JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Protokol, hataya açık PCR ve ters genetik kullanarak tam uzunlukta mutant RNA sentezini birleştirerek hepatit C virüsü genomunda kontrol edilebilir genetik çeşitliliği tanıtmak için bir yöntemi açıklar. Yöntem, fenotip seçimi için bir model sağlar ve 10 kb uzunluğunda pozitif anlamlı RNA virüs genomları için kullanılabilir.

Özet

Çeşitli tam uzunlukta viral varyantların yinelemeli üretimi için uygun bir yöntemin olmaması, RNA virüslerinde yönlendirilmiş evrim çalışmasını engellemiştir. Tam bir RNA genomu hataya eğilimli PCR ve ters genetiği entegre ederek, rastgele genom çapında ikame mutajenezi indüklenebilir. İlgilenilen fenotiplere sahip viral mutantları tanımlamak için çeşitli kütüphaneleri sentezlemek için bu tekniği kullanan bir yöntem geliştirdik. Tam uzunlukta mutant RNA sentezi (FL-MRS) olarak adlandırılan bu yöntem aşağıdaki avantajları sunar: (i) yüksek verimli, tek adımlı hataya eğilimli bir PCR aracılığıyla büyük bir kütüphane oluşturma yeteneği; (ii) DNA polimerazın aslına uygunluğunu manipüle ederek farklı seviyelerde genetik çeşitliliğe sahip kütüphane grupları oluşturma yeteneği; (iii) mutant RNA sentezi için doğrudan bir şablon görevi görebilecek tam uzunlukta bir PCR ürününün oluşturulması; ve (iv) istenen fenotipteki viral mutantları taramak için seçilmemiş bir girdi havuzu olarak konakçı hücrelere iletilebilen RNA oluşturma yeteneği. Ters genetik bir yaklaşım kullanarak, FL-MRS'nin hepatit C virüsü, JFH1 izolatının yaşam döngüsünün tüm aşamalarında viral yönelimli evrimi incelemek için güvenilir bir araç olduğunu bulduk. Bu teknik, pozitif anlamlı RNA virüslerinde adaptasyon, replikasyon ve viral genlerin patogenez ve antiviral dirençteki rolünü anlamak için yönlendirilmiş evrimi kullanmak için paha biçilmez bir araç gibi görünmektedir.

Giriş

İleri genetik tarama, ilgilenilen viral bir fenotiple başlar ve daha sonra genomunu dizileyerek ve orijinal suşunkiyle karşılaştırarak, bu fenotipe neden olan mutasyonları tanımlamaya çalışır. Buna karşılık, ters genetik taramalarda, bir hedef gende rastgele mutasyonlar ortaya çıkar ve ardından ortaya çıkan fenotip(ler)in incelenmesi sağlanır1. Ters genetik yaklaşımı için, in vitro mutajenez, daha sonra ilgilenilen fenotipler için taranan bir varyant havuzu oluşturmak için en yaygın kullanılan tekniktir. Hataya eğilimli PCR (ep-PCR)2,3, dairesel polimeraz uzantısı 4 ve Mu-transpozon ekleme mutajenezi 5,6,7 dahil olmak üzere RNA virüslerinin genom çapında rastgele mutajenezini elde etmek için çeşitli genetik araçlar bildirilmiştir. Son iki yöntem, sınırlı dizi çeşitliliği barındıran kütüphaneler sağlar ve virüsler için oldukça öldürücü olan ve bulaşıcı viral varyantların iyileşmesini ciddi şekilde sınırlayan büyük ekleme ve silmelerin ortaya çıkmasına eğilimlidir.

ep-PCR, gelişmiş termal stabilite, substrat özgüllüğü ve katalitik aktivitegibi istenen özelliklere sahip fenotiplerin seçimi için mutant enzimler üretmek üzere protein mühendisliğinde yaygın olarak kullanılan iyi bilinen güçlü bir mutajenez tekniğidir 8,9,10. Bu tekniğin uygulanması kolaydır çünkü basit ekipman gerektirir, sıkıcı manipülasyonlar içermez, piyasada bulunan reaktifleri kullanır ve hızlıdır; Ayrıca, yüksek kaliteli kütüphaneler oluşturur.

Burada, rastgele genom çapında ikame mutajenezi ve ters genetiği indükleyen ep-PCR'yi entegre ederek hepatit C virüsünün (HCV) tam genomlarını oluşturmak için tam uzunlukta mutant RNA sentezi (FL-MRS) için yeni bir yöntem geliştirdik. Tek bir nükleotid eklenmesi veya silinmesi bile pozitif anlamlı RNA virüsleri ([+]ssRNA) için oldukça zararlıdır; bu nedenle, PCR tabanlı ikame mutajenezi, iyi canlılığa sahip tam (+)ss RNA virüsü genomlarının büyük, çeşitli kütüphanelerinin yinelemeli üretimi için tercih edilen yöntemdir.

