JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול מתאר שיטה להחדרת מגוון גנטי נשלט בגנום נגיף הפטיטיס C על ידי שילוב סינתזת RNA מוטנטית באורך מלא באמצעות PCR נוטה לשגיאות וגנטיקה הפוכה. השיטה מספקת מודל לבחירת פנוטיפ וניתן להשתמש בה עבור גנומים ארוכים של 10 קילובייט של נגיף RNA בעל חוש חיובי.

Abstract

היעדר שיטה נוחה ליצירה איטרטיבית של גרסאות ויראליות מגוונות באורך מלא פגע בחקר האבולוציה המכוונת בנגיפי RNA. על ידי שילוב של PCR גנום RNA מלא הנוטה לטעויות וגנטיקה הפוכה, ניתן לגרום למוטגנזה של החלפה אקראית בכל הגנום. פיתחנו שיטה המשתמשת בטכניקה זו כדי לסנתז ספריות מגוונות כדי לזהות מוטנטים נגיפיים עם פנוטיפים מעניינים. שיטה זו, הנקראת סינתזת RNA מוטנטי באורך מלא (FL-MRS), מציעה את היתרונות הבאים: (i) היכולת ליצור ספרייה גדולה באמצעות PCR יעיל ביותר הנוטה לשגיאות בשלב אחד; (ii) היכולת ליצור קבוצות של ספריות עם רמות שונות של מגוון גנטי על ידי מניפולציה של נאמנות DNA פולימראז; (iii) יצירת מוצר PCR באורך מלא שיכול לשמש ישירות כתבנית לסינתזה של RNA מוטנטי; ו-(iv) היכולת ליצור RNA שיכול להיות מועבר לתאים מארחים כמאגר קלט שלא נבחר כדי לסנן מוטציות נגיפיות של הפנוטיפ הרצוי. מצאנו, תוך שימוש בגישה גנטית הפוכה, כי FL-MRS הוא כלי אמין לחקר אבולוציה מכוונת נגיפים בכל שלבי מחזור החיים של נגיף הפטיטיס C, JFH1 מבודד. נראה כי טכניקה זו היא כלי רב ערך לשימוש באבולוציה מכוונת כדי להבין הסתגלות, שכפול ותפקידם של גנים נגיפיים בפתוגנזה ועמידות אנטי-ויראלית בנגיפי RNA בעלי חוש חיובי.

Introduction

סינון גנטי מתקדם מתחיל בפנוטיפ ויראלי מעניין ולאחר מכן, באמצעות ריצוף הגנום שלו והשוואתו לזה של הזן המקורי, מנסה לזהות את המוטציה (ים) הגורמת לפנוטיפ זה. לעומת זאת, במסכים גנטיים הפוכים, מוטציות אקראיות מוצגות בגן המטרה, ולאחר מכן בדיקה של הפנוטיפ(ים)1 המתקבלים. עבור הגישה הגנטית ההפוכה, מוטגנזה במבחנה היא הטכניקה הנפוצה ביותר ליצירת מאגר של וריאנטים אשר לאחר מכן מוקרן עבור פנוטיפים של עניין. כלים גנטיים שונים דווחו להשגת מוטגנזה אקראית כלל-גנומית של נגיפי RNA, כולל PCR נוטה לשגיאות (ep-PCR)2,3, הרחבת פולימראז מעגלית4, ומוטגנזה החדרת Mu-transposon 5,6,7. שתי השיטות האחרונות מניבות ספריות בעלות מגוון רצפים מוגבל ומועדות להכנסת החדרות ומחיקות גדולות, שהן קטלניות מאוד לנגיפים ומגבילות מאוד את ההתאוששות של וריאנטים נגיפיים זיהומיים.

ep-PCR היא טכניקת מוטגנזה חזקה ידועה הנמצאת בשימוש נרחב בהנדסת חלבונים ליצירת אנזימים מוטנטיים לבחירת פנוטיפים בעלי תכונות רצויות, כגון יציבות תרמית משופרת, ספציפיות המצע ופעילות קטליטית 8,9,10. טכניקה זו קלה לביצוע מכיוון שהיא דורשת ציוד פשוט, אינה כרוכה במניפולציות מייגעות, משתמשת בריאגנטים זמינים מסחרית והיא מהירה; יתר על כן, הוא מייצר ספריות באיכות גבוהה.

כאן, פיתחנו שיטה חדשנית לסינתזה של RNA מוטנטי באורך מלא (FL-MRS) ליצירת גנומים שלמים של נגיף הפטיטיס C (HCV) על ידי שילוב ep-PCR, אשר גורם למוטגנזה חלופית אקראית בכל הגנום וגנטיקה הפוכה. אפילו החדרה או מחיקה של נוקלאוטידים בודדים מזיקה מאוד לנגיפי RNA בעלי חוש חיובי ([+]ssRNA); לפיכך, מוטגנזה חלופית מבוססת PCR היא השיטה המועדפת ליצירה איטרטיבית של ספריות גדולות ומגוונות של גנומים מלאים (+)ss RNA virus עם כדאיות טובה.

