ポジティブセンスRNAウイルス変異体を改変するためのリバースジェネティクス

要約

プロトコルは間違いが傾向があるPCRおよび逆の遺伝学を使用して完全長の突然変異体のRNAの統合の結合によって肝炎のウイルスのゲノムの制御可能な遺伝の多様性をもたらすための方法を記述する。この方法は、表現型選択のモデルを提供し、長さ10 kbのポジティブセンスRNAウイルスゲノムに使用できます。

要約

多様な完全長ウイルス変異体を繰り返し生成するための便利な方法の欠如は、RNAウイルスの指向性進化の研究を妨げてきました。フルRNAゲノムエラーを起こしやすいPCRとリバースジェネティクスを統合することで、ランダムなゲノムワイドな置換突然変異誘発を誘導することができます。私たちは、この手法を用いて多様なライブラリを合成し、目的の表現型を持つウイルス変異体を同定する方法を開発しました。完全長変異体RNA合成(FL-MRS)と呼ばれるこの方法は、次の利点を提供します:(i)非常に効率的なワンステップエラーを起こしやすいPCRを介して大規模なライブラリを作成する能力。(ii)DNAポリメラーゼの忠実度を操作することにより、さまざまなレベルの遺伝的多様性を有するライブラリのグループを作成する能力。(iii)変異体RNA合成の鋳型として直接役立つことができる完全長PCR産物の作成。(iv)所望の表現型のウイルス変異体をスクリーニングするための非選択インプットプールとして宿主細胞に送達できるRNAを作製する能力。我々は、逆遺伝学アプローチを用いて、FL-MRSがC型肝炎ウイルスであるJFH1分離株のライフサイクルのすべての段階でウイルス指向性進化を研究するための信頼できるツールであることを発見しました。この手法は、ポジティブセンスRNAウイルスの病因と抗ウイルス耐性における適応、複製、およびウイルス遺伝子の役割を理解するために、指向性進化を採用するための非常に貴重なツールであるように思われます。

概要

フォワード遺伝子スクリーニングは、目的のウイルス表現型から始まり、そのゲノム配列を決定し、元の株と比較することで、その表現型の原因となる変異を特定しようとします。対照的に、逆遺伝子スクリーニングでは、標的遺伝子にランダムな変異を導入し、その後、結果として生じる表現型を調べます¹。リバースジェネティクスアプローチでは、in vitro突然変異誘発は、その後、関心のある表現型についてスクリーニングされるバリアントのプールを作成するために最も広く使用されている手法です。RNAウイルスのゲノムワイドなランダム突然変異誘発を実現するために、エラーを起こしやすいPCR(ep-PCR)^2,3、環状ポリメラーゼ伸長⁴、ミュートランスポゾン挿入突然変異誘発5,6,7など、さまざまな遺伝的ツールが報告されています。後者の2つの方法では、配列の多様性が限られており、大きな挿入や欠失が発生しやすく、ウイルスにとって致死性が高く、感染性ウイルス変異体の回復を著しく制限します。

ep-PCRは、熱安定性、基質特異性、^{触媒活性の向上}など、所望の特性を持つ表現型を選択するための変異酵素を生成するために、タンパク質工学で広く使用されている有名な強力な突然変異誘発技術です8,9,10。この手法は、簡単な機器を必要とし、面倒な操作を必要とせず、市販の試薬を使用し、迅速であるため、実行が簡単です。さらに、高品質のライブラリを生成します。

本研究では、ゲノムワイドなランダム置換突然変異誘発とリバースジェネティクスを誘導するep-PCRを組み込んで、C型肝炎ウイルス(HCV)の全ゲノムを作製する完全長変異RNA合成法(FL-MRS)を開発しました。単一のヌクレオチドの挿入または欠失でさえ、ポジティブセンスRNAウイルス([+]ssRNA)にとって非常に有害です。したがって、PCRベースの置換突然変異誘発は、生存率の良いフル(+)ssRNAウイルスゲノムの大規模で多様なライブラリを繰り返し生成するための好ましい方法です。