FL-MRS, viral cDNA klonuna bağlanan bir primer setinin titiz tasarımı yoluyla ~10 kb genom uzunluğuna sahip herhangi bir pozitif anlamlı RNA virüsüne uygulanabilen basit bir yaklaşımdır. pJFH1, HCV genotip 2a'yı kodlayan ve virüs yaşam döngüsünün tüm adımlarını özetleyebilen bulaşıcı bir cDNA klonudur. FL-MRS yaklaşımını kullanarak, mutasyonlarla ilişkili özellikler hakkında önceden bilgi sahibi olmayan, replikasyona yetkin JFH1 varyantları üretmek için rastgele mutajenize edilmiş tam genom kütüphanelerinin (mutant kütüphaneler [ML'ler]) sentezini gösterdik. Bir antiviral'e maruz kaldıktan sonra, bazı viral varyantlar, istenen fenotipik değişiklikle ilaç baskısının üstesinden hızla geldi. Burada açıklanan protokol kullanılarak, (+)ssRNA virüslerinin evrimini incelemek için fırsatlar yaratan çok sayıda viral varyant oluşturulabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

NOT: Burada kullanılan JFH1 suşu (WT), Ulusal Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü'nden Takaji Wakita'nın nazik bir hediyesiydi. İnsan hepatom hücre hattı, Huh7.5, Rockefeller Üniversitesi'nden Charles Rice'ın nazik bir armağanıydı. Yöntemin bir şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. Hataya açık PCR kullanılarak JFH1'in genom çapında ikame mutajenezi

  1. ep-PCR gerçekleştirmek için, ana karışımı 5'-GTTTTCCCAGTCAGCACGTTGTAAAACGACGGC-3' ve J-Rev 5'-CATGATCTGCAGAGAGACCAGTTACGGCACTCTC -3' primerleri ile dört set deney için hazırlayın (Şekil 1A), pJFH1 şablonu olmadan Tablo 1'de açıklanan reaksiyon bileşenleri (JFH1 suşundan izole edilen plazmit) ile birlikte.
  2. Ana karışımı dört tüpe ayırın, tek tek tüplere 100 ng, 50 ng, 25 ng ve 10 ng şablon ekleyin ve reaksiyonun toplam hacmini 50 μL'ye ayarlayın. T7 promotörü ve tam uzunlukta HCV genomunu içeren bir 9736 baz çifti (bp) fragmanını amplifiye etmek için Tablo 2'de açıklanan döngü koşullarını uygulayın (Şekil 2).
    NOT: ep-PCR ürünü, viral genomun in vitro transkripsiyonunu kolaylaştırmak için T7 promotör dizisini içermelidir. Bu nedenle, ileri primer, viral cDNA klonunun T7 promotörünün yukarı akışına yerleştirilmeli ve ters primer dizisi, transkripsiyon akışını kolaylaştırmak için virüs genomunun 3' ucunda sona ermelidir. Yüksek verimli amplifikasyon elde etmek için ep-PCR reaksiyonunun her bir bileşenini Taq DNA polimeraz üreticisi tarafından önerilen aralıkta optimize edin. Çeşitli şablon miktarlarına ek olarak, dengesiz dNTP'ler (özellikle düşük dATP ve/veya dGTP konsantrasyonu), viral genomların uzunluğundaki çeşitliliği 6-8 kb uzunluğundan artırmak için de kullanılabilir3.
  3. Eşit hacimlerde PCR ürünleri (5 μL) yükleyerek ve %0,8 Tris-asetat-EDTA (TAE) bazlı agaroz jel elektroforezi çalıştırarak bilinen 1 kilobaz (kb) DNA merdiveni miktarlarıyla karşılaştırarak amplifiye edilen ep-PCR ürününü tahmin edin11. Ürünü, üretici tarafından belirtildiği şekilde bir kolon arıtma kiti kullanarak arındırın.
  4. Bir mikrohacim spektrofotometresi12 kullanarak 260 nm'de absorbansı ölçerek saflaştırılmış ürünün konsantrasyonunu tahmin edin. ≥100 ng/μL'lik bir ürün konsantrasyonu elde etmek için gerekirse ep-PCR ürününü vakumla konsantre edin.
    NOT: ep-PCR ürününün iki katlı seri dilüsyonları yüklenerek ve yoğunlukları bilinen 1 kb DNA merdiveni miktarlarıyla karşılaştırılarak daha doğru tahmin yapılabilir.

