قم بزرع خلايا Huh7.5 بكثافة 0.6 × 10 6 / بئر في صفيحة ذات⁶ آبار واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO₂ بنسبة 5٪. بعد 16 ساعة من حضانة الخلايا ، أضف جرعة فيروس إما من ML50 أو فيروس JFH1 النسيلي لإصابة 50٪ من الخلايا ، وبعد ذلك ، في 12 ساعة بعد الإصابة (h p.i.) ، عالج الخلايا بسلسلة تخفيف ثنائية من PIB تتراوح من 0.5-100 pM. قم بقياس FFA وتحديد FFU كما في الخطوة 6.2. بعد 3 أيام من الحضانة.
3. ارسم منحنيات الجرعة والاستجابة باستخدام قيم مقايسة تقليل FFU في برنامج التحليل الإحصائي. من المنحنى السيني ، احصل على تركيز فعال بنسبة 50٪ (EC₅₀; الشكل 5).
   ملاحظة: قد يختلف نطاق التركيز الفعال اعتمادا على الفئة ، بين مضادات فيروسات التهاب الكبد C من نفس الفئة ، واعتمادا على مكتبة الطفرة.
4. بالنسبة للتجربة ، تصيب خلايا Huh7.5 الساذجة عند التقاء 70٪ بفيروس ML50 (المتغيرات المشتقة من ML50 RNA) جرعة لإصابة 50٪ من الخلايا لمدة 12 ساعة ، ثم نقل الخلايا المصابة إلى 6 لوحات جيدة بعد 24 ساعة من الإصابة.
5. أضف 1x EC₅₀ PIB (47.3 pM) إلى الخلايا المصابة بعد 16 ساعة من انقسام الخلية. افعل ذلك بعد انقسام كل خلية لمدة ستة مقاطع متتالية (18 يوما) ، تليها ثلاث دورات مرور خالية من المخدرات ، وراقب انتشار الفيروس باستخدام FFAs كما هو موضح في الخطوة 6.2. توسيع نطاق كواشف FFA حسب منطقة النمو. احصد الطافات الفيروسية في كل ممر واحفظها في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
   ملاحظة: يمكن تعريف الانتشار الفيروسي إلى أكثر من 50٪ من الخلايا أثناء متابعة العلاج على أنه اختراق ، ويمكن تعريف الانتشار الفيروسي خلال فترة انسحاب الدواء على أنه انتكاسة فيروسية¹⁶.
6. استخرج الحمض النووي الريبي الفيروسي من المادة الطافية في اليوم 18 ، كما هو موضح في الخطوة 6.1.1 ، ثم قم بتوليف cDNA ، كما هو موضح في الخطوة 3.1. تضخيم جين NS5A باستخدام 5 ميكرولتر من cDNA المخفف 1: 5 ومكونات تفاعل البوليميراز المتسلسل الموضحة في الخطوة 3.2. ثم اتبع الخطوات 3.3.-3.5. لتحديد طفرات مقاومة الأدوية NS5A في 6-8 بلازميدات بكتيرية إيجابية باستخدام بادئات تسلسل NS5A 6186F و 6862F و 6460R (الجدول 3 والجدول 4).
   ملاحظة: هنا في هذه الدراسة ، أبلغنا عن بدائل في NS5A للمتغيرات المختارة أثناء علاج PIB عند 1x EC₅₀. سيؤدي ذلك إلى استبعاد مساهمة البدائل بخلاف NS5A في تقليل القابلية للإصابة ب PIB.

النتائج

يمكن إنشاء عدد كبير من متغيرات HCV كاملة الطول وفحصها بحثا عن الأنماط الظاهرية المقاومة للأدوية ذات الأهمية باتباع الإجراءات الموضحة في الشكل 1. تم تصنيع مكتبات الجينوم الطافرة الكاملة باستخدام clnal-pJFH1 بكميات متناقصة (100-10 نانوغرام) ، كما هو موضح في الشكل 2. تر?...