FL-MRSは、ウイルスcDNAクローンに結合するプライマーセットの細心の注意を払った設計により、ゲノム長が~10 kbのポジティブセンスRNAウイルスに適用できる簡単なアプローチです。pJFH1は、HCV遺伝子型2aをコードする感染性cDNAクローンであり、ウイルスライフサイクルのすべてのステップを再現することができます。FL-MRSアプローチを用いて、ランダムに変異原化された全ゲノムライブラリー(変異体ライブラリー[ML])を合成し、変異に関連する特性に関する予備知識がなかった複製能力のあるJFH1変異体を作製することを実証しました。抗ウイルス薬に曝露すると、一部のウイルス変異体は、望ましい表現型の変化により、薬剤圧力を迅速に克服しました。ここで説明するプロトコルを使用すると、多数のウイルス変異体を生成することができ、(+)ssRNAウイルスの進化を研究する機会が生まれます。

プロトコル

(注)ここで使用したJFH1株(WT)は、国立感染症研究所の脇田隆治さんからのご厚意によるものです。ヒト肝細胞腫細胞株Huh7.5は、ロックフェラー大学のチャールズ・ライスからの親切な贈り物でした。この方法の概略図を 図1に示します。

1. エラーを起こしやすいPCRを用いたJFH1のゲノムワイド置換突然変異誘発

1. ep-PCRを実施するには、プライマーJ-For 5'-GTTTTCCCAGTCAGCACGTTGTAAAACGACGGC-3'およびJ-Rev 5'-CATGATCTGCAGAGACCAGTTACGGCACTCTC -3'(図1A)と、表 1 に記載の反応成分をpJFH1テンプレート(JFH1株から単離したプラスミド)を含まない状態で、4セットの実験用のマスターミックスを調製します。
2. マスターミックスを 4 本のチューブに分注し、100 ng、50 ng、25 ng、10 ng のテンプレートを個々のチューブに加え、反応液の総容量を 50 μL に調整します。 表 2 に記載のサイクリング条件を適用して、T7 プロモーターと完全長 HCV ゲノムからなる 9736 塩基対(bp)フラグメントを増幅します(図 2)。
   注:ep-PCR産物には、ウイルスゲノムの in vitro 転写を容易にするために、T7プロモーター配列が含まれている必要があります。したがって、フォワードプライマーはウイルスcDNAクローンのT7プロモーターの上流に位置しなければならず、リバースプライマー配列は転写流出を促進するためにウイルスゲノムの3'末端で終端する必要があります。Taq DNAポリメラーゼのメーカーが推奨する範囲内でep-PCR反応の各成分を最適化し、高収量増幅を実現します。さまざまなテンプレート量に加えて、不均衡なdNTP(特に低いdATPおよび/またはdGTP濃度)を使用して、ウイルスゲノムの長さの多様性を6〜8 kbに増やすこともできます³。
3. 等量のPCR産物(5 μL)をロードし、0.8%トリス-アセテート-EDTA(TAE)ベースのアガロースゲル電気泳動を実行して、既知の量の1キロベース(kb)DNAラダーと比較することによって増幅されたep-PCR産物を推定します¹¹。メーカーの指示に従って、カラム精製キットを使用して製品を精製します。
4. 微量分光光度計¹²を用いて260nmでの吸光度を測定することにより、精製物の濃度を推定する。必要に応じてep-PCR産物を真空濃縮し、産物濃度≥100 ng/μLを得ます。
   注:ep-PCR産物の2倍段階希釈液をロードし、その強度を既知の量の1 kb DNAラダーと比較することで、より正確な推定を行うことができます。