2. Viral RNA sentezi

  1. 2 saat boyunca 37 ° C'de 4 U XbaI enzimi ile 5 μg klonal-pJFH1'i sindirmek için 40 μL'lik bir reaksiyon ayarlayın, ardından kolon saflaştırması ve bir mikrohacim spektrofotometresinde 260 nm'de absorbansı ölçme12. Üreticinin talimatlarına göre ticari olarak temin edilebilen büyük ölçekli bir RNA üretim sistemi kullanarak kolonla saflaştırılmış ep-PCR ürününün veya klonal-pJFH1'in (WT) 20 μL'lik bir in vitro transkripsiyon reaksiyonunu ayarlayın.
  2. 200 μL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde, yaklaşık 1 μg saflaştırılmış ep-PCR ürünü (mutant kütüphaneler) veya XbaI sindirilmiş klonal-pJFH1, 10 μL ribonükleotid içeren 2x tampon ve 2 μL T7 enzim karışımı karıştırın. Tüm bileşenleri karıştırın ve bileşenleri kısaca döndürün. Reaksiyon karışımını 37 °C'de 45 dakika inkübe edin, ardından 1 U RNaz içermeyen DNaz enzimi ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin (Şekil 1C).
  3. Üreticinin talimatlarına göre bir RNA temizleme kiti kullanarak in vitro sentezlenmiş RNA'yı saflaştırın, 40 μL RNaz ve DNaz içermeyen suda elüte edin ve bir mikrohacim spektrofotometresi12 kullanarak 260 nm'de absorbansı ölçerek saflaştırılmış RNA'nın konsantrasyonunu tahmin edin. Donma-çözülmeyi önlemek için gerektiği gibi (5 μg veya 2 μg) alikotlar yapın ve bunları −80 °C'de saklayın. MOPS formaldehit %0.8 agaroz jel elektroforezi13 için 2 μg RNA kullanarak viral transkriptlerin bütünlüğünü ve boyutunu doğrulayın (Şekil 3).

3. ep-PCR ürünlerindeki mutasyon oranının tahmini (mutant kütüphaneler)

NOT: Bu adımda, 2. adımda elde edilen ürünün alt klonlanmasıyla mutasyona uğrayan nükleotidlerin oranı. iki tam genom mutant kütüphanesi (ML50 ve ML25) ve klonal pJFH1'den türetilmiş viral RNA'lar kullanılarak genetik heterojenlik oluşturmak için ep-PCR kullanmanın avantajını gösterdiği tahmin edilmektedir. Mutasyonların oranı, bu çalışmada aynı zamanda fenotipik okuma geni (ilaç direnci) olan HCV NS5A geninde tahmin edildi.

  1. Adım 2'de sentezlenen yaklaşık 1 μg viral RNA, üreticinin tavsiyelerine göre 5 μM ters primer 5'-GTGTACCTAGTGTGCCGCTCTA-3' ve 200 U ters transkriptaz ekleyerek 20 μL'lik bir cDNA sentez reaksiyonu oluşturun.
  2. cDNA'yı kullanarak, tam NS5A genini içeren 2571 bp'lik bir fragmanı çoğaltın. Bunu yapmak için, 5272F ve 7848R primerleri için 0,5 μM içeren bir reaksiyon karışımı hazırlayın (son konsantrasyon; Tablo 3), toplam 50 μL hacimde 1.5 mM MgCl2, 1x PCR tamponu ve 1 U yüksek kaliteli Taq polimeraz ve Tablo 4'te açıklanan koşulları kullanarak bir amplifikasyon döngüsü çalıştırın.
  3. 2571 bp'lik ürün boyutunu doğrulamak için ürünü %0,8 TAE bazlı agaroz jel üzerinde çalıştırın ve ardından üretici tarafından belirtildiği şekilde bir kolon saflaştırma kiti kullanarak ürünü saflaştırın. Kolonla saflaştırılmış ürünü 40 μL steril suda elute.
  4. Ürüne 3' A çıkıntı eklemek için 0,5 μM dATP ve 1 U düşük kaliteli Taq DNA polimeraz ekleyin ve tüm PCR ürününü 70 °C'de 30 dakika boyunca 1x PCR tamponu ve 1,5 mM MgCl2 (son konsantrasyon) ile birlikte inkübe edin. Üretici tarafından belirtildiği gibi bir kolon arıtma kiti kullanarak karışımı saflaştırın
    NOT: Alternatif olarak, ~ 9.7 kb uzunluğundaki ürünü 1.4. adımdan itibaren jelden çıkarın. ve üreticinin talimatlarına göre uzun PCR ürününün klonlanması için piyasada bulunan bir kit kullanarak klonlama gerçekleştirin veya bir Illumina platformu2 kullanarak ep-PCR ürününün NGS'sini gerçekleştirin.
  5. 5 μL 2x ligasyon tamponu, 50 ng T-vektör DNA'sı, adım 3.4'te sentezlenen insert DNA'nın yaklaşık 3 kat molar fazlası, 3 Weiss birimi T4 DNA ligaz ve nükleaz içermeyen su ekleyerek toplam 10 μL hacme bir ligasyon reaksiyonu oluşturun. Bu reaksiyonu oda sıcaklığında 3 saat inkübe edin ve ardından bağlanmış DNA ile 100 μL Escherichia coli DH5α ekleyin; hücreleri 42 °C'de 35 saniye boyunca ısı şoku (Şekil 1B).
  6. 1 mL Luria-Bertani (LB) ortamı (antibiyotiksiz) ekleyin ve iyileşme için 37 ° C'de 1 saat hafifçe çalkalayarak inkübe edin. Hücre süspansiyonunu 13.800 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın ve 200 μL taze LB ortamında yeniden süspanse edin.
  7. 50 μg/mL ampisilin içeren bir LB plakası üzerine dönüştürülmüş E. coli DH5α hücrelerinin 100 μL'sini plakalayın ve 37 °C'de 16 saat inkübe edin. 5 mL LB ortamı + 50 μg/mL ampisilin içinde 25-30 koloniden oluşan mini preparatlar hazırlayın ve gece boyunca 37 °C'de büyütün.
  8. Ertesi gün, üreticinin talimatlarına göre plazmitleri bir plazmit saflaştırma kiti ile ekstrakte edin ve tüm koloniler için 200 ng izole plazmit, 2 U EcoR1 ve 1x kısıtlama tamponu ile 10 μL hacimde kısıtlama enzimi sindirimi gerçekleştirin.
  9. Çürütme karışımlarını 37 °C'de 3 saat inkübe ettikten sonra, plazmit DNA eklemesini doğrulamak için ürünleri %0.8 TAE bazlı agaroz jel üzerinde çözün.
  10. Kütüphanelerden ve klonal pJFH1'den türetilen viral RNA'lardaki mutasyonların oranını (mutasyona uğramış nükleotidlerin oranı olarak ifade edilir) belirlemek için M13 İleri, M13 ters, 6208-SPF ve 6748-SPF primerlerini (Tablo 3) kullanarak 25 pozitif klonun plazmitlerinin Sanger dizilimini gerçekleştirin (Şekil 1B ve Şekil 4).