FL-MRS היא גישה פשוטה שניתן ליישם על כל וירוס RNA בעל חוש חיובי עם אורך גנום ~ 10 kb באמצעות תכנון קפדני של ערכת פריימר שנקשרת לשיבוט cDNA נגיפי. pJFH1 הוא שיבוט cDNA מדבק המקודד את גנוטיפ HCV 2a ויכול לשחזר את כל שלבי מחזור החיים של הנגיף. על ידי שימוש בגישת FL-MRS, הדגמנו את הסינתזה של ספריות גנום מלא מוטגניות אקראיות (ספריות מוטנטיות [MLs]) כדי לייצר גרסאות JFH1 כשירות לשכפול שלגביהן לא היה ידע מוקדם על התכונות הקשורות למוטציות. עם החשיפה לתרופה אנטי-ויראלית, חלק מהווריאנטים הנגיפיים התגברו במהירות על לחץ התרופה עם השינוי הפנוטיפי הרצוי. באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן, ניתן ליצור שפע של וריאנטים נגיפיים, היוצרים הזדמנויות לחקור את האבולוציה של (+)נגיפי ssRNA.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: זן JFH1 (WT) המשמש כאן היה מתנה חביבה מטקאג'י וואקיטה, המכון הלאומי למחלות זיהומיות. קו תאי הפטומה האנושי, Huh7.5, היה מתנה חביבה מצ'ארלס רייס, אוניברסיטת רוקפלר. סכמה של השיטה מוצגת באיור 1.

1. מוטגנזה חלופית כלל-גנומית של JFH1 באמצעות PCR נוטה לשגיאות

  1. כדי לבצע ep-PCR, הכינו את תערובת האב לארבע קבוצות של ניסויים עם פריימרים J-For 5'-GTTTTCCCAGTCAGCACGTTGTAAAACGACGGC-3' ו-J-Rev 5'-CATGATCTGCAGAGAGAGAGAGTTACGGCACTCTC -3' (איור 1A), יחד עם רכיבי התגובה המתוארים בטבלה 1 ללא תבנית pJFH1 (פלסמיד מבודד מזן JFH1).
  2. הרכיבו את תערובת האב לארבעה צינורות, הוסיפו 100 ננוגרם, 50 נ"ג, 25 נ"ג ו-10 ננוגרם של תבנית לצינורות הבודדים, והתאימו את נפח התגובה הכולל ל-50 מיקרוליטר. יישמו את תנאי המחזור המתוארים בטבלה 2 כדי להגביר מקטע של זוג בסיסים 9736 (bp) הכולל את מקדם T7 ואת גנום HCV באורך מלא (איור 2).
    הערה: מוצר ep-PCR חייב להכיל את רצף מקדם T7 כדי להקל על שעתוק חוץ גופי של הגנום הנגיפי. לכן, הפריימר הקדמי חייב להיות ממוקם במעלה הזרם של מקדם T7 של שיבוט cDNA נגיפי, ורצף הפריימר ההפוך צריך להסתיים בקצה 3 'של גנום הנגיף כדי להקל על ריצת השעתוק. מטב כל רכיב של תגובת ep-PCR בטווח המומלץ על ידי היצרן של Taq DNA פולימראז כדי להשיג הגברה בעלת תפוקה גבוהה. בנוסף לכמויות תבנית מגוונות, dNTPs לא מאוזנים (במיוחד ריכוז dATP ו/או dGTP נמוך) יכולים לשמש גם להגדלת הגיוון באורך הגנום הנגיפיים מאורך 6-8 קילובייט3.
  3. הערך את מוצר ep-PCR מוגבר על ידי טעינת נפחים שווים של מוצרי PCR (5 μL) והשוואת כמויות ידועות של סולם DNA של 1 קילו-בסיס (kb) על ידי הפעלת אלקטרופורזה11 של ג'ל אגרוז מבוסס Tris-אצטט-EDTA (TAE) 0.8%. לטהר את המוצר באמצעות ערכת טיהור עמודות לפי הוראות היצרן.
  4. להעריך את ריכוז המוצר המטוהר על ידי מדידת הספיגה ב 260 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח12. יש לרכז ואקום את המוצר ep-PCR במידת הצורך כדי לקבל ריכוז מוצר ≥100 ng/μL.
    הערה: ניתן לבצע הערכה מדויקת יותר על ידי טעינת דילולים סדרתיים כפולים של מוצר ep-PCR והשוואת העוצמות שלהם לכמויות הידועות של סולם DNA של 1 קילובייט.