Discussion

في هذه الدراسة ، قمنا بتفصيل إجراء FL-MRS بسيط وسريع يدمج ep-PCR¹⁸ وعلم الوراثة العكسي لتوليف مكتبات الجينوم الكامل HCV ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك في نظام زراعة الخلايا لتوليد متغيرات مختصة بالتكرار لفحص الأنماط الظاهرية المقاومة للأدوية. يعد استخدام Taq DNA polymerase منخفض الدقة شرطا ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb plus DNA ladder	Thermo Fisher	10787018
1.5 ml centrifuge tube	Tarsons	500010
15 ml centrifuge tube	Tarsons	546021
35 mm cell culture dish	Tarsons	960010
50 ml centrifuge tube	Tarsons	546041
Acetic acid	Merck	A6283
Agarose	HiMedia	MB080
Agrose gel electrophoresis unit	BioRad	1704406
Biosafety Cabinet, ClassII	ESCO	AC2 4S
Bovine serum albumin	HiMedia	MB083
Centrifuge	Eppendorf	5424-R
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	BioRad	1855201
Cloning plates 90 mm	Tarson	460091
CO2 Incubator	New Brunswick	Galaxy 170R
Colibri Microvolume Spectrometer	Titertek-Berthold	11050140
DAB Substrate Kit	Abcam	ab94665
dATP Solution	NEB	N0440S
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set	NEB	N0446
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC)	SRL chemical	46791
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	HiMedia	MB058
DMEM high glucose	Lonza	BE12-604F
EcoR1-HF	NEB	R3101
EDTA tetrasodium salt dihydrate	HiMedia	GRM4918
Ethidium Bromide	Amresco	X328
Fetal bovine serum	Gibco	26140079
Formaldehyde	Fishser Scientific	12755
Gel Documentation System	ALPHA IMAGER
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP	Thermo Fisher	A16066
Hydrogen peroxide 30%	Merck	107209
Inverted microscope	Nickon	ECLIPSE Ts2
LB broth	HiMedia	M1245
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher	116680270	transfection reagent
Mechanical Pipette Set	Eppendorf	3120000909
Methanol	Merck	106009
Micro Tips 0.2-10 µl	Tarsons	521000
Micro Tips 10 - 100 µl	Tarsons	521010
Micro Tips 200-1000 µl	Tarsons	521020
MOPS buffer	GeNei	3601805001730
Nonessential aminoacids (NEAA)	Gibco	11140050
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C404010	E.coli DH5α
Opti-MEM	Gibco	1105-021	minimal essential medium
PCR tubes 0.2 ml	Tarsons	510051
Pencillin/streptomycin	Gibco	15070063
pGEM-T Easy Vector System	Promega	A1360	T-vector DNA
Phosphate buffer saline (PBS)	HiMedia	TI1099
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0530S
Pibrentasvir	Cayman Chemical	27546
Pipette controller	Gilson	F110120
Platinum Taq DNA Polymerase	Thermo	10966034
Prism	GraphPad		statistical analysis software
QIAamp Viral RNA Mini kit	Qiagen	52904	viral isolation kit
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104	cokum purification kit
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104	RNA cleanup kit
Serological Pipettes 25 ml	Thermo Fisher	170357N
Serological Pipettes 5 ml	Thermo Fisher	170355N
Serological Pipettes10 ml	Thermo Fisher	170356N
Single strand RNA Marker 0.2-10 kb	Merck	R7020
Skim milk	HiMedia	M530
Sodium azide 0.1 M solution	Merck	8591
SuperScript III Reverse Transcriptase	Invitrogen	18080044	reverse transcriptase
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
T175 cell culture flask	Tarsons	159910
T25 cell culture flask	Tarsons	950040
T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System	Promega	P1320	Large Scale RNA Production System
T75 cell culture flask	Tarsons	950050
Taq DNA Polymerase	Genetix Biotech (Puregene)	PGM040
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit	Applied Biosystems	4392653
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit	Thermo Fisher	4392653	commercial qRT-PCR kit
TOPO-XL--2 Complete PCR Cloning Kit	Thermo Fisher	K8050-10	kit for cloning of long-PCR product
Tris base	HiMedia	TC072
Trypsin-EDTA solution	HiMedia	TCL007
Tween 20	HiMedia	MB067
Vacuum Concentrator	Eppendorf, Concentrator Plus	100248
Water bath	GRANT	JBN-18
Xba1	NEB	R0145S