4. Huh7.5 hücre hattının viral RNA transfeksiyonu

NOT: RNase/DNaz içermeyen doku kültürü malzemeleri kullanın ve steril sınıf II biyogüvenlik kabininde çalışın. Kuruluşun biyogüvenlik yönergelerine göre önerilen muhafaza tesisinde çalışın.

  1. %10 (hacim/hacim) fetal sığır serumu, penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (100 μg/mL; Şekil 1D).
  2. İzdiham %90'a ulaştığında hücreleri 1:3 oranında bölün. Hücreleri 1x önceden ısıtılmış fosfat tamponlu salin (PBS; pH 7.4) ile yıkayın. Hücre tabakasını tamamen kaplamak için 5 mL 1x tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin, şişeyi hafifçe döndürün ve ardından şişeyi 37 °C'de 5 dakika inkübe edin.
    NOT: Kuluçka süresi değişebilir; Hücre tabakası hücre kültürü şişesi yüzeyinden tamamen ayrılana kadar hücreleri inkübe edin.
  3. 10 mL önceden ısıtılmış 1x tam DMEM ekleyin, hücreleri tekrar pipetleme ile dağıtın ve hücre süspansiyonunu 15 mL veya 50 mL steril santrifüj tüpünde toplayın. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 252 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın, hücre peletini 6 mL tam DMEM'de yeniden süspanse edin ve hücreleri% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.
  4. Naif, transfekte edilmiş veya virüs bulaşmış Huh7.5 hücrelerinin sürekli bakımı için adım 4.2'yi tekrarlayın. ve adım 4.3.
  5. Transfeksiyondan 1 gün önce, hücreleri 4.1.-4.3. adımlarında açıklandığı gibi bölün, bir hemositometre kullanarak canlı hücrelerin sayısını sayın, Huh7.5 hücrelerini 2 mL tam DMEM'de 35 mm'lik kaplarda 0.6 x 106 yoğunlukta tohumlayın ve hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.
  6. Ertesi gün, transkript-lipid kompleksini hazırlayın. Bunu yapmak için, 10 μL transfeksiyon reaktifini 50 μL minimal esansiyel ortamda seyreltin ve 50 μL minimal esansiyel ortamda 5 μg viral transkripti ayrı ayrı seyreltin.
  7. Her iki karışımı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin ve daha sonra bunları tek bir steril mikrosantrifüj tüpünde karıştırın ve ayrıca transkript-lipid kompleksini oluşturmak için karışımı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
  8. 16 saatlik hücre inkübasyonundan sonra, kültür ortamını kültür kabından çıkarın, hücreleri önceden ısıtılmış 1x PBS ile 2x yıkayın ve 1.5 mL minimum esansiyel ortam ekleyin. Transkript-lipid kompleksini yavaşça tabağa ekleyin ve komplekslerin eşit dağılımını sağlamak için elinizle hafifçe döndürün.
  9. Hücreleri% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de 10 saat inkübe edin. Daha sonra, ortamı çıkarın, transfekte edilmiş hücreleri 2x 1 mL önceden ısıtılmış 1x PBS ile yıkayın ve 2 mL tam DMEM ekleyin.