2. סינתזת RNA ויראלי

  1. הגדר תגובה של 40 μL לעיכול 5 מיקרוגרם של pJFH1 משובט עם 4 U של אנזים XbaI ב-37°C למשך שעתיים, ולאחר מכן טיהור עמודות ומדידת ספיגה ב-260 ננומטר בספקטרופוטומטר מיקרו-נפח12. הגדר תגובת שעתוק חוץ גופית של 20 μL של מוצר ep-PCR מטוהר עמודות או clonal-pJFH1 (WT) באמצעות מערכת ייצור RNA בקנה מידה גדול הזמינה מסחרית בהתאם להוראות היצרן.
  2. בצינור מיקרוצנטריפוגה של 200 μL, יש לערבב כ-1 מיקרוגרם של מוצר ep-PCR מטוהר (ספריות מוטנטיות) או XbaI מעוכל clonal-pJFH1, 10 μL של חיץ 2x המכיל ריבונוקלאוטידים, ו-2 μL של תערובת אנזימים T7. מערבבים את כל הרכיבים ומסובבים לזמן קצר את הרכיבים. דגור על תערובת התגובה ב-37°C במשך 45 דקות, ולאחר מכן הוסיפו אנזים DNase נטול U RNase אחד ודגירה ב-37°C למשך 30 דקות (איור 1C).
  3. לטהר RNA מסונתז במבחנה באמצעות ערכת ניקוי RNA בהתאם להוראות היצרן, לפלוט 40 μL של מים נטולי RNase ו- DNase, ולהעריך את ריכוז ה- RNA המטוהר על ידי מדידת הספיגה ב 260 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו נפח12. הכינו אליציטוטים לפי הצורך (5 מיקרוגרם או 2 מיקרוגרם) כדי למנוע הפשרה בהקפאה ואחסנו אותם בטמפרטורה של -80°C. אמת את השלמות והגודל של התעתיקים הנגיפיים על-ידי שימוש ב-2 מיקרוגרם RNA עבור אלקטרופורזה ג'ל אגרוז 0.8% MOPS פורמלדהיד13 (איור 3).

3. הערכת שיעור המוטציות במוצרי ep-PCR (ספריות מוטנטיות)

הערה: בשלב זה, שיעור הנוקלאוטידים שעבר מוטציה על-ידי שיבוט משנה של המוצר המתקבל בשלב 2. הוערך כמדגים את היתרון של שימוש ב- ep-PCR ליצירת הטרוגניות גנטית באמצעות שתי ספריות מוטנטיות גנום מלאות (ML50 ו- ML25) ו- RNA נגיפי pJFH1 משובט. שיעור המוטציות הוערך בגן HCV NS5A, שהיה גם הגן הפנוטיפי (עמידות לתרופות) במחקר זה.

