Genética reversa para projetar variantes do vírus de RNA de sentido positivo

Resumo

O protocolo descreve um método para introduzir diversidade genética controlável no genoma do vírus da hepatite C combinando síntese completa de RNA mutante usando PCR propenso a erros e genética reversa. O método fornece um modelo para seleção de fenótipos e pode ser usado para genomas de vírus de RNA de sentido positivo de 10 kb longos.

Resumo

A falta de um método conveniente para a geração iterativa de diversas variantes virais de comprimento total tem impedido o estudo da evolução dirigida em vírus de RNA. Ao integrar uma PCR propensa a erros no genoma de RNA e genética reversa, a mutagênese de substituição aleatória do genoma pode ser induzida. Desenvolvemos um método usando esta técnica para sintetizar diversas bibliotecas para identificar mutantes virais com fenótipos de interesse. Esse método, chamado síntese completa de RNA mutante (FL-MRS), oferece as seguintes vantagens: (i) a capacidade de criar uma grande biblioteca por meio de uma PCR altamente eficiente e propensa a erros em uma etapa; (ii) a capacidade de criar grupos de bibliotecas com diferentes níveis de diversidade genética, manipulando a fidelidade da DNA polimerase; (iii) a criação de um produto de PCR completo que possa servir diretamente como um modelo para a síntese de RNA mutante; e (iv) a capacidade de criar RNA que pode ser entregue em células hospedeiras como um pool de entrada não selecionado para rastrear mutantes virais do fenótipo desejado. Descobrimos, usando uma abordagem de genética reversa, que a ERM-FL é uma ferramenta confiável para estudar a evolução dirigida por vírus em todos os estágios do ciclo de vida do vírus da hepatite C, isolado de JFH1. Esta técnica parece ser uma ferramenta inestimável para empregar a evolução dirigida para entender a adaptação, a replicação e o papel dos genes virais na patogênese e resistência antiviral em vírus de RNA de sentido positivo.

Introdução

O rastreamento genético antecipado começa com um fenótipo viral de interesse e, em seguida, por meio do sequenciamento de seu genoma e comparação com o da cepa original, tenta identificar a(s) mutação(ões) causadora(s) desse fenótipo. Em contraste, nos rastreamentos genéticos reversos, mutações aleatórias são introduzidas em um gene alvo, seguidas por um exame do(s) fenótipo(s) resultante(s)¹. Para a abordagem da genética reversa, a mutagênese in vitro é a técnica mais amplamente utilizada para criar um pool de variantes que são posteriormente rastreadas para fenótipos de interesse. Várias ferramentas genéticas têm sido relatadas para a obtenção de mutagênese aleatória genômica de vírus de RNA, incluindo PCR propenso a erros (ep-PCR)^2,3, extensão circular da polimerase⁴ e mutagênese de inserção Mu-transposon 5,6,7. Os dois últimos métodos produzem bibliotecas com diversidade limitada de sequências e são propensos à introdução de grandes inserções e deleções, que são altamente letais para vírus e limitam severamente a recuperação de variantes virais infecciosas.

A EP-PCR é uma conhecida e poderosa técnica de mutagênese amplamente utilizada na engenharia de proteínas para gerar enzimas mutantes para a seleção de fenótipos com propriedades desejadas, tais como maior estabilidade térmica, especificidade do substrato e atividade catalítica 8,9,10. Esta técnica é de fácil execução, pois requer equipamentos simples, não envolve manipulações tediosas, utiliza reagentes disponíveis comercialmente e é rápida; Além disso, gera bibliotecas de alta qualidade.

Aqui, desenvolvemos um novo método para síntese completa de RNA mutante (FL-MRS) para gerar genomas completos do vírus da hepatite C (HCV) através da integração de ep-PCR, que induz mutagênese de substituição aleatória do genoma e genética reversa. Mesmo uma inserção ou deleção de nucleotídeo único é altamente deletéria para vírus de RNA de sentido positivo ([+]ssRNA); portanto, a mutagênese de substituição baseada em PCR é o método preferido para a geração iterativa de grandes e diversas bibliotecas de genomas completos de RNA (+)ss com boa viabilidade.