5. Virüs üretimi

  1. Transfekte edilen Huh7.5 hücrelerini her 2 günde bir veya %90 birleşmeye ulaştıklarında 3 günde bir bölün. Her bölmede virüs süpernatantlarını toplayın ve daha fazla analiz için -80 °C'de saklayın.
  2. Her bölünmede, adım 6.2'de açıklandığı gibi bir odak oluşturma testi (FFA) kullanarak virüsün yayılmasını izleyin. Virüs yayılımı transfekte edilen hücrelerin %>80'ine ulaşana kadar virüsü hasat edin (Şekil 1D).
    NOT: Maksimum sayıda viral varyantı kurtarmak için transfekte edilmiş hücreleri ilk birkaç pasaj için 1:1 oranında bölün. Virüs yayılımı yavaşlar ve tam genom ML'lerindeki mutasyon oranlarının artmasıyla canlılık azalır2.

6. Virüs titrelerinin ölçülmesi

  1. Viral RNA'nın miktar tayini
    1. Üreticinin talimatlarına göre bir viral RNA izolasyon kiti kullanarak viral RNA'yı 140 μL kültür süpernatantlarından izole edin.
    2. Üreticinin talimatlarına göre ticari bir qRT-PCR kiti kullanarak 10 μL'lik bir qRT-PCR reaksiyonu ayarlayın. HCV RNA kantifikasyonu için ileri primer R6-130-S17, ters primer R6-290-R19 (her biri 0.2 μM nihai konsantrasyon) ve R9-148-S21FT probu (son konsantrasyon 0.3 μM) kullanın (Tablo 3). Çalışma koşullarını 20 dakika boyunca 48 °C, 10 dakika boyunca 95 °C ve ardından 15 saniye boyunca 95 °C'lik 45 döngü ve 1 dakika boyunca 60 °C olarak ayarlayın.
      NOT: Prob, sırasıyla 5' ve 3' uçlarında floresan raportör boyası 6-karboksifloresein (FAM) ve söndürücü boya 6-karboksi-tetrametil-rodamin (TAMRA) içermelidir.
    3. Reaksiyonları gerçek zamanlı bir PCR makinesinde çalıştırın. Çapraz kontaminasyonun olmamasını sağlamak için negatif kontrolleri, yani sahte enfekte hücrelerin süpernatanlarından ve nükleaz içermeyen sudan aynı anda ekstrakte edilen RNA'yı kurun.
    4. Paralel olarak, viral RNA'nın miktar tayini için 10 kat seri olarak seyreltilmiş bilinen HCV transkript kopya sayısını (1 x 108 ila 0) kullanarak standart bir eğri oluşturun. Nicelemeyi üç kopya halinde gerçekleştirin (Şekil 1D).
  2. %50 doku kültürü enfeksiyöz dozu (TCID50) kullanılarak enfeksiyöz virüs titresi ölçümü
    1. Virüsü eklemeden yaklaşık 16 saat önce, 96 oyuklu bir plakada 6.5 x 103 Huh7.5 hücre/kuyu plaka ve hücreleri% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.
    2. Bir biyogüvenlik sınıfı II kabininde, hasat edilen virüsün 1 x 10−1 ila 1 x 10−6 seyreltmesini (sekiz seyreltme) kapsayan 10 kat seri seyreltme (her biri 1 mL) gerçekleştirin (virüs yayılımı 5. adımda açıklandığı gibi hücrelerin %>80'ine ulaştığında elde edilir). Huh7.5 hücrelerini enfekte etmek için seyreltilmiş virüsün 100 μL/kuyu (sekiz kopya ile) ekleyin ve plakayı 3 gün boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de bir inkübatörde tutun.
    3. 3 gün sonra, enfekte olmuş hücreleri her seferinde 0.1 mL PBS ile 3x yıkayın ve hücreleri 20 dakika boyunca −20 ° C'de 0.1 mL buz gibi soğuk metanol ile sabitleyin ve geçirgenleştirin. Kuyuları 1x PBS 3x ve ardından 1x PBS-T (1x PBS/%0.1 [h/h] Tween-20) ile yıkayın.
    4. PBS-T'yi çıkardıktan sonra, PBST'de% 0.2 yağsız süt içeren 0.1 mL% 1 sığır serum albümini (BSA) ile hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika bloke edin. Bloke edici çözeltiyi çıkarın ve hücrelere 1x PBS'de hazırlanan 0.1 mL% 3H2O2ile 5 dakika muamele edin.
    5. Yine, hücreleri 2x 1x PBS ve 1x PBS-T ile yıkayın, ardından 50 μL / kuyu anti-NS5A 9E10 mAb (1:10000, stok 1 mg / mL; Charles Rice, Rockefeller Üniversitesi'nden nazik bir hediye) ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Kuyuları tekrar 3x PBS ile 1x ve 1x PBS-T ile yıkayın.
    6. 50 μL / kuyucuk HRP konjuge keçi anti-fare ikincil IgG (1:4000) ekleyin, oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin ve ardından kuyucukları 0.1 mL 1x PBS ile yıkayarak bağlanmamış antikoru çıkarın.
    7. 30 μL DAB (diaminobenzidin tetrahidroklorür) renkli substrat ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hafifçe sallayarak inkübe edin. Substrat, kuyu yüzeyinde HCV NS5A antijenini gösteren kahverengi bir çökelti geliştirir. DAB çözeltisini çıkarın ve kuyuları 2x 1x PBS ve 1x damıtılmış su ile yıkayın. % 0.03 sodyum azid içeren 100 μL PBS ekleyin.
    8. Her bir kuyuyu 10x objektif kullanarak ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu altında inceleyin. Pozitif kuyuların sayısını sayın. Kuyu bir veya daha fazla NS5A-pozitif hücre içeriyorsa, o zaman pozitiftir; kuyu NS5A pozitif hücrelerin yokluğunu gösteriyorsa, o zaman negatiftir. Kuyuların %50'sini etkileyen uç nokta seyreltmesini tahmin etmek için bir Reed ve Muench hesaplayıcısı kullanın (TCID50)14,15. TCID50'yi elde etmek için gereken seyreltmenin bir tersi, birim hacim başına virüs enfektivitesi titresidir (odak oluşturan birimler).
      NOT: Virüs enfektivites titreleri, farklı mutant kütüphaneler için farklılık gösterir.