  1. הגדר תגובת סינתזת cDNA של 20 μL על ידי הוספת כ- 1 מיקרוגרם של ה- RNA הנגיפי המסונתז בשלב 2., פריימר הפוך 5'-GTGTACCTAGTGTGTGCCGCTCTA-3', ו- 200 U שעתוק לאחור בהתאם להמלצות היצרן.
  2. באמצעות cDNA, להגביר מקטע 2571 bp המרכיב את הגן NS5A השלם. לשם כך, הכינו תערובת תגובה המכילה 0.5 מיקרומטר עבור פריימרים 5272F ו- 7848R (ריכוז סופי; טבלה 3), 1.5 mM MgCl2, 1x PCR buffer, ו-1 U high-fidelity Taq polymerase בנפח כולל של 50 μL ולהפעיל מחזור הגברה באמצעות התנאים המתוארים בטבלה 4.
  3. הפעל את המוצר על ג'ל אגרוז מבוסס TAE 0.8% כדי לאשר את גודל המוצר של 2571 bp ולאחר מכן לטהר את המוצר באמצעות ערכת טיהור עמודות לפי הוראות היצרן. יש לטהר את המוצר המטוהר ב-40 מיקרוליטר מים סטריליים.
  4. כדי להוסיף כיסוי של 3' A למוצר, הוסף 0.5 μM dATP ו- 1 U של Taq DNA פולימראז באיכות נמוכה ודגור על מוצר ה- PCR כולו ב- 70 ° C למשך 30 דקות יחד עם מאגר PCR אחד ו- 1.5 mM MgCl2 (ריכוז סופי). לטהר את התערובת באמצעות ערכת טיהור עמודים לפי הוראות היצרן
    הערה: לחלופין, הבלו את המוצר ~ 9.7 kb ארוך מן הג'ל משלב 1.4. ולבצע שיבוט באמצעות ערכה זמינה מסחרית לשיבוט מוצר PCR ארוך בהתאם להוראות היצרן או לבצע NGS של מוצר ep-PCR באמצעות פלטפורמת Illumina2.
  5. הגדר תגובת קשירה על ידי הוספת 5 μL של 2x חיץ קשירה, 50 ng של DNA וקטור T, עודף מולארי בערך פי 3 של ה- DNA להחדיר מסונתז בשלב 3.4., 3 יחידות Weiss של ליגאז T4 DNA, ומים נטולי nuclease לנפח כולל של 10 μL. לדגור על תגובה זו בטמפרטורת החדר במשך 3 שעות ולאחר מכן להוסיף 100 μL של Escherichia coli DH5α עם ה- DNA הקשירה; החום מזעזע את התאים בטמפרטורה של 42°C למשך 35 שניות (איור 1B).
  6. יש להוסיף 1 מ"ל Luria-Bertani (LB) בינוני (ללא אנטיביוטיקה) ולדגור עם רעד עדין במשך שעה אחת ב-37°C להתאוששות. צנטריפוגה את מתלה התא ב 13,800 x גרם, להשליך את supernatant, ו resuspend ב 200 μL של LB בינוני טרי.
  7. צלחת 100 μL של תאי E. coli DH5α מותמרים על צלחת LB המכילה 50 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין ולדגור ב 37 ° C במשך 16 שעות. הגדר minipreps של 25-30 מושבות ב 5 מ"ל של LB בינוני + 50 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין ולגדול בן לילה ב 37 ° C.
  8. למחרת, לחלץ את פלסמידים עם ערכת טיהור פלסמיד על פי הוראות היצרן ולבצע עיכול אנזים הגבלה בנפח 10 μL עם 200 ng של פלסמידים מבודדים, 2 U של EcoR1, ו 1x חיץ הגבלה עבור כל המושבות.
  9. לאחר הדגירה של תערובות העיכול ב 37 ° C במשך 3 שעות, לפתור את המוצרים על 0.8% ג'ל agarose מבוסס TAE כדי לאשר החדרת DNA פלסמיד.
  10. בצעו ריצוף Sanger של פלסמידים של 25 שיבוטים חיוביים באמצעות פריימרים M13 Forward, M13 reverse, 6208-SPF ו-6748-SPF (טבלה 3) כדי לקבוע את שיעור המוטציות (מבוטא כשיעור הנוקלאוטידים שעברו מוטציה) ב-RNA הנגיפי שמקורו בספריות וב-pJFH1 השבטי (איור 1B ואיור 4).

4. טרנספקציה RNA ויראלי של קו התאים Huh7.5

הערה: השתמש בחומרי תרבית רקמות נטולי RNase/DNase ועבוד בארון בטיחות ביולוגית סטרילי Class II. עבודה במתקן ההכלה המומלץ בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית של הארגון.

  1. שמור על תאי Huh7.5 על ידי דגירה באינקובטור 5% CO 2 ב 37 ° C בבקבוק תרבית רקמהT75 ס"מ2 המכיל 15 מ"ל של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) בתוספת 10% (vol/vol) נסיוב בקר עוברי, פניצילין (100 U/mL) וסטרפטומיצין (100 מיקרוגרם/מ"ל; איור 1D).
  2. פצל את התאים ביחס של 1:3 כאשר המפגש מגיע ל- 90%. שטפו את התאים במי מלח חוממים מראש עם פוספט (PBS; pH 7.4). הוסף 5 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA 1x כדי לכסות לחלוטין את שכבת התא, מערבל בעדינות את הצלוחית, ולאחר מכן לדגור על הבקבוק ב 37 ° C במשך 5 דקות.
    הערה: זמן הדגירה עשוי להשתנות; דוגרים על התאים עד לניתוק מוחלט של שכבת התא משטח בקבוק תרבית התא.
  3. הוסף 10 מ"ל של 1x DMEM מלא שחומם מראש, לפזר את התאים על ידי פיפטינג חוזר, ולאסוף את תרחיף התא בצינור צנטריפוגה סטרילית 15 מ"ל או 50 מ"ל. צנטריפוגה את מתלה התא ב 252 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש את גלולת התא ב-6 מ"ל של DMEM מלא, ודגרו על התאים בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח עם 5% CO2.
  4. לתחזוקה מתמשכת של תאי Huh7.5 נאיביים, נגועים או נגועים בנגיף, חזור על שלב 4.2. ושלב 4.3.
  5. יום אחד לפני הטרנספקציה, לפצל את התאים כמתואר בשלבים 4.1.-4.3., לספור את מספר התאים קיימא באמצעות המוציטומטר, לזרוע את תאי Huh7.5 בצפיפות של 0.6 x 106 ב 35 מ"מ צלחות ב 2 מ"ל של DMEM מלא, ולדגור את התאים ב 37 ° C באינקובטור לח עם 5% CO2.
  6. למחרת, הכינו את קומפלקס התמלול-שומנים. כדי לעשות זאת, לדלל 10 μL של מגיב transfection ב 50 μL של מדיום חיוני מינימלי, בנפרד לדלל 5 מיקרוגרם של תעתיקים ויראליים ב 50 μL של מדיום חיוני מינימלי.
  7. דוגרים על שתי התערובות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, ולאחר מכן מערבבים אותן בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי יחיד וממשיכים לדגור על התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות ליצירת קומפלקס השומנים.
  8. לאחר 16 שעות של דגירה של תאים, להסיר את המדיום תרבית מן צלחת התרבית, לשטוף את התאים 2x עם שחומם מראש 1x PBS, ולהוסיף 1.5 מ"ל של מדיום חיוני מינימלי. לאט להוסיף את קומפלקס שומני התמליל לצלחת ולערבל בעדינות עם הידיים כדי להבטיח פיזור אחיד של המתחמים.
  9. לדגור את התאים באינקובטור 5% CO2 ב 37 ° C במשך 10 שעות. לאחר מכן, להסיר את המדיום, לשטוף את התאים transfected 2x עם 1 מ"ל של שחומם מראש 1x PBS, ולהוסיף 2 מ"ל של DMEM מלא.