2. ウイルスRNA合成

1. 40 μL の反応液を 5 μg の Clonal-pJFH1 と 4 U の XbaI 酵素で 37 °C で 2 時間消化し、続いてカラム精製を行い、微量分光光度計で 260 nm の吸光度を測定します¹²。メーカーの指示に従い、市販の大規模RNA産生システムを用いて、カラム精製したep-PCR産物またはクローンpJFH1(WT)の in vitro 転写反応を20 μLセットアップします。
2. 200 μLの微量遠心チューブに、精製したep-PCR産物(変異体ライブラリ)または XbaI 消化クローンpJFH1 約1 μg、リボヌクレオチドを含む2xバッファー10 μL、およびT7酵素ミックス2 μLを混合します。すべての成分を混ぜ合わせ、簡単にスピンダウンします。反応混合物を37°Cで45分間インキュベートした後、1 U RNaseフリーDNase酵素を添加し、37°Cで30分間インキュベートします(図1C)。
3. メーカーの指示に従ってRNAクリーンアップキットを使用して in vitro 合成RNAを精製し、40μLのRNaseおよびDNaseフリー水で溶出し、微量分光光度計¹²を使用して260nmでの吸光度を測定することにより、精製されたRNAの濃度を推定する。必要に応じてアリコート(5 μgまたは2 μg)を調製し、凍結融解を避け、-80°Cで保存します。 MOPS ホルムアルデヒド 0.8% アガロースゲル電気泳動に 2 μg の RNA を使用して、ウイルス転写産物の完全性とサイズを検証します¹³ (図 3)。

3. ep-PCR産物(変異体ライブラリー)における変異割合の推定

注:このステップでは、ステップ2で得られた産物をサブクローニングすることによって変異したヌクレオチドの割合。は、2つの全ゲノム変異体ライブラリ(ML50およびML25)およびクローンpJFH1由来ウイルスRNAを使用して遺伝的不均一性を作成するためにep-PCRを採用することの利点を実証すると推定されました。変異の割合は、本研究の表現型読み出し遺伝子(薬剤耐性)でもあるHCV NS5A遺伝子で推定された。

1. ステップ2で合成したウイルスRNA約1 μg、5 μMリバースプライマー5'-GTGTACCTAGTGTGTGCCGCTCTA-3'、および200 U逆転写酵素をメーカーの推奨に従って添加して、20 μLのcDNA合成反応をセットアップします。
2. cDNAを使用して、完全なNS5A遺伝子を構成する2571 bpフラグメントを増幅します。これを行うには、5272Fおよび7848Rプライマー(最終濃度; 表3)、1.5 mM MgCl₂、1x PCR バッファー、および 1 U ハイフィデリティ Taq ポリメラーゼを総容量 50 μL で、 表 4 に記載の条件を使用して増幅サイクルを実行します。
3. 0.8% TAE ベースのアガロースゲルで分析して 2571 bp の製品サイズを確認し、メーカーの指示に従ってカラム精製キットを使用して製品を精製します。カラム精製物を40μLの滅菌水に溶出します。
4. 産物に 3' A オーバーハングを追加するには、0.5 μM の dATP と 1 U の低忠実度の Taq DNA ポリメラーゼを添加し、1 x PCR バッファーおよび 1.5 mM MgCl₂ (最終濃度) とともに、PCR 産物全体を 70 °C で 30 分間インキュベートします。メーカーの指示に従って、カラム精製キットを使用して混合物を精製します
   注:または、ステップ1.4のゲルから~9.7 kbの長さの製品を切除します。メーカーの指示に従って、ロングPCR産物のクローニング用の市販のキットを使用してクローニングを行うか、Illumina^{プラットフォームを使用して}ep-PCR産物のNGSを実行します2。
5. 5 μL の 2x ライゲーションバッファー、50 ng の T ベクター DNA、ステップ 3.4 で合成したインサート DNA の約 3 倍モル過剰、3 Weiss 単位の T4 DNA リガーゼ、およびヌクレアーゼフリー水を総容量 10 μL まで添加して、ライゲーション反応を開始します。 この反応液を室温で3時間インキュベートし、ライゲーションしたDNAに大 腸菌 DH5αを100 μL添加します。セルを42°Cで35秒間ヒートショックします(図1B)。
6. 1 mLのLuria-Bertani(LB)培地(抗生物質なし)を加え、37°Cで1時間穏やかに振とうしながらインキュベートして回収します。細胞懸濁液を13,800 x gで遠心分離し、上清を廃棄し、200 μLの新鮮なLB培地に再懸濁します。
7. 形質転換した 大腸菌 DH5α細胞100 μLを50 μg/mLのアンピシリンを含むLBプレートに播種し、37°Cで16時間インキュベートします。5 mLのLB培地+ 50 μg/mLのアンピシリンに25〜30コロニーのミニプレップを設置し、37°Cで一晩増殖させます。
8. 翌日、メーカーの指示に従ってプラスミド精製キットでプラスミドを抽出し、すべてのコロニーについて、単離したプラスミド200 ng、 EcoR1 2 U、および制限バッファー1xを含む10 μLの容量で制限酵素消化を行います。
9. 消化混合物を37°Cで3時間インキュベートした後、0.8%TAEベースのアガロースゲルで生成物を分離し、プラスミドDNAの挿入を確認します。
10. M13 Forward、M13 reverse、6208-SPF、および 6748-SPF プライマー(表 3)を使用して、25 個の陽性クローンのプラスミドのサンガーシーケンシングを行い、ライブラリおよびクローン pJFH1 に由来するウイルス RNA の変異の割合(変異したヌクレオチドの割合として表される)を決定します(図 1B および 図 4)。