7. İlaca dirençli viral varyant seçimi

  1. Bir NS5A inhibitörü olan pibrentasvir'i (PIB)% 100 DMSO'da 1 mM'lik bir konsantrasyona çözün ve ayrıca tam DMEM'de 10 nM'lik bir konsantrasyona seyreltin.
  2. PIB'nin %50 etkili konsantrasyonunu belirlemek için, Huh7.5 hücrelerini 6 oyuklu bir plakada 0.6 x 106/kuyu yoğunluğunda tohumlayın ve hücreleri %5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin. 16 saatlik hücre inkübasyonundan sonra, hücrelerin% 50'sini enfekte etmek için ML50 veya klonal JFH1 virüsünün bir virüs dozunu ekleyin ve daha sonra, enfeksiyondan 12 saat sonra (h pi), hücrelere 0.5-100 pm arasında değişen iki katlı bir seyreltme serisi PIB uygulayın. FFA'yı ölçün ve adım 6.2'deki gibi FFU'yu ölçün. 3 günlük inkübasyondan sonra.
  3. İstatistiksel analiz yazılımında FFU-redüksiyon tahlil değerlerini kullanarak doz-yanıt eğrilerini çizin. Sigmoidal eğriden,% 50 etkili konsantrasyonu elde edin (EC50; Şekil 5).
    NOT: Etkili konsantrasyon aralığı sınıfa bağlı olarak, aynı sınıftaki HCV antiviralleri arasında ve mutant kütüphanesine bağlı olarak değişebilir.
  4. Deney için, 12 saat boyunca hücrelerin %50'sini enfekte etmek için bir ML50 virüsü (ML50 RNA'dan türetilen varyantlar) dozu ile %70 birleşimde saf Huh7.5 hücrelerini enfekte edin ve ardından enfekte olmuş hücreleri enfeksiyondan 24 saat sonra 6 oyuklu plakalara aktarın.
  5. 16 saatlik hücre bölünmesinden sonra enfekte olmuş hücrelere 1x EC50 PIB (47.3 pM) ekleyin. Bunu, her hücre ardışık altı geçiş (18 gün) boyunca bölündükten sonra, ardından üç ilaçsız geçiş döngüsü izledikten sonra yapın ve adım 6.2'de açıklandığı gibi FFA'ları kullanarak virüs yayılımını izleyin. Büyüme alanına göre ölçek büyütme FFA reaktifleri. Her geçişte viral süpernatantları toplayın ve kullanana kadar −80 °C'de saklayın.
    NOT: Tedavi takibi sırasında hücrelerin %50'sinden fazlasına viral yayılım bir atılım olarak tanımlanabilir ve ilaç bırakma döneminde viral yayılım viral nüksolarak tanımlanabilir 16.
  6. Adım 6.1.1'de açıklandığı gibi 18. günde süpernatanttan viral RNA'yı çıkarın ve ardından adım 3.1'de gösterildiği gibi cDNA'yı sentezleyin. NS5A genini, 5 μL 1:5 seyreltilmiş cDNA ve adım 3.2'de açıklanan PCR bileşenlerini kullanarak çoğaltın. Ardından, 3.3.-3.5 adımlarını izleyin. NS5A dizileme primerleri 6186F, 6862F ve 6460R kullanılarak 6-8 pozitif bakteri plazmitinde NS5A ilaç direnci mutasyonlarını belirlemek için (Tablo 3 ve Tablo 4).
    NOT: Bu çalışmada, 1x EC50'de PIB tedavisi sırasında seçilen varyantların NS5A'daki ikamelerini bildirdik. Bu, NS5A dışındaki ikamelerin PIB'ye duyarlılığın azaltılmasına katkısını ortadan kaldıracaktır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Şekil 1'de açıklanan prosedürleri takiben ilgilenilen ilaca dirençli fenotipler için çok sayıda tam uzunlukta HCV varyantı oluşturulabilir ve taranabilir. Tam genom mutant kütüphaneleri, Şekil 2'de gösterildiği gibi, azalan miktarlarda (100-10 ng) klonal-pJFH1 kullanılarak sentezlendi. Ep-PCR ürünlerinin (mutant kütüphaneleri) ortalama verimleri 3.8-12.5 ng/μL arasında değişmektedir. Şekil 3, klonal-pJFH1'de...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu çalışmada, HCV tam genom kütüphanelerini sentezlemek için ep-PCR18 ve ters genetiği entegre eden basit ve hızlı bir FL-MRS prosedürünü detaylandırdık ve daha sonra ilaca dirençli fenotiplerin taranması için replikasyona yetkin varyantlar oluşturmak için bir hücre kültürü sisteminde kullanılabilir. Düşük kaliteli Taq DNA polimerazın kullanımı, tam uzunlukta bir viral genomun PCR amplifikasyonu sırasında ikamelerin dahil edilmesine izin veren ep-PCR'nin bir ön ko?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma için finansman desteği (hibe numarası BT/PR10906/MED/29/860/2014) Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Bölümü tarafından sağlanmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1 kb plus DNA ladder Thermo Fisher10787018