5. ייצור וירוסים

  1. לפצל את תאי Huh7.5 transfected כל 2 ימים או 3 ימים כאשר הם מגיעים 90% מפגש. אספו סופרנאטנטים של וירוסים בכל פיצול ואחסנו אותם בטמפרטורה של -80°C לניתוח נוסף.
  2. בכל פיצול, עקוב אחר התפשטות הנגיף באמצעות בדיקת יצירת מיקוד (FFA) כמתואר בשלב 6.2. קצרו את הנגיף עד שהתפשטות הנגיף תגיע ל->80% מהתאים הנגועים (איור 1D).
    הערה: פצל את התאים הנגועים ביחס של 1:1 עבור המעברים הראשונים כדי להציל את המספר המרבי של וריאנטים נגיפיים. התפשטות הנגיף מואטת והכדאיות פוחתת עם שיעור גדל והולך של מוטציות בגנום המלא MLs2.

6. כימות של טיטרים וירוס

  1. כימות RNA נגיפי
    1. בודדו RNA נגיפי מ-140 μL של סופרנאטנטים בתרבית באמצעות ערכת בידוד RNA נגיפי בהתאם להוראות היצרן.
    2. הגדר תגובת qRT-PCR של 10 μL באמצעות ערכת qRT-PCR מסחרית בהתאם להוראות היצרן. השתמש בפריימר הקדמי R6-130-S17, בפריימר ההפוך R6-290-R19 (בריכוז הסופי 0.2 מיקרומטר כל אחד), ובבדיקה R9-148-S21FT (ריכוז סופי 0.3 מיקרומטר) לכימות HCV RNA (טבלה 3). הגדר את תנאי הריצה כ- 48 ° C למשך 20 דקות, 95 ° C למשך 10 דקות, ולאחר מכן 45 מחזורים של 95 ° C למשך 15 שניות ו- 60 ° C למשך דקה אחת.
      הערה: הגשושית צריכה להכיל את צבע הכתב הפלואורסצנטי 6-carboxyfluorescein (FAM) ואת צבע המרווה 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine (TAMRA) בקצוות 5' ו-3', בהתאמה.
    3. הפעל תגובות במכשיר PCR בזמן אמת. הגדרת בקרות שליליות, כלומר, RNA המופק מהסופרנאטנטים של תאים נגועים מדומה ומים נטולי נוקלאז בו זמנית כדי להבטיח היעדר זיהום צולב.
    4. במקביל, צור עקומה סטנדרטית באמצעות מספר העתק ידוע בדילול סדרתי פי 10 של תעתיקי HCV (1 x 108 עד 0) לכימות RNA נגיפי. בצעו את הכימות בטריפליקט (איור 1D).
  2. כימות טיטר וירוס זיהומי באמצעות מינון זיהומי של 50% תרבית רקמה (TCID50)
    1. כ 16 שעות לפני הוספת הנגיף, צלחת 6.5 x 103 תאים Huh7.5 / באר בצלחת 96 באר לדגור את התאים ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2 .
    2. בארון בטיחות ביולוגית מסוג II, בצע דילולים סדרתיים פי 10 (1 מ"ל כל אחד) המכסים 1 x 10 עד 1 x 10 x 6 דילולים (שמונה דילולים) של הנגיף שנקצר (המתקבל כאשר התפשטות הנגיף מגיעה ל ->80% מהתאים כמתואר בשלב 5). הוסף 100 μL / באר (עם שמונה עותקים משוכפלים) של הנגיף המדולל כדי להדביק את תאי Huh7.5 ולשמור את הצלחת באינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 3 ימים.
    3. לאחר 3 ימים, לשטוף את התאים הנגועים 3x עם 0.1 מ"ל של PBS בכל פעם, לתקן ולחדור את התאים עם 0.1 מ"ל של מתנול קר כקרח ב -20 ° C במשך 20 דקות. שטפו את הבארות עם 1x PBS 3x ולאחר מכן 1x עם PBS-T (1x PBS/0.1% [v/v] Tween-20).
    4. לאחר הסרת PBS-T, חסום את התאים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם 0.1 מ"ל של אלבומין בסרום בקר 1% (BSA) המכיל 0.2% חלב דל שומן ב- PBST. הסר את הפתרון החוסם וטפל בתאים במשך 5 דקות עם 0.1 מ"ל של 3%H 2 O2 מוכן 1x PBS.
    5. שוב, לשטוף את התאים 2x עם 1x PBS ו 1x עם PBS-T, ולאחר מכן להוסיף 50 μL / באר של anti-NS5A 9E10 mAb (1:10000, מלאי 1 מ"ג / מ"ל; מתנה נדיבה מצ'ארלס רייס, אוניברסיטת רוקפלר), ולדגור בטמפרטורת החדר במשך 1 שעות. לשטוף את הבארות שוב 3x עם 1x PBS ו 1x עם PBS-T.
    6. הוסף 50 μL / באר של IgG משני נגד עכבר עז מצומדת HRP (1:4000), לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להסיר את הנוגדן הלא קשור על ידי שטיפת הבארות עם 0.1 מ"ל של 1x PBS.