FL-MRS é uma abordagem direta que pode ser aplicada a qualquer vírus de RNA de sentido positivo com um comprimento de genoma de ~10 kb através do design meticuloso de um conjunto de primers que se liga ao clone de cDNA viral. pJFH1 é um clone de cDNA infeccioso que codifica o genótipo 2a do HCV e pode recapitular todas as etapas do ciclo de vida do vírus. Usando a abordagem da FL-MRS, demonstramos a síntese de bibliotecas do genoma completo mutagenizadas aleatoriamente (bibliotecas mutantes [MLs]) para produzir variantes JFH1 competentes em replicação para as quais não havia conhecimento prévio das propriedades associadas às mutações. Após a exposição a um antiviral, algumas das variantes virais rapidamente superaram a pressão medicamentosa com a mudança fenotípica desejada. Usando o protocolo descrito aqui, uma infinidade de variantes virais pode ser gerada, criando oportunidades para estudar a evolução dos vírus (+)ssRNA.

Protocolo

NOTA: A cepa JFH1 (WT) usada aqui foi um presente gentil de Takaji Wakita, Instituto Nacional de Doenças Infecciosas. A linhagem celular de hepatoma humano, Huh7.5, foi um presente gentil de Charles Rice, da Universidade Rockefeller. Um esquema do método é mostrado na Figura 1.

1. Mutagênese de substituição genômica ampla de JFH1 usando PCR propenso a erros

1. Para a realização da ep-PCR, preparar a mistura mestre para quatro conjuntos de experimentos com os primers J-For 5'-GTTTTCCCAGTCAGCACGTTGTAAAACGACGGC-3' e J-Rev 5'-CATGATCTGCAGAGAGACCAGTTACGGCACTCTC -3' (Figura 1A), juntamente com os componentes da reação descritos na Tabela 1 sem o molde pJFH1 (plasmídeo isolado da cepa JFH1).
2. Aliquot a mistura mestre em quatro tubos, adicione 100 ng, 50 ng, 25 ng e 10 ng de molde nos tubos individuais e ajuste o volume total da reação para 50 μL. Aplicar as condições de ciclagem descritas na Tabela 2 para amplificar um fragmento de 9736 pares de bases (pb) que compreende o promotor T7 e o genoma completo do HCV (Figura 2).
   NOTA: O produto ep-PCR deve conter a sequência promotora T7 para facilitar a transcrição in vitro do genoma viral. Portanto, o primer anterior deve estar localizado a montante do promotor T7 do clone de cDNA viral, e a sequência de primers reversos deve terminar na extremidade 3' do genoma do vírus para facilitar o escoamento da transcrição. Otimizar cada componente da reação ep-PCR dentro da faixa recomendada pelo fabricante da Taq DNA polimerase para obter amplificação de alto rendimento. Além de quantidades variadas de moldes, dNTPs desbalanceados (especialmente baixa concentração de dATP e/ou dGTP) também podem ser usados para aumentar a diversidade no comprimento de genomas virais de 6-8 kb de comprimento³.
3. Estimar o produto da ep-PCR amplificado carregando volumes iguais dos produtos da PCR (5 μL) e comparando com quantidades conhecidas de escada de DNA de 1 quilobase (kb) executando uma eletroforese em gel de agarose à base de Tris-acetato de 0,8% (TAE)¹¹. Purificar o produto usando um kit de purificação de coluna conforme indicado pelo fabricante.
4. Estimar a concentração do produto purificado medindo a absorbância a 260 nm utilizando um espectrofotômetro de microvolume¹². Concentrar a vácuo o produto ep-PCR, se necessário, para obter uma concentração do produto ≥100 ng/μL.
   NOTA: Uma estimativa mais precisa pode ser feita carregando diluições seriadas de duas vezes do produto ep-PCR e comparando suas intensidades com as quantidades conhecidas de 1 kb de escada de DNA.