4. Huh7.5細胞株のウイルスRNAトランスフェクション

注:RNase/DNaseフリーの組織培養材料を使用し、滅菌クラスIIのバイオセーフティキャビネットで作業してください。組織のバイオセーフティガイドラインに従って、推奨される封じ込め施設で作業します。

1. 10%(vol/vol)ウシ胎児血清、ペニシリン(100 U/mL)、およびストレプトマイシン(100 μg/mL;図1D)。
2. コンフルエントが90%に達したら、セルを1:3の比率で分割します。1x予熱したリン酸緩衝生理食塩水(PBS;pH 7.4)で細胞を洗浄します。5 mLの1x trypsin-EDTA溶液を添加して細胞層を完全に覆い、フラスコを静かに渦巻きさせた後、フラスコを37°Cで5分間インキュベートします。
   注:インキュベーション時間は異なる場合があります。細胞層が細胞培養フラスコ表面から完全に剥離するまで、細胞をインキュベートします。
3. 10 mLの予熱済み完全DMEMを添加し、ピペッティングを繰り返して細胞を分散させ、細胞懸濁液を15 mLまたは50 mLの滅菌遠心チューブに回収します。細胞懸濁液を室温で252 x gで5分間遠心分離します。上清を廃棄し、細胞ペレットを6 mLの完全DMEMに再懸濁し、5%_CO2を含む加湿インキュベーターで37°Cで細胞をインキュベートします。
4. ナイーブ細胞、トランスフェクション細胞、またはウイルス感染したHuh7.5細胞を継続的に維持するには、手順4.2を繰り返します。ステップ4.3。
5. トランスフェクションの1日前に、ステップ4.1〜4.3.に記載のとおりに細胞を分割し、血球計算盤を用いて生細胞の数をカウントし、Huh7.5細胞を2mLの完全DMEM中に35mmディッシュに0.6×10⁶ の密度で播種し、5%_CO2を含む加湿インキュベーター中で37°Cで細胞をインキュベートする。
6. 翌日、転写産物-脂質複合体を調製します。これを行うには、トランスフェクション試薬10 μLを50 μLのミニマルエッセンシャル培地で希釈し、5 μgのウイルス転写産物を50 μLのミニマルエッセンシャル培地で別々に希釈します。
7. 両方の混合物を室温で10分間インキュベートし、次にそれらを単一の滅菌微量遠心チューブで混合し、さらに室温で30分間インキュベートして転写産物-脂質複合体を形成します。
8. 細胞インキュベーションの16時間後、培養皿から培地を取り出し、予熱した1x PBSで細胞を2回洗浄し、1.5 mLの最小限の必須培地を加えます。転写産物-脂質複合体を皿にゆっくりと加え、手で静かに渦巻かせて、複合体が均一に分布するようにします。
9. 細胞を5%_CO2 インキュベーターで37°Cで10時間インキュベートします。次に、培地を除去し、トランスフェクションした細胞を予熱した1x PBS1 mLで2回洗浄し、2 mLの完全DMEMを加えます。

5.ウイルス産生

1. トランスフェクションしたHuh7.5細胞を2日ごとまたは3日ごとに90%のコンフルエントに達したら分割します。スプリットごとにウイルス上清を回収し、-80°Cで保存してさらに分析します。
2. 分割ごとに、ステップ6.2で説明したように、焦点形成アッセイ(FFA)を使用してウイルスの拡散を監視します。ウイルスの拡散がトランスフェクションされた細胞の>80%に達するまでウイルスを回収します(図1D)。
   注:トランスフェクションした細胞を最初の数継代の比率で1:1の比率で分割し、最大数のウイルス変異体を救出します。ウイルスの拡散は遅くなり、生存率は、全ゲノムMLの突然変異の割合が増加すると^{低下します2}。

6. ウイルス力価の定量化

1. ウイルスRNAの定量
   1. メーカーの指示に従って、ウイルス RNA 分離キットを使用して、140 μL の培養上清からウイルス RNA を単離します。
   2. メーカーの指示に従って、市販のqRT-PCRキットを使用して10 μLのqRT-PCR反応をセットアップします。HCV RNAの定量には、フォワードプライマーR6-130-S17、リバースプライマーR6-290-R19(各最終濃度0.2 μM)、プローブR9-148-S21FT(最終濃度0.3 μM)を使用します(表3)。運転条件を48°Cで20分、95°Cで10分、95°Cで15秒、60°Cで1分を45サイクルします。
      注:プローブには、蛍光レポーター色素である6-カルボキシフルオレセイン(FAM)とクエンチャー色素である6-カルボキシ-テトラメチル-ローダミン(TAMRA)がそれぞれ5'末端と3'末端に含まれている必要があります。
   3. リアルタイムPCRマシンで反応を実行します。ネガティブコントロール、すなわち、模擬感染細胞の上清から抽出したRNAとヌクレアーゼフリーの水を同時にセットアップして、クロスコンタミネーションが起こらないようにします。
   4. 並行して、ウイルス RNA の定量のために、10 倍段階希釈した既知のコピー数の HCV 転写産物(1 x 10⁸ から 0)を使用して検量線を作成します。定量を 3 回に分けて行います(図 1D)。
2. 50%組織培養感染線量(TCID₅₀)を用いた感染性ウイルス力価の定量化
   1. ウイルスを添加する約16時間前に、6.5 x 10³ Huh7.5細胞/ウェルを96ウェルプレートに播種し、5%_CO2 インキュベーターで37°Cで細胞をインキュベートします。
   2. バイオセーフティークラスIIキャビネットで、採取したウイルス(ステップ5で説明したように、ウイルスの拡散が細胞の>80%に達したときに得られる)の1 x 10-1〜1 x ^10-6希釈(8希釈)をカバーする10倍連続希釈(各¹ mL)を実行します。希釈したウイルスを100 μL/ウェル(8回繰り返し)添加してHuh7.5細胞に感染させ、プレートを5%_CO2を含む37°Cのインキュベーターで3日間保持します。
   3. 3日後、感染細胞を毎回0.1 mLのPBSで3回洗浄し、0.1 mLの氷冷メタノールで-20°Cで20分間細胞を固定および透過処理します。ウェルを1x PBS 3xで洗浄し、次にPBS-T(1x PBS/0.1% [v/v] Tween-20)で1x洗浄します。
   4. PBS-Tを除去した後、PBSTに0.2%脱脂乳を含む0.1 mLの1%ウシ血清アルブミン(BSA)で細胞を室温で30分間ブロックします。ブロッキング溶液を除去し、1x PBSで調製した0.1mLの3%H 2O₂で細胞を5分間処理します。
   5. 再度、細胞を1x PBSで2回、PBS-Tで1回洗浄し、50 μL/ウェルの抗NS5A 9E10 mAb(1:10000、ストック1 mg/mL、ロックフェラー大学のCharles Riceからの親切な贈り物)を加え、室温で1時間インキュベートします。ウェルを1x PBSで3回、PBS-Tで1回洗浄します。
   6. 50 μL/ウェルのHRP標識ヤギ抗マウス二次IgG(1:4000)を添加し、室温で30分間インキュベートした後、0.1 mLの1x PBSでウェルを洗浄して未結合抗体を除去します。
   7. 30 μLのDAB(ジアミノベンジジン四塩酸塩)カラー基質を加え、室温で10分間穏やかに揺動しながらプレートをインキュベートします。基質は、HCV NS5A抗原を示すウェル表面に茶色の沈殿物を発生させます。DAB溶液を取り除き、ウェルを1x PBSで2回、蒸留水で1回洗浄します。0.03%アジ化ナトリウムを含むPBSを100 μL添加します。
   8. 10倍の対物レンズを使用して、倒立光学顕微鏡で各ウェルを調べます。正の井戸の数を数えます。ウェルに1つ以上のNS5A陽性細胞が含まれている場合、それは陽性です。ウェルにNS5A陽性細胞が存在しないことが示されている場合、それは陰性です。リードとミュンチの計算機を使用して、ウェルの50%(TCID₅₀)に感染するエンドポイントの希釈率を推定します^14,15。TCID₅₀を生成するのに必要な希釈液の逆数は、単位体積あたりのウイルス感染力価(病巣形成単位)です。
      注:ウイルス感染力価は、変異体ライブラリによって異なります。