    7. מוסיפים 30 μL של מצע צבע DAB (diaminobenzidine tetrahydrochloride) ודגרו על הצלחת בנדנוד עדין במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. המצע מפתח משקע חום על פני הבאר המציין אנטיגן HCV NS5A. הסר את תמיסת DAB ושטוף את הבארות 2x עם 1x PBS ו 1x עם מים מזוקקים. הוסף 100 μL של PBS המכיל 0.03% נתרן אזיד.
    8. בחנו כל באר תחת מיקרוסקופ אור הפוך באמצעות מטרה פי 10. לספור את מספר הבארות החיוביות. אם הבאר מכילה תא חיובי אחד או יותר NS5A, אז זה חיובי; אם הבאר מראה היעדר תאים חיוביים NS5A, אז זה שלילי. השתמש במחשבון Reed and Muench כדי להעריך את דילול נקודות הקצה שמדביק 50% מהבארות (TCID50)14,15. אחד הגומלין של הדילול הנדרש כדי להניב את TCID50 הוא טיטר ההדבקה של הנגיף (יחידות יוצרות מוקדים) ליחידת נפח.
      הערה: טיטרים של הדבקה בווירוסים משתנים עבור ספריות מוטנטיות שונות.

7. בחירת וריאנטים נגיפיים עמידים לתרופות

  1. להמיס pibrentasvir (PIB), מעכב NS5A, ב 100% DMSO לריכוז של 1 mM ועוד לדלל אותו DMEM מלא לריכוז של 10 nM.
  2. כדי לקבוע את הריכוז האפקטיבי של 50% של PIB, זרעו תאי Huh7.5 בצפיפות של 0.6 x 10 6/well בצלחת בעלת6 בארות ודגרו על התאים ב-37°C באינקובטור CO2 של 5%. לאחר 16 שעות של דגירה של תאים, הוסף מנה של וירוס ML50 או וירוס JFH1 משובט כדי להדביק 50% מהתאים, ולאחר מכן, 12 שעות לאחר ההדבקה (h p.i.), טפל בתאים עם סדרת דילול כפולה של PIB בטווח של 0.5-100 pM. מדוד את ה- FFA וכמת FFU כמו בשלב 6.2. לאחר 3 ימי דגירה.
  3. התווה את עקומות המינון-תגובה באמצעות ערכי בדיקת הפחתת FFU בתוכנת ניתוח סטטיסטי. מן העקומה sigmoidal, לקבל את הריכוז האפקטיבי 50% (EC50; איור 5).
    הערה: טווח הריכוז האפקטיבי עשוי להשתנות בהתאם למחלקה, בין אנטי-ויראלים של HCV מאותה סוגה, ובהתאם לספרייה המוטנטית .
  4. לצורך הניסוי, הדביקו תאי Huh7.5 נאיביים במפגש של 70% עם נגיף ML50 (וריאנטים שמקורם ב-ML50 RNA) כדי להדביק 50% מהתאים במשך 12 שעות, ולאחר מכן העבירו את התאים הנגועים ללוחות 6 בארות 24 שעות לאחר ההדבקה.
  5. הוסף 1x EC50 PIB (47.3 pM) לתאים הנגועים לאחר 16 שעות של פיצול תאים. בצע זאת לאחר שכל תא התפצל במשך שישה מעברים רצופים (18 יום), ולאחר מכן שלושה מחזורי מעבר ללא תרופות, ועקוב אחר התפשטות הנגיף באמצעות FFAs כמתואר בשלב 6.2. ריאגנטים FFA בקנה מידה גדול בהתאם לאזור הגידול. יש לקצור סופרנאטנטים נגיפיים בכל מעבר ולאחסן אותם בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.
    הערה: התפשטות נגיפית ליותר מ-50% מהתאים במהלך מעקב הטיפול עשויה להיות מוגדרת כפריצת דרך, והתפשטות נגיפית במהלך תקופת הגמילה מתרופות עשויה להיות מוגדרת כהישנות נגיפית16.
  6. לחלץ RNA נגיפי מהסופרנאטנט ביום ה-18, כמתואר בשלב 6.1.1., ולאחר מכן לסנתז cDNA, כפי שמוצג בשלב 3.1. להגביר את הגן NS5A באמצעות 5 μL של cDNA מדולל 1:5 ואת רכיבי PCR המתוארים בשלב 3.2. לאחר מכן, בצע את שלבים 3.3.-3.5. כדי לקבוע מוטציות עמידות לתרופות NS5A ב-6-8 פלסמידים חיידקיים חיוביים באמצעות פריימרים לריצוף NS5A 6186F, 6862F ו-6460R (טבלה 3 וטבלה 4).
    הערה: כאן במחקר זה, דיווחנו על החלפות ב- NS5A של וריאנטים שנבחרו במהלך טיפול PIB ב- 1x EC50. זה ישלול את התרומה של תחליפים שאינם NS5A ברגישות מופחתת PIB.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