2. Síntese de RNA viral

1. Estabelecer uma reação de 40 μL para digerir 5 μg de pJFH1 clonal com 4 U da enzima XbaI a 37 °C por 2 h, seguida de purificação em coluna e medição da absorbância a 260 nm em espectrofotômetro de microvolume¹². Estabelecer uma reação de transcrição in vitro de 20 μL do produto ep-PCR purificado em coluna ou clonal-pJFH1 (WT) usando um sistema de produção de RNA em larga escala disponível comercialmente de acordo com as instruções do fabricante.
2. Em um tubo de microcentrífuga de 200 μL, misturar aproximadamente 1 μg do produto purificado da ep-PCR (bibliotecas mutantes) ou XbaI digerido clonal-pJFH1, 10 μL de tampão 2x contendo ribonucleotídeos e 2 μL da mistura enzimática T7. Misture todos os componentes e gire brevemente os componentes. Incubar a mistura reacional a 37 °C por 45 min, seguida da adição da enzima DNase 1 U livre de RNase e incubação a 37 °C por 30 min (Figura 1C).
3. Purificar o RNA sintetizado in vitro usando um kit de limpeza de RNA de acordo com as instruções do fabricante, eluir em 40 μL de água livre de RNase e DNase e estimar a concentração do RNA purificado medindo a absorbância a 260 nm usando um espectrofotômetro de microvolume¹². Faça alíquotas conforme necessário (5 μg ou 2 μg) para evitar o congelamento-descongelamento e armazene-as a -80 °C. Verificar a integridade e o tamanho dos transcritos virais usando 2 μg de RNA para uma eletroforese em gel de agarose MOPS^{formaldeído 0,8% 13} (Figura 3).

3. Estimativa da proporção de mutações em produtos de ep-PCR (bibliotecas mutantes)

NOTA: Nesta etapa, a proporção de nucleotídeos sofreu mutação por subclonagem do produto obtido na etapa 2. foi estimada para demonstrar a vantagem de empregar ep-PCR para criar heterogeneidade genética usando duas bibliotecas mutantes do genoma completo (ML50 e ML25) e RNAs virais clonais derivados de pJFH1. A proporção de mutações foi estimada no gene NS5A do HCV, que também foi o gene de leitura fenotípica (resistência a drogas) neste estudo.