7. 薬剤耐性ウイルス変異株の選抜

1. NS5A阻害剤であるピブレンタスビル(PIB)を100%DMSOに1 mMの濃度に溶解し、さらに完全DMEMで10 nMの濃度に希釈します。
2. PIBの50%有効濃度を決定するには、Huh7.5細胞を0.6 x 10 6/ウェルの密度で⁶ウェルプレートに播種し、5%_CO2 インキュベーターで37°Cで細胞をインキュベートします。16時間の細胞インキュベーション後、ML50またはクローンJFH1ウイルスのいずれかのウイルス用量を追加して細胞の50%に感染させ、感染後12時間(h p.i.)に、0.5〜100pMの範囲のPIBの2倍希釈シリーズで細胞を処理します。ステップ6.2のようにFFAを測定し、FFUを定量化します。3日間の潜伏後。
3. 統計解析ソフトウェアでFFU削減アッセイ値を使用して用量反応曲線をプロットします。シグモイド曲線から、50%有効濃度(EC₅₀; 図5)。
   注:有効濃度範囲は、クラス、同じクラスのHCV抗ウイルス薬間、および変異体ライブラリによって異なる場合があります。
4. 実験では、ナイーブHuh7.5細胞をML50ウイルス(ML50 RNA由来の変異体)の用量で70%のコンフルエンスで感染させ、細胞の50%に12時間感染させ、感染後24時間で感染した細胞を6ウェルプレートに移します。
5. 16時間の細胞分裂後、感染細胞に1x EC₅₀ PIB(47.3 pM)を加えます。これを、6回連続して継代(18日間)すべての細胞が分裂した後、その後3回の薬物フリー継代サイクルを行い、ステップ6.2で説明したようにFFAを使用してウイルスの拡散をモニターします。成長分野に応じてFFA試薬をスケールアップします。各継代でウイルス上清を回収し、使用するまで-80°Cで保存します。
   注:治療フォローアップ中の細胞の50%を超えるウイルスの拡散はブレークスルーとして定義され、薬物離脱期間中のウイルスの拡散はウイルスの再発として定義される場合があります¹⁶。
6. ステップ6.1.1で説明したように、18日目に上清からウイルスRNAを抽出し、ステップ3.1に示すようにcDNAを合成します。5 μL の 1:5 希釈 cDNA とステップ 3.2 で説明した PCR 成分を使用して NS5A 遺伝子を増幅します。次に、手順3.3.-3.5に従います。NS5Aシーケンシングプライマー6186F、6862F、および6460Rを用いて、6〜8個の陽性細菌プラスミドにおけるNS5A薬剤耐性変異を決定する(表3 および 表4)。
   注:この研究では、1x EC₅₀でのPIB治療中に選択されたバリアントのNS5Aの置換を報告しました。これにより、PIBに対する感受性の低下におけるNS5A以外の置換の寄与が除外されます。

結果

多数の完全長HCV多様体を作製し、 図1に記載の手順に従って目的の薬剤耐性表現型をスクリーニングすることができる。全ゲノム変異体ライブラリーは、 図2に示すように、Clonnal-pJFH1を用いて量を減らして(100-10 ng)合成しました。ep-PCR産物(変異体ライブラリ)の平均収量は3.8-12.5 ng/μLの範囲でした。 図3 に、クローンpJFH1と代?...

ディスカッション

この研究では、HCV全ゲノムライブラリを合成するためにep-PCR¹⁸ とリバースジェネティクスを統合し、細胞培養システムで使用して、薬剤耐性表現型のスクリーニングのための複製可能なバリアントを生成できる、シンプルで迅速なFL-MRS手順を詳しく説明しました。低忠実度のTaq DNAポリメラーゼの使用は、完全長ウイルスゲノムのPCR増幅中に置換の取り込みを可能にするep-PCR...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb plus DNA ladder	Thermo Fisher	10787018
1.5 ml centrifuge tube	Tarsons	500010
15 ml centrifuge tube	Tarsons	546021
35 mm cell culture dish	Tarsons	960010
50 ml centrifuge tube	Tarsons	546041
Acetic acid	Merck	A6283
Agarose	HiMedia	MB080
Agrose gel electrophoresis unit	BioRad	1704406
Biosafety Cabinet, ClassII	ESCO	AC2 4S
Bovine serum albumin	HiMedia	MB083
Centrifuge	Eppendorf	5424-R
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	BioRad	1855201
Cloning plates 90 mm	Tarson	460091
CO2 Incubator	New Brunswick	Galaxy 170R
Colibri Microvolume Spectrometer	Titertek-Berthold	11050140
DAB Substrate Kit	Abcam	ab94665
dATP Solution	NEB	N0440S
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set	NEB	N0446
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC)	SRL chemical	46791
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	HiMedia	MB058
DMEM high glucose	Lonza	BE12-604F
EcoR1-HF	NEB	R3101
EDTA tetrasodium salt dihydrate	HiMedia	GRM4918
Ethidium Bromide	Amresco	X328
Fetal bovine serum	Gibco	26140079
Formaldehyde	Fishser Scientific	12755
Gel Documentation System	ALPHA IMAGER
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP	Thermo Fisher	A16066
Hydrogen peroxide 30%	Merck	107209
Inverted microscope	Nickon	ECLIPSE Ts2
LB broth	HiMedia	M1245
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher	116680270	transfection reagent
Mechanical Pipette Set	Eppendorf	3120000909
Methanol	Merck	106009
Micro Tips 0.2-10 µl	Tarsons	521000
Micro Tips 10 - 100 µl	Tarsons	521010
Micro Tips 200-1000 µl	Tarsons	521020
MOPS buffer	GeNei	3601805001730
Nonessential aminoacids (NEAA)	Gibco	11140050
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C404010	E.coli DH5α
Opti-MEM	Gibco	1105-021	minimal essential medium
PCR tubes 0.2 ml	Tarsons	510051
Pencillin/streptomycin	Gibco	15070063
pGEM-T Easy Vector System	Promega	A1360	T-vector DNA
Phosphate buffer saline (PBS)	HiMedia	TI1099
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0530S
Pibrentasvir	Cayman Chemical	27546
Pipette controller	Gilson	F110120
Platinum Taq DNA Polymerase	Thermo	10966034
Prism	GraphPad		statistical analysis software
QIAamp Viral RNA Mini kit	Qiagen	52904	viral isolation kit
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104	cokum purification kit
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104	RNA cleanup kit
Serological Pipettes 25 ml	Thermo Fisher	170357N
Serological Pipettes 5 ml	Thermo Fisher	170355N
Serological Pipettes10 ml	Thermo Fisher	170356N
Single strand RNA Marker 0.2-10 kb	Merck	R7020
Skim milk	HiMedia	M530
Sodium azide 0.1 M solution	Merck	8591
SuperScript III Reverse Transcriptase	Invitrogen	18080044	reverse transcriptase
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
T175 cell culture flask	Tarsons	159910
T25 cell culture flask	Tarsons	950040
T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System	Promega	P1320	Large Scale RNA Production System
T75 cell culture flask	Tarsons	950050
Taq DNA Polymerase	Genetix Biotech (Puregene)	PGM040
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit	Applied Biosystems	4392653
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit	Thermo Fisher	4392653	commercial qRT-PCR kit
TOPO-XL--2 Complete PCR Cloning Kit	Thermo Fisher	K8050-10	kit for cloning of long-PCR product
Tris base	HiMedia	TC072
Trypsin-EDTA solution	HiMedia	TCL007
Tween 20	HiMedia	MB067
Vacuum Concentrator	Eppendorf, Concentrator Plus	100248
Water bath	GRANT	JBN-18
Xba1	NEB	R0145S