1.5 ml centrifuge tubeTarsons500010
15 ml centrifuge tubeTarsons546021
35 mm cell culture dish Tarsons960010
50 ml centrifuge tubeTarsons546041
Acetic acidMerckA6283
Agarose HiMediaMB080
Agrose gel electrophoresis unitBioRad1704406
Biosafety Cabinet, ClassIIESCOAC2 4S
Bovine serum albuminHiMediaMB083
Centrifuge Eppendorf5424-R
CFX Connect Real-Time PCR Detection SystemBioRad1855201
Cloning plates 90 mm Tarson460091
CO2 Incubator New BrunswickGalaxy 170R
Colibri Microvolume SpectrometerTitertek-Berthold11050140
DAB Substrate Kit Abcamab94665
dATP SolutionNEBN0440S
Deoxynucleotide (dNTP) Solution SetNEBN0446
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) SRL chemical46791
Dimethyl sulphoxide (DMSO)HiMediaMB058
DMEM high glucoseLonzaBE12-604F
EcoR1-HFNEBR3101
EDTA tetrasodium salt dihydrateHiMediaGRM4918
Ethidium BromideAmrescoX328
Fetal bovine serum Gibco26140079
Formaldehyde Fishser Scientific12755
Gel Documentation SystemALPHA IMAGER
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRPThermo FisherA16066
Hydrogen peroxide 30%Merck107209
Inverted microscopeNickon ECLIPSE Ts2
LB broth HiMediaM1245
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher116680270transfection reagent
Mechanical Pipette SetEppendorf  3120000909
MethanolMerck106009
Micro Tips 0.2-10 µl Tarsons521000
Micro Tips 10 - 100 µl Tarsons521010
Micro Tips 200-1000 µl Tarsons521020
MOPS buffer GeNei3601805001730
Nonessential aminoacids (NEAA)Gibco11140050
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coliInvitrogenC404010E.coli DH5α
Opti-MEMGibco1105-021minimal essential medium
PCR tubes 0.2 mlTarsons510051
Pencillin/streptomycin Gibco15070063
pGEM-T Easy Vector SystemPromegaA1360T-vector DNA
Phosphate buffer saline (PBS)HiMediaTI1099
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseNEBM0530S
PibrentasvirCayman Chemical27546
Pipette controller Gilson F110120
Platinum Taq DNA Polymerase Thermo10966034
PrismGraphPadstatistical analysis software
QIAamp Viral RNA Mini kit Qiagen52904viral isolation kit
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106
QIAquick PCR Purification KitQIAGEN28104cokum purification kit
RNeasy Mini Kit QIAGEN74104RNA cleanup kit
Serological Pipettes 25 mlThermo Fisher170357N
Serological Pipettes 5 mlThermo Fisher170355N
Serological Pipettes10 mlThermo Fisher170356N
Single strand RNA Marker 0.2-10 kbMerckR7020
Skim milk HiMediaM530
Sodium azide 0.1 M solutionMerck8591
SuperScript III Reverse Transcriptase Invitrogen18080044reverse transcriptase
T100 Thermal CyclerBioRad1861096
T175 cell culture flask Tarsons159910
T25 cell culture flask Tarsons950040
T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System PromegaP1320 Large Scale RNA Production System 
T75 cell culture flask Tarsons950050
Taq DNA PolymeraseGenetix Biotech (Puregene)PGM040
TaqMan RNA-to-CT 1-Step KitApplied Biosystems4392653
TaqMan RNA-to-CT 1-Step KitThermo Fisher4392653commercial qRT-PCR kit 
TOPO-XL--2 Complete PCR Cloning KitThermo FisherK8050-10kit for cloning of long-PCR product 
Tris baseHiMediaTC072
Trypsin-EDTA solutionHiMediaTCL007
Tween 20HiMediaMB067
Vacuum Concentrator Eppendorf, Concentrator Plus100248
Water bath GRANTJBN-18
Xba1NEBR0145S

Referanslar

  1. Desselberger, U. Reverse genetics of rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2106-2108 (2017).
  2. Singh, D., et al. Genome-wide mutagenesis of hepatitis C virus reveals ability of genome to overcome detrimental mutations. Journal of Virology. 94 (3), 01327(2020).
  3. Agarwal, S., Baccam, P., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Novel synthesis and phenotypic analysis of mutant clouds for hepatitis E virus genotype 1. Journal of Virology. 92 (4), 01932(2018).
  4. Edmonds, J., et al. A novel bacterium-free method for generation of flavivirus infectious DNA by circular polymerase extension reaction allows accurate recapitulation of viral heterogeneity. Journal of Virology. 87 (4), 2367-2372 (2013).
  5. Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathogens. 4 (10), 1000182(2008).
  6. Heaton, N. S., Sachs, D., Chen, C. -J., Hai, R., Palese, P. Genome-wide mutagenesis of influenza virus reveals unique plasticity of the hemagglutinin and NS1 proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20248-20253 (2013).
  7. Eyre, N. S., et al. Genome-wide mutagenesis of dengue virus reveals plasticity of the NS1 protein and enables generation of infectious tagged reporter viruses. Journal of Virology. 91 (23), 01455(2017).
  8. Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. Directed evolution: Past, present, and future. AIChE Journal. American Institute of Chemical Engineers. 59 (5), 1432-1440 (2013).
  9. Sen, S., Venkata Dasu, V., Mandal, B. Developments in directed evolution for improving enzyme functions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 143 (3), 212-223 (2007).
  10. Yuan, L., Kurek, I., English, J., Keenan, R. Laboratory-directed protein evolution. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 373-392 (2005).
  11. Green, M. R., Sambrook, J. Analysis of DNA by agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (1), (2019).
  12. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565(2010).
  13. Rio, D. C. Denaturation and electrophoresis of RNA with formaldehyde. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 219-222 (2015).
  14. Lindenbach, B. D. Measuring HCV infectivity produced in cell culture and in vivo. Methods in Molecular Biology. 510, 329-336 (2009).
  15. Lei, C., Yang, J., Hu, J., Sun, X. On the calculation of TCID50 for quantitation of virus infectivity. Virologica Sinica. 36 (1), 141-144 (2021).
  16. Soni, S., Singh, D., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Enhanced fitness of hepatitis C virus increases resistance to direct-acting antivirals. The Journal of General Virology. 103 (2), (2022).
  17. Khan, S., Soni, S., Veerapu, N. S. HCV replicon systems: Workhorses of drug discovery and resistance. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 10, 325(2020).
  18. Cadwell, R. C., Joyce, G. F. Randomization of genes by PCR mutagenesis. PCR Methods and Applications. 2 (1), 28-33 (1992).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Ters GenetikPozitif Anlaml RNA Vir sVaryantlarY nlendirilmi EvrimRNA GenomuHataya A k PCRViral Mutantlarlgilenilen FenotiplerTam Uzunlukta Mutant RNA Sentezi FL MRSK t phaneGenetik e itlilikDNA Polimeraz SadakatiablonMutant RNA SenteziKonak H crelerSe ilmemi Girdi HavuzuViral Y nelimli EvrimHepatit C Vir s HCVJFH1 zolatAdaptasyonReplikasyonViral GenlerPatogenezAntiviral Diren

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır