Реверсивная генетика для создания вариантов РНК-вируса с положительным смыслом

Резюме

В протоколе описан метод введения контролируемого генетического разнообразия в геном вируса гепатита С путем комбинирования полноразмерного синтеза мутантной РНК с использованием подверженной ошибкам ПЦР и обратной генетики. Метод обеспечивает модель селекции фенотипа и может быть использован для геномов вирусов с положительной РНК длиной 10 кб.

Аннотация

Отсутствие удобного метода итеративной генерации разнообразных полноразмерных вариантов вируса затрудняет изучение направленной эволюции РНК-содержащих вирусов. Интегрируя ПЦР с полным геномом, подверженным ошибкам, и обратную генетику, можно индуцировать мутагенез случайных замен на уровне генома. Мы разработали метод, использующий эту технику, для синтеза различных библиотек для идентификации вирусных мутантов с фенотипами, представляющими интерес. Этот метод, называемый полноразмерным синтезом мутантной РНК (FL-MRS), обладает следующими преимуществами: (i) возможность создания большой библиотеки с помощью высокоэффективной одноэтапной ПЦР, подверженной ошибкам; (ii) возможность создания групп библиотек с различными уровнями генетического разнообразия путем манипулирования достоверностью ДНК-полимеразы; (iii) создание полноразмерного ПЦР-продукта, который может непосредственно служить матрицей для синтеза мутантной РНК; и (iv) способность создавать РНК, которая может быть доставлена в клетки-хозяина в качестве неотобранного входного пула для скрининга вирусных мутантов желаемого фенотипа. Используя подход обратной генетики, мы обнаружили, что FL-MRS является надежным инструментом для изучения вирусно-направленной эволюции на всех этапах жизненного цикла вируса гепатита С, изолята JFH1. Этот метод, по-видимому, является бесценным инструментом, позволяющим использовать направленную эволюцию для понимания адаптации, репликации и роли вирусных генов в патогенезе и противовирусной резистентности у РНК-вирусов с положительным смыслом.

Введение

Прямой генетический скрининг начинается с интересующего нас вирусного фенотипа, а затем, путем секвенирования его генома и сравнения его с геномом исходного штамма, предпринимается попытка идентифицировать мутацию (мутации), вызывающую этот фенотип. В отличие от этого, при обратном генетическом скрининге случайные мутации вводятся в ген-мишень с последующим исследованием результирующего фенотипа (фенотипов)¹. Для подхода обратной генетики мутагенез in vitro является наиболее широко используемым методом для создания пула вариантов, которые впоследствии проверяются на наличие интересующих фенотипов. Сообщалось о различных генетических инструментах для достижения полногеномного случайного мутагенеза РНК-вирусов, включая подверженную ошибкам ПЦР (ep-PCR)^2,3, кольцевое расширение полимеразы⁴ и мутагенез вставки мю-транспозона 5,6,7. Последние два метода дают библиотеки с ограниченным разнообразием последовательностей и склонны к введению больших вставок и делеций, которые являются очень летальными для вирусов и серьезно ограничивают восстановление инфекционных вариантов вируса.

ep-ПЦР является хорошо известным мощным методом мутагенеза, широко используемым в белковой инженерии для получения мутантных ферментов для селекции фенотипов с желаемыми свойствами, такими как повышенная термическая стабильность, субстратная специфичность и каталитическая активность ^8,9,10. Эта методика проста в исполнении, потому что требует простого оборудования, не требует утомительных манипуляций, использует имеющиеся в продаже реагенты и является быстрой; Более того, он генерирует высококачественные библиотеки.

Здесь мы разработали новый метод синтеза полноразмерной мутантной РНК (FL-MRS) для получения полных геномов вируса гепатита С (HCV) путем интеграции ep-PCR, которая индуцирует мутагенез случайных замещений по всему геному и обратную генетику. Даже вставка или делеция одного нуклеотида крайне вредна для вирусов с положительной РНК ([+]ssRNA); следовательно, мутагенез замещения на основе ПЦР является предпочтительным методом для итеративной генерации больших, разнообразных библиотек полных (+)ss РНК вирусных геномов с хорошей жизнеспособностью.

FL-MRS — это простой подход, который может быть применен к любому РНК-вирусу с положительным смыслом и длиной генома ~10 кб благодаря тщательной разработке набора праймеров, который связывается с вирусным клоном кДНК. pJFH1 представляет собой инфекционный клон кДНК, который кодирует генотип вируса гепатита С 2a и может повторять все этапы жизненного цикла вируса. Используя подход FL-MRS, мы продемонстрировали синтез случайно мутагенизированных полногеномных библиотек (мутантных библиотек [ML]) для получения репликационно-компетентных вариантов JFH1, для которых не было предварительных знаний о свойствах, связанных с мутациями. При воздействии противовирусного препарата некоторые из вариантов вируса быстро преодолевали лекарственное давление с желаемым фенотипическим изменением. Используя описанный здесь протокол, можно создать множество вариантов вируса, что создает возможности для изучения эволюции (+)ssRNA-вирусов.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Используемый здесь штамм JFH1 (WT) был любезным подарком от Такадзи Вакиты, Национального института инфекционных заболеваний. Клеточная линия гепатомы человека, Huh7.5, была любезным подарком от Чарльза Райса из Рокфеллеровского университета. Схема метода представлена на рисунке 1.

1. Полногеномный мутагенез замещения JFH1 с использованием подверженной ошибкам ПЦР

1. Для проведения ep-ПЦР подготовьте мастер-микс для четырех серий экспериментов с праймерами J-For 5'-GTTTTCCCAGTCAGCACGTTGTAAAACGACGGC-3' и J-Rev 5'-CATGATCTGCAAGAGAGACCAGTTACGGCACTCTC -3' (рис. 1A), а также компонентами реакции, описанными в таблице 1 , без матрицы pJFH1 (плазмида, выделенная из штамма JFH1).
2. Распределите мастер-смесь по четырем пробиркам, добавьте 100 нг, 50 нг, 25 нг и 10 нг шаблона в отдельные пробирки и доведите общий объем реакции до 50 мкл. Примените условия циклирования, описанные в таблице 2, для амплификации фрагмента 9736 пары оснований (.о.), содержащего промотор Т7 и полноразмерный геном ВГС (рис. 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Продукт ep-PCR должен содержать последовательность промотора Т7, чтобы облегчить транскрипцию вирусного генома in vitro. Таким образом, прямой праймер должен располагаться выше промотора Т7 клона вирусной кДНК, а обратная последовательность праймера должна заканчиваться на 3'-конце генома вируса, чтобы облегчить расхождение транскрипции. Оптимизируйте каждый компонент реакции ep-PCR в диапазоне, рекомендованном производителем Taq ДНК-полимеразы, для достижения высокой амплификации. В дополнение к различным матричным количествам, несбалансированные dNTP (особенно низкая концентрация dATP и/или dGTP) также могут быть использованы для увеличения разнообразия в длине вирусных геномов от 6 до 8 kb.
3. Оценивают продукт ПЦР-ПЦР, амплифицируемый путем загрузки равных объемов продуктов ПЦР (5 мкл) и сравнения с известными количествами 1 килооснования (кб) лестницы ДНК путем проведения электрофореза в агарозном геле на основе 0,8% трис-ацетата-ЭДТА (ТАЕ)¹¹. Очистите продукт с помощью комплекта для очистки колонки в соответствии с указаниями производителя.
4. Оценивают концентрацию очищенного продукта, измеряя абсорбцию на длине волны 260 нм с помощью микрообъемного спектрофотометра¹². При необходимости продукт EP-PCR вакуумируют для получения концентрации продукта ≥100 нг/мкл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Более точную оценку можно сделать, загрузив двукратные серийные разведения продукта ep-PCR и сравнив их интенсивность с известными объемами 1 kb ДНК лестницы.

2. Синтез вирусной РНК

1. Проводят реакцию 40 мкл для расщепления 5 мкг клонального pJFH1 с 4 ЕД фермента XbaI при 37 °C в течение 2 ч с последующей очисткой колонки и измерением абсорбции при 260 нм в микрообъемном спектрофотометре¹². Организуют реакцию транскрипции in vitro в 20 мкл очищенного от колонки продукта ep-PCR или клонального pJFH1 (WT) с использованием коммерчески доступной крупномасштабной системы производства РНК в соответствии с инструкциями производителя.
2. В пробирке для микроцентрифуги объемом 200 мкл смешайте примерно 1 мкг очищенного продукта ep-PCR (мутантные библиотеки) или XbaI , расщепленного клонального pJFH1, 10 мкл 2x буфера, содержащего рибонуклеотиды, и 2 мкл смеси ферментов Т7. Смешайте все компоненты и быстро раскрутите компоненты. Инкубируют реакционную смесь при 37 °C в течение 45 мин с последующим добавлением 1 фермента ДНКазы, свободной от U-РНКазы, и инкубируют при 37 °C в течение 30 мин (рис. 1C).
3. Очистите синтезированную РНК in vitro с помощью набора для очистки РНК в соответствии с инструкциями производителя, элюируйте в 40 мкл воды, свободной от РНКазы и ДНКазы, и оцените концентрацию очищенной РНК, измерив абсорбцию при 260 нм с помощью микрообъемного спектрофотометра¹². Вносите аликвоты по мере необходимости (5 мкг или 2 мкг), чтобы избежать замораживания-оттаивания, и храните их при температуре −80 °C. Проверьте целостность и размер вирусных транскриптов, используя 2 мкг РНК для электрофореза MOPS формальдегидом 0,8% в агарозном геле¹³ (рис. 3).

3. Оценка доли мутаций в продуктах ep-ПЦР (мутантные библиотеки)

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе доля нуклеотидов мутирует путем субклонирования продукта, полученного на этапе 2. было продемонстрировано преимущество использования ЭП-ПЦР для создания генетической гетерогенности с использованием двух полногеномных мутантных библиотек (ML50 и ML25) и клональных вирусных РНК, полученных из pJFH1. Доля мутаций была оценена в гене HCV NS5A, который также был фенотипическим геном считывания (лекарственной устойчивости) в этом исследовании.

1. Организуют реакцию синтеза кДНК объемом 20 мкл, добавив примерно 1 мкг вирусной РНК, синтезированной на стадии 2, 5 мкМ обратного праймера 5'-GTGTACCTAGGTGTGCCGCTCTA-3' и 200 ЕД обратной транскриптазы в соответствии с рекомендациями производителя.
2. Используя кДНК, амплифицируют фрагмент длиной 2571.н., который содержит полный ген NS5A. Для этого готовят реакционную смесь, содержащую 0,5 мкМ для праймеров 5272F и 7848R (конечная концентрация; Таблица 3), 1,5 мМ MgCl₂, 1x ПЦР-буфер и 1 U высокоточной Taq-полимеразы в общем объеме 50 мкл и запустить цикл амплификации с использованием условий, описанных в таблице 4.
3. Нанесите продукт на 0,8% агарозный гель на основе ТАЕ, чтобы убедиться, что размер продукта составляет 2571.н., а затем очистите продукт с помощью набора для очистки колонки в соответствии с указаниями производителя. Элюируют очищенный в колонке продукт в 40 мкл стерильной воды.
4. Чтобы добавить к продукту выступ 3' A, добавьте 0,5 мкМ dATP и 1 U низкоточной Taq ДНК-полимеразы и инкубируйте весь продукт ПЦР при 70 °C в течение 30 мин вместе с 1x ПЦР-буфером и 1,5 мМ MgCl2_{(конечная} концентрация). Очистите смесь с помощью комплекта для очистки колонки в соответствии с указаниями производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы удалите продукт длиной ~9,7 кб из геля из шага 1.4. и выполнить клонирование с помощью имеющегося в продаже набора для клонирования продукта длинной ПЦР в соответствии с инструкциями производителя или выполнить NGS продукта ep-PCR с использованием платформы Illumina².
5. Организуют реакцию лигирования, добавив 5 мкл 2-кратного лигированного буфера, 50 нг ДНК Т-вектора, примерно 3-кратный молярный избыток вставной ДНК, синтезированной на стадии 3.4., 3 единицы Вейсса ДНК-лигазы Т4 и безнуклеазную воду до общего объема 10 мкл. Инкубируют эту реакцию при комнатной температуре в течение 3 ч, а затем добавляют 100 мкл Escherichia coli DH5α с лигированной ДНК; тепловой шок элементов при 42 °C в течение 35 с (рис. 1B).
6. Добавьте 1 мл среды Лурия-Бертани (LB) (без антибиотика) и инкубируйте при легком встряхивании в течение 1 ч при 37 °C для восстановления. Центрифугируют клеточную суспензию при концентрации 13 800 x g, выбрасывают надосадочную жидкость и ресуспендируют в 200 мкл свежей среды LB.
7. Планшет 100 мкл трансформированных клеток E. coli DH5α помещают на планшет LB, содержащий 50 мкг/мл ампициллина, и инкубируют при 37 °C в течение 16 ч. Устанавливают минипрепы из 25-30 колоний в 5 мл среды LB + 50 мкг/мл ампициллина и выращивают в течение ночи при 37 °C.
8. На следующий день экстрагируют плазмиды с помощью набора для очистки плазмид в соответствии с инструкциями производителя и проводят ферментное разложение рестрикции в объеме 10 мкл с 200 нг выделенных плазмид, 2 U EcoR1 и 1x рестрикционным буфером для всех колоний.
9. После инкубации смесей для разложения при 37 °C в течение 3 ч продукты растворяют на 0,8% агарозном геле на основе ТАЕ для подтверждения вставки плазмидной ДНК.
10. Для определения доли мутаций (выраженной в доле мутировавших нуклеотидов) в вирусных РНК, полученных из библиотек и клонального pJFH1, М13 обратного, 6208-SPF и 6748-SPF (табл. 3), проводят секвенирование по Сэнгеру плазмид 25 позитивных клонов с использованием праймеров M13 Forward, M13 reverse, 6208-SPF и 6748-SPF (табл. 3) (табл. 3).

4. Трансфекция вирусной РНК клеточной линии Huh7.5

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте материалы для культивирования тканей, не содержащие РНКазы/ДНКазы, и работайте в стерильном шкафу биобезопасности класса II. Работать в рекомендованном помещении для локализации в соответствии с рекомендациями по биобезопасности организации.

1. Поддерживайте клетки Huh7,5 путем инкубации в 5% инкубаторе CO₂ при 37 °C в колбе для тканевой культуры T75^см2 , содержащей 15 мл полной модифицированной орлиной среды (DMEM) Dulbecco с добавлением 10% (об./объем) фетальной бычьей сыворотки, пенициллина (100 Ед/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл; Рисунок 1D).
2. Разделите ячейки в соотношении 1:3, когда слияние достигнет 90%. Промойте клетки 1 предварительно подогретым фосфатно-солевым буфером (PBS; pH 7,4). Добавьте 5 мл 1x раствора трипсина-ЭДТА, чтобы полностью покрыть клеточный слой, осторожно встряхните колбу, а затем инкубируйте колбу при 37 °C в течение 5 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации может варьироваться; Инкубируйте клетки до тех пор, пока клеточный слой полностью не отделится от поверхности колбы с клеточной культурой.
3. Добавьте 10 мл 1x предварительно подогретого полного DMEM, диспергируйте клетки путем повторного пипетирования и соберите клеточную суспензию в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл или 50 мл. Центрифугируйте клеточную суспензию при 252 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клеточную гранулу в 6 мл полного DMEM и инкубируйте клетки при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5%_CO2.
4. Для непрерывного поддержания наивных, трансфицированных или инфицированных вирусом клеток Huh7.5 повторите шаг 4.2. и шаг 4.3.
5. За 1 день до трансфекции разделяют клетки, как описано в шагах 4.1.-4.3., подсчитывают количество жизнеспособных клеток с помощью гемоцитометра, засеивают клетки Huh7,5 плотностью 0,6 x 10,6 в чашки диаметром 35 мм в 2 мл полного DMEM и инкубируют клетки при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO₂.
6. На следующий день приготовьте транскрипт-липидный комплекс. Для этого 10 мкл трансфекционного реагента разводят в 50 мкл минимальной эссенциальной среды и отдельно разводят 5 мкг вирусных транскриптов в 50 мкл минимальной эссенциальной среды.
7. Инкубируют обе смеси при комнатной температуре в течение 10 мин, а затем смешивают их в одной стерильной микроцентрифужной пробирке и далее инкубируют смесь при комнатной температуре в течение 30 мин до образования транскрипт-липидного комплекса.
8. После 16 ч клеточной инкубации извлеките питательную среду из чашки для культивирования, промойте клетки 2 раза предварительно подогретым 1x PBS и добавьте 1,5 мл минимальной необходимой среды. Медленно добавьте в блюдо транскрипт-липидный комплекс и аккуратно перемешайте руками, чтобы обеспечить равномерное распределение комплексов.
9. Инкубируют клетки в инкубаторе с 5%_СО2 при 37 °C в течение 10 ч. Затем удалите среду, промойте трансфицированные клетки 2 раза 1 мл предварительно подогретого 1x PBS и добавьте 2 мл полного DMEM.

5. Производство вирусов

1. Разделяйте трансфицированные клетки Huh7.5 каждые 2 дня или 3 дня, когда они достигнут 90% слияния. Собирайте вирусные надосадочные вещества при каждом расщеплении и храните их при температуре −80 °C для дальнейшего анализа.
2. При каждом расщеплении отслеживайте распространение вируса с помощью фокусообразующего анализа (FFA), как описано в шаге 6.2. Собирайте вирус до тех пор, пока вирус не достигнет >80% трансфицированных клеток (рис. 1D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разделяйте трансфицированные клетки в соотношении 1:1 в течение первых нескольких пассажей, чтобы спасти максимальное количество вариантов вируса. Распространение вируса замедляется, а его жизнеспособность снижается с увеличением доли мутаций в полногеномных MLs².

6. Количественная оценка титров вирусов

1. Количественное определение вирусной РНК
   1. Выделите вирусную РНК из 140 мкл надосадочной жидкости культуры с помощью набора для выделения вирусной РНК в соответствии с инструкцией производителя.
   2. Настройте реакцию qRT-PCR на 10 мкл с помощью коммерческого набора для qRT-PCR в соответствии с инструкциями производителя. Для количественного определения РНК ВГС используют прямой праймер R6-130-S17, обратный праймер R6-290-R19 (конечная концентрация 0,2 мкМ каждый) и зонд R9-148-S21FT (конечная концентрация 0,3 мкМ) (таблица 3). Установите условия работы: 48 °C в течение 20 мин, 95 °C в течение 10 мин, а затем 45 циклов по 95 °C в течение 15 с и 60 °C в течение 1 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Зонд должен содержать флуоресцентный репортерный краситель 6-карбоксифлуоресцеин (FAM) и гаситель красителя 6-карбокси-тетраметилродамин (TAMRA) на концах 5' и 3' соответственно.
   3. Запускайте реакции в ПЦР-машине в режиме реального времени. Установите отрицательный контроль, т.е. РНК, извлеченную из надосадочной жидкости фиктивных инфицированных клеток, и воду, не содержащую нуклеаз, одновременно, чтобы обеспечить отсутствие перекрестного загрязнения.
   4. Параллельно постройте стандартную кривую, используя 10-кратное последовательно разбавленное известное число копий транскриптов ВГС (1 x 10⁸ к 0) для количественного определения вирусной РНК. Выполните количественную оценку в трех экземплярах (рис. 1D).
2. Количественное определение титра инфекционного вируса с использованием 50% инфекционной дозы тканевой культуры (TCID₅₀)
   1. Примерно за 16 ч до добавления вируса распределите 6,5 x 10^{по 3} Huh7,5 клеток/лунку в 96-луночный планшет и инкубируйте клетки при 37 °C в инкубаторе с 5%_CO2 .
   2. В шкафу класса биобезопасности II выполните 10-кратное последовательное разведение (по 1 мл каждое), охватывающее от 1 x 10−¹ до 1 x 10⁻⁶ разведений (восемь разведений) собранного вируса (полученного, когда распространение вируса достигает >80% клеток, как описано в шаге 5). Добавьте 100 мкл/лунку (с восемью репликациями) разбавленного вируса, чтобы заразить клетки Huh7,5, и держите планшет в инкубаторе при температуре 37 °C с 5% CO₂ в течение 3 дней.
   3. Через 3 дня промывают инфицированные клетки 3 раза 0,1 мл PBS каждый раз, фиксируют и пермеабилизируют клетки 0,1 мл ледяного метанола при −20 °C в течение 20 минут. Промойте лунки 1x PBS 3x, а затем 1x PBS-T (1x PBS/0,1% [v/v] Tween-20).
   4. После удаления PBS-T заблокируйте клетки на 30 мин при комнатной температуре 0,1 мл 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), содержащего 0,2% обезжиренного молока в PBST. Удаляют блокирующий раствор и обрабатывают клетки в течение 5 мин 0,1 мл 3%_H2O₂ , приготовленного в 1x PBS.
   5. Опять же, промывают клетки 2 раза 1x PBS и 1x PBS-T, затем добавляют 50 мкл/лунку анти-NS5A 9E10 mAb (1:10000, запас 1 мг/мл; любезный подарок от Чарльза Райса, Рокфеллеровский университет) и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч. Промойте лунки еще раз 3 раза с помощью 1x PBS и 1 раз с PBS-T.
   6. Добавьте 50 мкл/лунку HRP-конъюгированного козьего противомышиного вторичного IgG (1:4000), инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре, а затем удалите несвязанное антитело, промыв лунки 0,1 мл 1x PBS.
   7. Добавьте 30 мкл цветного субстрата DAB (диаминобензидина тетрагидрохлорида) и инкубируйте планшет при легком покачивании в течение 10 минут при комнатной температуре. Субстрат образует коричневый осадок на поверхности лунки, который указывает на антиген HCV NS5A. Удалите раствор DAB и промойте лунки 2 раза 1 PBS и 1 раз дистиллированной водой. Добавьте 100 мкл PBS, содержащего 0,03% азида натрия.
   8. Исследуйте каждую лунку под микроскопом с инвертированным светом с помощью 10-кратного объектива. Подсчитайте количество положительных скважин. Если лунка содержит одну или несколько NS5A-положительных клеток, то она положительна; если лунка показывает отсутствие NS5A-положительных клеток, то она отрицательная. Используйте калькулятор Рида и Мюнха для оценки конечной точки разбавления, которая заражает 50% лунок (TCID₅₀)^14,15. Обратной величиной разведения, необходимого для получения TCID₅₀, является титр инфекционности вируса (единицы, образующие очаги) на единицу объема.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Титры заразности вирусов различаются для разных мутантных библиотек.

7. Выбор варианта вируса с лекарственной устойчивостью

1. Пибрентасвир (ПИБ), ингибитор NS5A, растворяют в 100% ДМСО до концентрации 1 мМ и далее разбавляют его в полном ДМЕМ до концентрации 10 нМ.
2. Чтобы определить 50% эффективную концентрацию ПИБ, высевают клетки Huh7,5 с плотностью 0,6 x 10 6/лунку в^{6-луночный} планшет и инкубируют клетки при 37 °C в инкубаторе с 5% CO₂ . После 16 ч клеточной инкубации добавляют дозу вируса ML50 или клонального вируса JFH1 для инфицирования 50% клеток, а затем, через 12 ч после заражения, обрабатывают клетки серией двойного разведения PIB в диапазоне от 0,5 до 100 пМ. Измерьте FFA и количественно определите FFU, как показано на шаге 6.2. после 3 дней инкубации.
3. Постройте графики зависимости от дозы и эффекта, используя значения анализа снижения БОЕ в программном обеспечении для статистического анализа. По сигмоидальной кривой получаем 50%-ную эффективную концентрацию (EC₅₀; Рисунок 5).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Диапазон эффективных концентраций может варьироваться в зависимости от класса, между противовирусными препаратами ВГС одного и того же класса и в зависимости от библиотеки мутантов.
4. Для эксперимента инфицировать наивные клетки Huh7.5 при 70%-ном слиянии с вирусом ML50 (варианты, производные от РНК ML50), чтобы заразить 50% клеток в течение 12 ч, а затем перенести инфицированные клетки на 6-луночные планшеты через 24 ч после заражения.
5. Добавьте 1x EC₅₀ PIB (47,3 пМ) к инфицированным клеткам через 16 часов после расщепления клеток. Делайте это после каждого деления клетки в течение шести последовательных пассажей (18 дней), за которыми следуют три цикла пассажа без лекарств, и отслеживайте распространение вируса с помощью СЖК, как описано в шаге 6.2. Масштабирование реагентов FFA в соответствии с областью роста. Собирайте вирусные надосадочные вещества при каждом прохождении и храните их при температуре −80 °C до использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Распространение вируса более чем на 50% клеток во время последующего лечения может быть определено как прорыв, а распространение вируса в период отмены препарата может быть определено как рецидив вируса¹⁶.
6. Извлеките вирусную РНК из надосадочной жидкости на 18-й день, как описано в шаге 6.1.1., а затем синтезируйте кДНК, как показано на этапе 3.1. Амплифицируют ген NS5A, используя 5 мкл разбавленной кДНК в соотношении 1:5 и компоненты ПЦР, описанные в шаге 3.2. Затем выполните шаги 3.3.-3.5. определить мутации лекарственной устойчивости NS5A в 6-8 позитивных бактериальных плазмидах с использованием праймеров секвенирования NS5A 6186F, 6862F и 6460R (табл. 3 и табл. 4).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании мы сообщили о замене в NS5A вариантов, выбранных во время лечения ПИБ при 1x EC₅₀. Это исключит вклад замен, отличных от NS5A, в снижение восприимчивости к ПИБ.

Результаты

В соответствии с процедурами, описанными на рисунке 1, можно создать множество полноразмерных вариантов гепатита С и провести скрининг на наличие фенотипов лекарственной устойчивости, представляющих интерес. Полногеномные мутантные библиотеки синтезировали с исполь?...

Обсуждение

В этом исследовании мы подробно описали простую и быструю процедуру FL-MRS, которая объединяет ep-PCR¹⁸ и обратную генетику для синтеза полногеномных библиотек HCV, которые затем могут быть использованы в системе клеточных культур для создания репликационно-компетентных вариант...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb plus DNA ladder	Thermo Fisher	10787018
1.5 ml centrifuge tube	Tarsons	500010
15 ml centrifuge tube	Tarsons	546021
35 mm cell culture dish	Tarsons	960010
50 ml centrifuge tube	Tarsons	546041
Acetic acid	Merck	A6283
Agarose	HiMedia	MB080
Agrose gel electrophoresis unit	BioRad	1704406
Biosafety Cabinet, ClassII	ESCO	AC2 4S
Bovine serum albumin	HiMedia	MB083
Centrifuge	Eppendorf	5424-R
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	BioRad	1855201
Cloning plates 90 mm	Tarson	460091
CO2 Incubator	New Brunswick	Galaxy 170R
Colibri Microvolume Spectrometer	Titertek-Berthold	11050140
DAB Substrate Kit	Abcam	ab94665
dATP Solution	NEB	N0440S
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set	NEB	N0446
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC)	SRL chemical	46791
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	HiMedia	MB058
DMEM high glucose	Lonza	BE12-604F
EcoR1-HF	NEB	R3101
EDTA tetrasodium salt dihydrate	HiMedia	GRM4918
Ethidium Bromide	Amresco	X328
Fetal bovine serum	Gibco	26140079
Formaldehyde	Fishser Scientific	12755
Gel Documentation System	ALPHA IMAGER
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP	Thermo Fisher	A16066
Hydrogen peroxide 30%	Merck	107209
Inverted microscope	Nickon	ECLIPSE Ts2
LB broth	HiMedia	M1245
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher	116680270	transfection reagent
Mechanical Pipette Set	Eppendorf	3120000909
Methanol	Merck	106009
Micro Tips 0.2-10 µl	Tarsons	521000
Micro Tips 10 - 100 µl	Tarsons	521010
Micro Tips 200-1000 µl	Tarsons	521020
MOPS buffer	GeNei	3601805001730
Nonessential aminoacids (NEAA)	Gibco	11140050
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C404010	E.coli DH5α
Opti-MEM	Gibco	1105-021	minimal essential medium
PCR tubes 0.2 ml	Tarsons	510051
Pencillin/streptomycin	Gibco	15070063
pGEM-T Easy Vector System	Promega	A1360	T-vector DNA
Phosphate buffer saline (PBS)	HiMedia	TI1099
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0530S
Pibrentasvir	Cayman Chemical	27546
Pipette controller	Gilson	F110120
Platinum Taq DNA Polymerase	Thermo	10966034
Prism	GraphPad		statistical analysis software
QIAamp Viral RNA Mini kit	Qiagen	52904	viral isolation kit
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104	cokum purification kit
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104	RNA cleanup kit
Serological Pipettes 25 ml	Thermo Fisher	170357N
Serological Pipettes 5 ml	Thermo Fisher	170355N
Serological Pipettes10 ml	Thermo Fisher	170356N
Single strand RNA Marker 0.2-10 kb	Merck	R7020
Skim milk	HiMedia	M530
Sodium azide 0.1 M solution	Merck	8591
SuperScript III Reverse Transcriptase	Invitrogen	18080044	reverse transcriptase
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
T175 cell culture flask	Tarsons	159910
T25 cell culture flask	Tarsons	950040
T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System	Promega	P1320	Large Scale RNA Production System
T75 cell culture flask	Tarsons	950050
Taq DNA Polymerase	Genetix Biotech (Puregene)	PGM040
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit	Applied Biosystems	4392653
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit	Thermo Fisher	4392653	commercial qRT-PCR kit
TOPO-XL--2 Complete PCR Cloning Kit	Thermo Fisher	K8050-10	kit for cloning of long-PCR product
Tris base	HiMedia	TC072
Trypsin-EDTA solution	HiMedia	TCL007
Tween 20	HiMedia	MB067
Vacuum Concentrator	Eppendorf, Concentrator Plus	100248
Water bath	GRANT	JBN-18
Xba1	NEB	R0145S