שפע של וריאנטים של HCV באורך מלא יכולים להיווצר ולהיבדק עבור פנוטיפים עמידים לתרופות בעלי עניין בעקבות ההליכים המתוארים באיור 1. ספריות מוטנטיות מלאות של גנום סונתזו באמצעות pJFH1 משובט בכמויות יורדות (100-10 ננוגרם), כפי שמוצג באיור 2. התשואות הממוצעות של מוצרי ep-...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

במחקר זה, פירטנו הליך FL-MRS פשוט ומהיר המשלב ep-PCR18 וגנטיקה הפוכה לסינתזה של ספריות HCV בגנום מלא, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בהן במערכת תרבית תאים כדי ליצור וריאנטים בעלי יכולת שכפול לסינון פנוטיפים עמידים לתרופות. השימוש ב- Taq DNA polymerase בנאמנות נמוכה הוא תנאי מוקדם של ep-PCR המאפשר שילוב...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

תמיכה במימון (מספר מענק BT/PR10906/MED/29/860/2014) למחקר זה ניתנה על ידי המחלקה לביוטכנולוגיה, ממשלת הודו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 kb plus DNA ladder Thermo Fisher10787018
1.5 ml centrifuge tubeTarsons500010
15 ml centrifuge tubeTarsons546021
35 mm cell culture dish Tarsons960010
50 ml centrifuge tubeTarsons546041
Acetic acidMerckA6283
Agarose HiMediaMB080
Agrose gel electrophoresis unitBioRad1704406
Biosafety Cabinet, ClassIIESCOAC2 4S
Bovine serum albuminHiMediaMB083
Centrifuge Eppendorf5424-R
CFX Connect Real-Time PCR Detection SystemBioRad1855201
Cloning plates 90 mm Tarson460091
CO2 Incubator New BrunswickGalaxy 170R
Colibri Microvolume SpectrometerTitertek-Berthold11050140
DAB Substrate Kit Abcamab94665
dATP SolutionNEBN0440S
Deoxynucleotide (dNTP) Solution SetNEBN0446
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) SRL chemical46791
Dimethyl sulphoxide (DMSO)HiMediaMB058
DMEM high glucoseLonzaBE12-604F
EcoR1-HFNEBR3101
EDTA tetrasodium salt dihydrateHiMediaGRM4918
Ethidium BromideAmrescoX328
Fetal bovine serum Gibco26140079
Formaldehyde Fishser Scientific12755
Gel Documentation SystemALPHA IMAGER
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRPThermo FisherA16066
Hydrogen peroxide 30%Merck107209
Inverted microscopeNickon ECLIPSE Ts2
LB broth HiMediaM1245
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher116680270transfection reagent
Mechanical Pipette SetEppendorf  3120000909
MethanolMerck106009
Micro Tips 0.2-10 µl Tarsons521000
Micro Tips 10 - 100 µl Tarsons521010
Micro Tips 200-1000 µl Tarsons521020
MOPS buffer GeNei3601805001730
Nonessential aminoacids (NEAA)Gibco11140050
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coliInvitrogenC404010E.coli DH5α
Opti-MEMGibco1105-021minimal essential medium
PCR tubes 0.2 mlTarsons510051
Pencillin/streptomycin Gibco15070063
pGEM-T Easy Vector SystemPromegaA1360T-vector DNA
Phosphate buffer saline (PBS)HiMediaTI1099
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseNEBM0530S
PibrentasvirCayman Chemical27546
Pipette controller Gilson F110120
Platinum Taq DNA Polymerase Thermo10966034
PrismGraphPadstatistical analysis software
QIAamp Viral RNA Mini kit Qiagen52904viral isolation kit
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106
QIAquick PCR Purification KitQIAGEN28104cokum purification kit
RNeasy Mini Kit QIAGEN74104RNA cleanup kit
Serological Pipettes 25 mlThermo Fisher170357N
Serological Pipettes 5 mlThermo Fisher170355N
Serological Pipettes10 mlThermo Fisher170356N
Single strand RNA Marker 0.2-10 kbMerckR7020
Skim milk HiMediaM530
Sodium azide 0.1 M solutionMerck8591
SuperScript III Reverse Transcriptase Invitrogen18080044reverse transcriptase
T100 Thermal CyclerBioRad1861096
T175 cell culture flask Tarsons159910
T25 cell culture flask Tarsons950040
T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System PromegaP1320 Large Scale RNA Production System 
T75 cell culture flask Tarsons950050
Taq DNA PolymeraseGenetix Biotech (Puregene)PGM040
TaqMan RNA-to-CT 1-Step KitApplied Biosystems4392653
TaqMan RNA-to-CT 1-Step KitThermo Fisher4392653commercial qRT-PCR kit 
TOPO-XL--2 Complete PCR Cloning KitThermo FisherK8050-10kit for cloning of long-PCR product 
Tris baseHiMediaTC072
Trypsin-EDTA solutionHiMediaTCL007
Tween 20HiMediaMB067
Vacuum Concentrator Eppendorf, Concentrator Plus100248
Water bath GRANTJBN-18
Xba1NEBR0145S