1. Estabelecer uma reação de síntese de cDNA de 20 μL adicionando aproximadamente 1 μg do RNA viral sintetizado na etapa 2., 5 μM do primer reverso 5'-GTGTACCTAGTGTGTGTGCCGCTCTA-3', e 200 U transcriptase reversa de acordo com as recomendações do fabricante.
2. Usando o cDNA, amplificar um fragmento de 2571 pb que compreende o gene NS5A completo. Para isso, prepare uma mistura reacional contendo 0,5 μM para os primers 5272F e 7848R (concentração final; Tabela 3), 1,5 mM MgCl₂, 1x tampão de PCR e 1 U de alta fidelidade Taq polimerase em um volume total de 50 μL e executar um ciclo de amplificação usando as condições descritas na Tabela 4.
3. Execute o produto em um gel de agarose à base de TAE 0,8% para confirmar o tamanho do produto de 2571 pb e, em seguida, purifice o produto usando um kit de purificação de coluna conforme indicado pelo fabricante. Eluir o produto purificado em coluna em 40 μL de água estéril.
4. Para adicionar uma saliência de 3' A ao produto, adicione 0,5 μM de dATP e 1 U de Taq DNA polimerase de baixa fidelidade e incube todo o produto de PCR a 70 °C por 30 min, juntamente com 1x tampão de PCR e 1,5 mM MgCl₂ (concentração final). Purificar a mistura usando um kit de purificação de coluna conforme indicado pelo fabricante
   NOTA: Alternativamente, excise o produto de ~9,7 kb de comprimento do gel da etapa 1.4. e realizar clonagem utilizando um kit disponível comercialmente para clonagem de produto de PCR longo de acordo com as instruções do fabricante ou realizar NGS do produto ep-PCR usando uma plataforma Illumina².
5. Estabelecer uma reação de ligadura adicionando 5 μL de tampão de ligadura 2x, 50 ng do DNA vetorial T, aproximadamente 3 vezes o excesso molar do DNA de inserção sintetizado na etapa 3.4., 3 unidades Weiss de DNA ligase T4 e água livre de nucleases a um volume total de 10 μL. Incubar esta reação à temperatura ambiente durante 3 h e, em seguida, adicionar 100 μL de Escherichia coli DH5α com o ADN ligado; choque térmico das células a 42 °C por 35 s (Figura 1B).
6. Adicionar 1 ml de meio Luria-Bertani (LB) (sem antibiótico) e incubar com agitação suave durante 1 h a 37 °C para recuperação. Centrifugar a suspensão celular a 13.800 x g, descartar o sobrenadante e ressuspender em 200 μL de meio LB fresco.
7. Placa 100 μL das células DH5α de E. coli transformadas em uma placa LB contendo 50 μg/mL de ampicilina e incubar a 37 °C por 16 h. Montar minipreps de 25-30 colônias em 5 mL de meio LB + 50 μg/mL de ampicilina e crescer durante a noite a 37 °C.
8. No dia seguinte, extrair os plasmídeos com um kit de purificação de plasmídeos de acordo com as instruções do fabricante e realizar a digestão da enzima de restrição em volume de 10 μL com 200 ng dos plasmídeos isolados, 2 U de EcoR1 e 1x tampão de restrição para todas as colônias.
9. Após incubar as misturas de digestão a 37 °C por 3 h, resolver os produtos em gel de agarose à base de TAE 0,8% para confirmar a inserção de DNA plasmidial.
10. Realizar o sequenciamento de Sanger dos plasmídeos de 25 clones positivos utilizando os primers M13 Forward, M13 reverse, 6208-SPF e 6748-SPF (Tabela 3) para determinar a proporção de mutações (expressa como a proporção de nucleotídeos mutados) nos RNAs virais derivados das bibliotecas e pJFH1 clonal (Figura 1B e Figura 4).

4. Transfecção de RNA viral da linhagem celular Huh7.5

OBS: Utilizar materiais de cultura de tecidos livres de RNase/DNase e trabalhar em gabinete de biossegurança estéril classe II. Trabalhar na instalação de contenção recomendada de acordo com as diretrizes de biossegurança da organização.

1. Manter as células Huh7.5 incubando em estufa a 5% CO₂ a 37 °C num frasco de cultura de tecidos T75^cm2 contendo 15 ml de meio de Dulbecco modificado completo (DMEM) suplementado com 10% (vol/vol) de soro fetal bovino, penicilina (100 U/ml) e estreptomicina (100 μg/ml; Figura 1D).
2. Divida as células em uma proporção de 1:3 quando a confluência atingir 90%. Lavar as células com 1x solução salina tamponada com fosfato pré-aquecido (PBS; pH 7,4). Adicionar 5 ml de solução de tripsina-EDTA a 1x para cobrir completamente a camada celular, agitar suavemente o balão e, em seguida, incubar o balão a 37 °C durante 5 minutos.
   NOTA: O tempo de incubação pode variar; incubar as células até que a camada celular se desprenda completamente da superfície do frasco de cultura celular.
3. Adicionar 10 mL de DMEM completo pré-aquecido 1x, dispersar as células por pipetagem repetida e coletar a suspensão celular em um tubo centrífugo estéril de 15 mL ou 50 mL. Centrifugar a suspensão celular a 252 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Eliminar o sobrenadante, ressuspender o pellet celular em 6 mL de DMEM completo e incubar as células a 37 °C em estufa umidificada com CO₂ a 5%.
4. Para manutenção contínua de células Huh7.5 virgens, transfectadas ou infectadas por vírus, repita a etapa 4.2. e passo 4.3.
5. 1 dia antes da transfecção, dividir as células conforme descrito nas etapas 4.1.-4.3., contar o número de células viáveis usando um hemocitômetro, semear as células Huh7.5 a uma densidade de 0,6 x 10⁶ em placas de 35 mm em 2 mL de DMEM completo e incubar as células a 37 °C em uma estufa umidificada com 5% de CO₂.
6. No dia seguinte, prepare o complexo transcrito-lipídico. Para fazer isso, diluir 10 μL de reagente de transfecção em 50 μL de meio essencial mínimo e, separadamente, diluir 5 μg de transcritos virais em 50 μL de meio essencial mínimo.
7. Incubar ambas as misturas à temperatura ambiente durante 10 minutos e, em seguida, misturá-las num único tubo de microcentrífuga estéril e incubar ainda mais a mistura à temperatura ambiente durante 30 minutos para formar o complexo transcrito-lipídico.
8. Após 16 h de incubação celular, retirar o meio de cultura da placa de cultura, lavar as células 2x com PBS 1x pré-aquecido e adicionar 1,5 mL de meio essencial mínimo. Adicione lentamente o complexo transcrito-lipídico ao prato e gire suavemente com as mãos para garantir uma distribuição uniforme dos complexos.
9. Incubar as células em estufa de CO₂ a 5% a 37 °C durante 10 horas. Em seguida, remova o meio, lave as células transfectadas 2x com 1 mL de PBS 1x pré-aquecido e adicione 2 mL de DMEM completo.

5. Produção de vírus

1. Dividir as células Huh7.5 transfectadas a cada 2 dias ou 3 dias quando atingirem 90% de confluência. Colete sobrenadantes de vírus a cada divisão e armazene-os a -80 °C para análise adicional.
2. A cada divisão, monitore a propagação do vírus usando um ensaio de formação de foco (FFA), conforme descrito na etapa 6.2. Colher o vírus até que a disseminação do vírus atinja >80% das células transfectadas (Figura 1D).
   NOTA: Divida as células transfectadas na proporção de 1:1 para as primeiras passagens para resgatar o número máximo de variantes virais. A disseminação do vírus diminui e a viabilidade diminui com o aumento das proporções de mutações nos MLs do genoma completo².

6. Quantificação dos títulos virais

1. Quantificação do RNA viral
   1. Isolar o RNA viral de 140 μL de sobrenadantes de cultura usando um kit de isolamento de RNA viral de acordo com as instruções do fabricante.
   2. Configure uma reação qRT-PCR de 10 μL usando um kit comercial de qRT-PCR de acordo com as instruções do fabricante. Utilizar o primer forward R6-130-S17, o primer reverso R6-290-R19 (concentração final 0,2 μM cada) e a sonda R9-148-S21FT (concentração final 0,3 μM) para quantificação do RNA do HCV (Tabela 3). Defina as condições de execução como 48 °C por 20 min, 95 °C por 10 min e, em seguida, 45 ciclos de 95 °C por 15 s e 60 °C por 1 min.
      NOTA: A sonda deve conter o corante repórter fluorescente 6-carboxifluoresceína (FAM) e o corante quencher 6-carboxi-tetrametil-rodamina (TAMRA) nas extremidades 5' e 3', respectivamente.
   3. Execute reações em uma máquina de PCR em tempo real. Configure controles negativos, ou seja, RNA extraído dos sobrenadantes de células infectadas e água livre de nucleases simultaneamente para garantir a ausência de contaminação cruzada.
   4. Em paralelo, gerar uma curva padrão usando um número de cópias conhecidas diluído em série de 10 vezes de transcritos do HCV (1 x 10,⁸ a 0) para a quantificação do RNA viral. Realizar a quantificação em triplicata (Figura 1D).
2. Quantificação de títulos de vírus infecciosos usando dose infecciosa de cultura de tecido a 50% (TCID₅₀)
   1. Aproximadamente 16 h antes da adição do vírus, placa 6,5 x 10³ células Huh7,5 poço em uma placa de 96 poços e incubar as células a 37 °C em uma incubadora de 5% CO₂ .
   2. Em um gabinete classe II de biossegurança, realizar diluições seriadas de 10 vezes (1 mL cada) cobrindo diluições de 1 x 10−¹ a 1 x 10⁻⁶ (oito diluições) do vírus colhido (obtidas quando a disseminação do vírus atinge >80% das células, conforme descrito na etapa 5). Adicionar 100 μL/poço (com oito repetições) do vírus diluído para infectar as células Huh7.5 e manter a placa em estufa a 37 °C com 5% de CO₂ por 3 dias.
   3. Após 3 dias, lavar as células infectadas 3x com 0,1 mL de PBS cada vez e fixar e permeabilizar as células com 0,1 mL de metanol gelado a −20 °C por 20 min. Lave os poços com 1x PBS 3x e depois 1x com PBS-T (1x PBS/0,1% [v/v] Tween-20).
   4. Após a remoção do PBS-T, bloquear as células por 30 min à temperatura ambiente com 0,1 mL de albumina de soro bovino (BSA) a 1% contendo 0,2% de leite desnatado em PBST. Remover a solução de bloqueio e tratar as células durante 5 minutos com 0,1 ml de 3% H 2 O₂preparado em PBS 1x.
   5. Novamente, lave as células 2x com 1x PBS e 1x com PBS-T, em seguida, adicione 50 μL/poço de anti-NS5A 9E10 mAb (1:10000, estoque 1 mg/mL; um presente gentil de Charles Rice, The Rockefeller University), e incube à temperatura ambiente por 1 h. Lave os poços novamente 3x com 1x PBS e 1x com PBS-T.
   6. Adicionar 50 μL/poço de IgG secundária anti-camundongo conjugada com HRP de cabra (1:4000), incubar por 30 min à temperatura ambiente e, em seguida, remover o anticorpo não ligado lavando os poços com 0,1 mL de 1x PBS.
   7. Adicionar 30 μL de substrato de cor DAB (tetracloridrato de diaminobenzidina) e incubar a placa com balanço suave por 10 min à temperatura ambiente. O substrato desenvolve um precipitado marrom na superfície do poço que indica o antígeno NS5A do HCV. Retire a solução DAB e lave os poços 2x com 1x PBS e 1x com água destilada. Adicionar 100 μL de PBS contendo azida sódica a 0,03%.
   8. Examine cada poço sob um microscópio de luz invertida usando uma objetiva de 10x. Conte o número de poços positivos. Se o poço contiver uma ou mais células NS5A-positivas, então é positivo; se o poço mostrar ausência de células NS5A positivas, então é negativo. Utilizar uma calculadora de Reed e Muench para estimar a diluição do desfecho que infecta 50% dos poços (TCID₅₀)^14,15. Uma recíproca da diluição necessária para produzir o TCID₅₀ é o título de infectividade do vírus (unidades formadoras de focos) por unidade de volume.
      NOTA: Os títulos de infectividade do vírus variam para diferentes bibliotecas mutantes.

7. Seleção de variantes virais resistentes a medicamentos

1. Dissolver o pibrentasvir (PIB), um inibidor da NS5A, em DMSO a 100% até uma concentração de 1 mM e diluí-lo em DMEM completo até uma concentração de 10 nM.
2. Para determinar a concentração efetiva de 50% de PIB, semeie células Huh7.5 a uma densidade de 0,6 x 10 6/poço em uma placa de⁶ poços e incube as células a 37 °C em uma incubadora de 5% de CO₂ . Após 16 h de incubação celular, adicionar uma dose viral de ML50 ou vírus JFH1 clonal para infectar 50% das células e, em seguida, 12 h pós-infecção (h p.i.), tratar as células com uma série de diluição de duas vezes de PIB variando de 0,5-100 pM. Medir os AGL e quantificar os AGL como no passo 6.2. após 3 dias de incubação.
3. Plotar as curvas dose-resposta utilizando os valores do ensaio de redução de FFU em software de análise estatística. A partir da curva sigmoidal, obtém-se a concentração efetiva de 50% (EC₅₀; Gráfico 5).
   NOTA: O intervalo de concentração eficaz pode variar dependendo da classe, entre antivirais HCV da mesma classe, e dependendo da biblioteca mutante.
4. Para o experimento, infectar células Huh7.5 virgens em 70% de confluência com uma dose do vírus ML50 (variantes derivadas do RNA ML50) para infectar 50% das células por 12 h e, em seguida, transferir as células infectadas para placas de 6 poços 24 h após a infecção.
5. Adicionar 1x EC₅₀ PIB (47,3 pM) às células infectadas após 16 h de divisão celular. Faça isso depois que cada célula se dividir por seis passagens consecutivas (18 dias), seguidas por três ciclos de passagem sem drogas, e monitorar a disseminação do vírus usando FFAs, conforme descrito na etapa 6.2. Ampliação de reagentes FFA de acordo com a área de crescimento. Colha sobrenadantes virais em cada passagem e armazene-os a -80 °C até o uso.
   NOTA: A disseminação viral para mais de 50% das células durante o acompanhamento do tratamento pode ser definida como um avanço, e a disseminação viral durante o período de abstinência da droga pode ser definida como recidiva viral¹⁶.
6. Extrair o ARN viral do sobrenadante no dia 18, conforme descrito no passo 6.1.1., e depois sintetizar o cADN, como mostrado no passo 3.1. Amplificar o gene NS5A usando 5 μL de cDNA diluído 1:5 e os componentes de PCR descritos na etapa 3.2. Em seguida, siga as etapas 3.3.-3.5. determinar mutações de resistência à NS5A em plasmídeos bacterianos 6-8 positivos usando os primers de sequenciamento NS5A 6186F, 6862F e 6460R (Tabela 3 e Tabela 4).
   NOTA: Aqui neste estudo, relatamos substituições na NS5A de variantes selecionadas durante o tratamento com PIB em 1x EC₅₀. Isso excluirá a contribuição de substituições diferentes da NS5A na redução da suscetibilidade ao PIB.

Resultados

Uma infinidade de variantes completas do HCV pode ser gerada e rastreada para fenótipos resistentes de interesse seguindo os procedimentos descritos na Figura 1. Bibliotecas completas de mutantes do genoma foram sintetizadas usando clonal-pJFH1 em quantidades decrescentes (100-10 ng), como mostrado na Figura 2. Os rendimentos médios dos produtos de ep-PCR (bibliotecas mutantes) variaram de 3,8-12,5 ng/μL. A Figura 3 mostra os tra...

Discussão

Neste estudo, detalhamos um procedimento simples e rápido de FL-MRS que integra ep-PCR¹⁸ e genética reversa para sintetizar bibliotecas do genoma completo do HCV, que pode então ser usado em um sistema de cultura celular para gerar variantes competentes em replicação para a triagem de fenótipos resistentes a drogas. O uso de Taq DNA polimerase de baixa fidelidade é um pré-requisito da ep-PCR que permite a incorporação de substituições durante a amplificação por PCR de um genoma viral...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb plus DNA ladder	Thermo Fisher	10787018
1.5 ml centrifuge tube	Tarsons	500010
15 ml centrifuge tube	Tarsons	546021
35 mm cell culture dish	Tarsons	960010
50 ml centrifuge tube	Tarsons	546041
Acetic acid	Merck	A6283
Agarose	HiMedia	MB080
Agrose gel electrophoresis unit	BioRad	1704406
Biosafety Cabinet, ClassII	ESCO	AC2 4S
Bovine serum albumin	HiMedia	MB083
Centrifuge	Eppendorf	5424-R
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	BioRad	1855201
Cloning plates 90 mm	Tarson	460091
CO2 Incubator	New Brunswick	Galaxy 170R
Colibri Microvolume Spectrometer	Titertek-Berthold	11050140
DAB Substrate Kit	Abcam	ab94665
dATP Solution	NEB	N0440S
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set	NEB	N0446
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC)	SRL chemical	46791
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	HiMedia	MB058
DMEM high glucose	Lonza	BE12-604F
EcoR1-HF	NEB	R3101
EDTA tetrasodium salt dihydrate	HiMedia	GRM4918
Ethidium Bromide	Amresco	X328
Fetal bovine serum	Gibco	26140079
Formaldehyde	Fishser Scientific	12755
Gel Documentation System	ALPHA IMAGER
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP	Thermo Fisher	A16066
Hydrogen peroxide 30%	Merck	107209
Inverted microscope	Nickon	ECLIPSE Ts2
LB broth	HiMedia	M1245
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher	116680270	transfection reagent
Mechanical Pipette Set	Eppendorf	3120000909
Methanol	Merck	106009
Micro Tips 0.2-10 µl	Tarsons	521000
Micro Tips 10 - 100 µl	Tarsons	521010
Micro Tips 200-1000 µl	Tarsons	521020
MOPS buffer	GeNei	3601805001730
Nonessential aminoacids (NEAA)	Gibco	11140050
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C404010	E.coli DH5α
Opti-MEM	Gibco	1105-021	minimal essential medium
PCR tubes 0.2 ml	Tarsons	510051
Pencillin/streptomycin	Gibco	15070063
pGEM-T Easy Vector System	Promega	A1360	T-vector DNA
Phosphate buffer saline (PBS)	HiMedia	TI1099
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0530S
Pibrentasvir	Cayman Chemical	27546
Pipette controller	Gilson	F110120
Platinum Taq DNA Polymerase	Thermo	10966034
Prism	GraphPad		statistical analysis software
QIAamp Viral RNA Mini kit	Qiagen	52904	viral isolation kit
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104	cokum purification kit
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104	RNA cleanup kit
Serological Pipettes 25 ml	Thermo Fisher	170357N
Serological Pipettes 5 ml	Thermo Fisher	170355N
Serological Pipettes10 ml	Thermo Fisher	170356N
Single strand RNA Marker 0.2-10 kb	Merck	R7020
Skim milk	HiMedia	M530
Sodium azide 0.1 M solution	Merck	8591
SuperScript III Reverse Transcriptase	Invitrogen	18080044	reverse transcriptase
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
T175 cell culture flask	Tarsons	159910
T25 cell culture flask	Tarsons	950040
T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System	Promega	P1320	Large Scale RNA Production System
T75 cell culture flask	Tarsons	950050
Taq DNA Polymerase	Genetix Biotech (Puregene)	PGM040
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit	Applied Biosystems	4392653
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit	Thermo Fisher	4392653	commercial qRT-PCR kit
TOPO-XL--2 Complete PCR Cloning Kit	Thermo Fisher	K8050-10	kit for cloning of long-PCR product
Tris base	HiMedia	TC072
Trypsin-EDTA solution	HiMedia	TCL007
Tween 20	HiMedia	MB067
Vacuum Concentrator	Eppendorf, Concentrator Plus	100248
Water bath	GRANT	JBN-18
Xba1	NEB	R0145S