References

  1. Desselberger, U. Reverse genetics of rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2106-2108 (2017).
  2. Singh, D., et al. Genome-wide mutagenesis of hepatitis C virus reveals ability of genome to overcome detrimental mutations. Journal of Virology. 94 (3), 01327(2020).
  3. Agarwal, S., Baccam, P., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Novel synthesis and phenotypic analysis of mutant clouds for hepatitis E virus genotype 1. Journal of Virology. 92 (4), 01932(2018).
  4. Edmonds, J., et al. A novel bacterium-free method for generation of flavivirus infectious DNA by circular polymerase extension reaction allows accurate recapitulation of viral heterogeneity. Journal of Virology. 87 (4), 2367-2372 (2013).
  5. Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathogens. 4 (10), 1000182(2008).
  6. Heaton, N. S., Sachs, D., Chen, C. -J., Hai, R., Palese, P. Genome-wide mutagenesis of influenza virus reveals unique plasticity of the hemagglutinin and NS1 proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20248-20253 (2013).
  7. Eyre, N. S., et al. Genome-wide mutagenesis of dengue virus reveals plasticity of the NS1 protein and enables generation of infectious tagged reporter viruses. Journal of Virology. 91 (23), 01455(2017).
  8. Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. Directed evolution: Past, present, and future. AIChE Journal. American Institute of Chemical Engineers. 59 (5), 1432-1440 (2013).
  9. Sen, S., Venkata Dasu, V., Mandal, B. Developments in directed evolution for improving enzyme functions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 143 (3), 212-223 (2007).
  10. Yuan, L., Kurek, I., English, J., Keenan, R. Laboratory-directed protein evolution. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 373-392 (2005).
  11. Green, M. R., Sambrook, J. Analysis of DNA by agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (1), (2019).
  12. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565(2010).
  13. Rio, D. C. Denaturation and electrophoresis of RNA with formaldehyde. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 219-222 (2015).
  14. Lindenbach, B. D. Measuring HCV infectivity produced in cell culture and in vivo. Methods in Molecular Biology. 510, 329-336 (2009).
  15. Lei, C., Yang, J., Hu, J., Sun, X. On the calculation of TCID50 for quantitation of virus infectivity. Virologica Sinica. 36 (1), 141-144 (2021).
  16. Soni, S., Singh, D., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Enhanced fitness of hepatitis C virus increases resistance to direct-acting antivirals. The Journal of General Virology. 103 (2), (2022).
  17. Khan, S., Soni, S., Veerapu, N. S. HCV replicon systems: Workhorses of drug discovery and resistance. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 10, 325(2020).
  18. Cadwell, R. C., Joyce, G. F. Randomization of genes by PCR mutagenesis. PCR Methods and Applications. 2 (1), 28-33 (1992).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

RNARNAPCRRNA FL MRSDNARNAC HCVJFH1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved