Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يحدد قياس التنفس عالي الدقة إلى جانب مستشعرات التألق استهلاك أكسجين الميتوكوندريا وتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). يصف هذا البروتوكول تقنية لتقييم معدلات التنفس الميتوكوندريا وإنتاج ROS في العصب الوركي المتغلغل.

Abstract

يصاحب خلل الميتوكوندريا في الأعصاب الطرفية العديد من الأمراض المرتبطة بالاعتلال العصبي المحيطي ، والذي يمكن أن يحدث لأسباب متعددة ، بما في ذلك أمراض المناعة الذاتية والسكري والالتهابات والاضطرابات الموروثة والأورام. يمكن أن يكون تقييم وظيفة الميتوكوندريا في الأعصاب الطرفية للفأر أمرا صعبا بسبب صغر حجم العينة ، وعدد محدود من الميتوكوندريا الموجودة في الأنسجة ، ووجود غمد المايلين. تقلل التقنية الموصوفة في هذا العمل من هذه التحديات باستخدام بروتوكول نفاذية فريد من نوعه مقتبس من بروتوكول يستخدم لألياف العضلات ، لتقييم وظيفة الميتوكوندريا العصبية الوركية بدلا من عزل الميتوكوندريا عن الأنسجة. من خلال قياس إنتاج الأنواع التفاعلية الفلورية باستخدام Amplex Red / Peroxidase ومقارنة ركائز ومثبطات الميتوكوندريا المختلفة في الأعصاب النفاذة للسابونين ، كان من الممكن اكتشاف حالات الجهاز التنفسي للميتوكوندريا ، وأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، ونشاط مجمعات الميتوكوندريا في وقت واحد. لذلك ، فإن الطريقة المعروضة هنا تقدم مزايا مقارنة بتقييم وظيفة الميتوكوندريا بواسطة تقنيات أخرى.

Introduction

الميتوكوندريا ضرورية للحفاظ على صلاحية الخلية وأداء العديد من وظائف الخلية مثل استقلاب الطاقة (الجلوكوز والأحماض الأمينية والدهون ومسارات استقلاب النيوكليوتيدات). باعتبارها الموقع الرئيسي لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، فإن الميتوكوندريا مركزية في العديد من عمليات إشارات الخلايا مثل موت الخلايا المبرمج وتشارك في تخليق مجموعات الحديد والكبريت (Fe-S) ، واستيراد بروتين الميتوكوندريا ونضجه ، والحفاظ على الجينوم والريبوسومات1،2،3. يتم التحكم في شبكة ديناميكيات غشاء الميتوكوندريا عن طريق عمليات الاندماج والانشطار ، ولديهم أيضا آلات لمراقبة الجودة و mitophagy 4,5,6.

يرتبط خلل الميتوكوندريا بظهور العديد من الحالات المرضية مثل السرطان والسكري والسمنة7. يتم الكشف عن اضطرابات في وظيفة الميتوكوندريا في الاضطرابات العصبية التنكسية التي تؤثر على الجهاز العصبي المركزي ، كما هو الحال في مرض الزهايمر 8,9 ، ومرض باركنسون 10,11 ، والتصلب الجانبي الضموري 12,13 ، ومرض هنتنغتون 14,15 . في الجهاز العصبي المحيطي ، لوحظ فقدان وظيفة الميتوكوندريا في المحاور العصبية في الاعتلالات العصبية المناعية ، مثل متلازمة غيلان باريه 16,17 ، وبالاقتران مع ارتفاع إنتاج ROS الميتوكوندريا في المحاور العصبية ، تؤدي هذه الأحداث إلى تنشيط كيناز MAP في خلايا شوان18. هذا يدل على أن فسيولوجيا الميتوكوندريا قد تكون ضرورية ليس فقط لخلية خاصة بالموقع ، ولكن لنسيج بأكمله. في اعتلال الأعصاب الحسي البعيد المرتبط بفيروس نقص المناعة البشرية (HIV-DSP) ، يكون للميتوكوندريا دور في الآلية التي يسمح من خلالها المنشط العابر لبروتين النسخ (HIV-TAT) لفيروس نقص المناعة البشرية بالتكاثر بكفاءة ، بالإضافة إلى العديد من الأدوار الأخرى في التسبب في عدوى فيروس نقص المناعة البشرية19,20.

ظهر تقييم فسيولوجيا الميتوكوندريا العصبية الوركية كهدف أساسي للتحقيق في الاعتلال العصبي7،21،22. في الاعتلال العصبي السكري ، تشير التحليلات البروتينية والأيضية إلى أن معظم التغيرات الجزيئية في مرض السكري تؤثر على الفسفرة التأكسدية للميتوكوندريا الوركية للعصب الوركي واستقلاب الدهون7. يبدو أن هذه التعديلات هي أيضا علامات مبكرة لمرض السكري الناجم عن السمنة21. في نموذج الفأر للاعتلال العصبي المؤلم الناجم عن العلاج الكيميائي ، يتم الكشف عن ضعف الميتوكوندريا في العصب الوركي كانخفاض في الفسفرة التأكسدية22 ، وانخفاض في أنشطة مجمعات الميتوكوندريا ، وإمكانات الغشاء ، ومحتوى ATP23. ومع ذلك ، على الرغم من أن العديد من المجموعات قد استشهدت بخلل الميتوكوندريا في الاعتلالات العصبية ، إلا أن هذه الدراسات تقتصر على قياسات النشاط في مجمعات الميتوكوندريا دون الحفاظ على أغشية الميتوكوندريا ، وتفتقر إلى تقييم سلامة الميتوكوندريا أو قياسات محتوى ATP كمعلمة لإنتاج ATP الميتوكوندريا. بشكل عام ، يتطلب التقييم السليم لاستهلاك أكسجين الميتوكوندريا وإنتاج ROS عزل الميتوكوندريا عن طريق الطرد المركزي التفاضلي في تدرج percoll / sucrose. يمكن أن يكون عزل الميتوكوندريا أيضا عاملا مقيدا للأنسجة العصبية الوركية بسبب الكمية الكبيرة من الأنسجة اللازمة وفقدان الميتوكوندريا وتعطيلها.

تهدف هذه الدراسة إلى توفير بروتوكول لقياس فسيولوجيا الميتوكوندريا مثل استهلاك أكسجين الميتوكوندريا وإنتاج ROS في العصب الوركي ، والحفاظ على أغشية الميتوكوندريا ودون الحاجة إلى عزل الميتوكوندريا. تم تكييف هذا البروتوكول من قياسات استهلاك الأكسجين في ألياف العضلات المتخلل24 بواسطة قياس التنفس عالي الدقة (HRR). تتمثل مزايا هذا الإجراء في إمكانية تقييم الميتوكوندريا في كميات صغيرة من الأنسجة مثل العصب الوركي وتقييم معلمات الميتوكوندريا في الموقع ، وبالتالي الحفاظ على بيئة الميتوكوندريا وهيكلها وملف تعريف الطاقة الحيوية ، للحصول على نتيجة جديرة بالثقة من الناحية الفسيولوجية. تم تحديد الحالات التنفسية للميتوكوندريا باستخدام ركائز ومثبطات بعد نفاذية العصب الوركي لتقييم الطاقة الحيوية للميتوكوندريا ومعامل السيتوكروم ج بشكل صحيح لسلامة غشاء الميتوكوندريا ، مما يوفر دليلا لخطوات تقييم نظام نقل إلكترون الميتوكوندريا (ETS) وحساب المعلمات الأساسية. يمكن أن توفر هذه الدراسة أدوات للإجابة على الأسئلة في الآليات الفسيولوجية المرضية التي يتورط فيها استقلاب العصب الوركي ، مثل الاعتلالات العصبية المحيطية.

Protocol

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل لجنة الأخلاقيات المعنية باستخدام الحيوانات في البحوث، CCS/UFRJ (CEUA-101/19)، والمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام التجارب. يتم عزل العصب الوركي من الفئران الذكور C57BL / 6 البالغة من العمر أربعة أشهر ، ويتم قتلها الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. تم تحسين خطوات البروتوكول لتجنب تدهور الميتوكوندريا. لذلك ، في هذا البروتوكول ، تم إجراء معايرة أجهزة استشعار الأكسجين القطبي قبل تشريح الأنسجة العصبية الوركية للفأر ونفاذها.

1. إعداد الكواشف

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت للحفاظ على الأنسجة (TP Buffer).
    1. قم بإعداد الكواشف التالية في محلول مائي فائق النقاء: 10 ملليمتر من المخزن المؤقت Ca-EGTA مع 0.1 ميكرومتر من الكالسيوم الحر ، 20 ملليمتر من الإيميدازول ، 20 ملليمتر من التورين ، 50 ملليمتر من K-MES ، 0.5 ملليمتر من DTT ، 6.56 ملليمتر من MgCl2 ، 5.77 ملليمتر من ATP ، 15 ملليمتر من الفوسفوكرياتين (انظر جدول المواد) ، الرقم الهيدروجيني 7.1. يخزن على درجة حرارة -20 درجة مئوية.
  2. تحضير المخزن المؤقت للتنفس الميتوكوندريا (MR Buffer).
    1. تحضير الكواشف التالية في محلول مائي فائق النقاء: 0.5 mM من K 2 EGTA ، 3 mM من MgCl 2 ، 60 mM من MES ، 20 mM من التوراين ، 10 mM من KH2PO 4 ، 20 mM من HEPES ، 110 mM من D-sucrose ، 1 mg / mL من BSA (خالية من الأحماض الدهنية) (انظر جدول المواد) ، الرقم الهيدروجيني7.4. يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
  3. تحضير محلول مخزون الصابونين عن طريق إذابة 5 ملغ من الصابونين (انظر جدول المواد) في 1 مل من TP Buffer (الخطوة 1.1) والاحتفاظ به على الجليد. يتم إعداد الصابونين طازجا.
  4. قم بتحضير Amplex Red عن طريق تعليق المسحوق (انظر جدول المواد) باستخدام DMSO للحصول على تركيز مخزون يبلغ 2 mM وتخزينه عند -20 درجة مئوية في قارورة محمية من الضوء.
    ملاحظة: لتجنب تآكل المسبار عن طريق التجميد والذوبان ، قم بعمل أليكوتات صغيرة للتخزين لا تزيد عن 6 أشهر25.

2. معايرة أجهزة استشعار الأكسجين القطبي لقياس التنفس عالي الدقة (HRR)

  1. تنظيف غرف HRR من الأداة والمحاقن (انظر جدول المواد).
    1. افتح غرف HRR ، املأها بالماء المقطر حتى الأعلى وحرك لمدة 5 دقائق 3x. كرر مع الإيثانول ثم مرة أخرى بالماء. اغسل السدادات والمحاقن بالماء / الإيثانول / الماء 3 أضعاف لكل منهما.
  2. قم بتطبيق إعدادات المعايرة التالية في برنامج HRR (انظر جدول المواد).
    1. في التحكم في برنامج HRR ، أضف درجة الحرارة التجريبية (37 درجة مئوية) ، ومعلمات مستشعر الأكسجين (الكسب ، 2 ؛ جهد الاستقطاب ، 800 mV) ، ومستشعر الأمبيرومترية (الكسب ، 1000 ؛ جهد الاستقطاب ، 100 mV).
  3. معايرة أجهزة استشعار الأكسجين.
    1. ماصة 2.1 مل من MR Buffer (الخطوة 1.2) في كل غرفة. أغلق مع السدادات واسحب الهواء إلى الغرفة حتى يتم تشكيل فقاعة. يحرك المزيج على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في وضع المعايرة حتى يستقر تدفق الأكسجين لكل كتلة.
    2. قم بإجراء معايرة الهواء لمستشعرات الأكسجين المستقطبة في البرنامج وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة24.
      ملاحظة: يتم تنفيذ خطوة المعايرة مرة واحدة فقط قبل إجراء تجربة. يمكن إجراء تجارب إضافية في نفس وسط التنفس ودرجة الحرارة بعد مجرد غسل الغرف (الخطوة 2.1).

3. تشريح ونفاذية العصب الوركي

  1. قم بإزالة العصب الوركي باتباع الخطوات أدناه.
    1. القتل الرحيم للحيوان عن طريق خلع عنق الرحم بعد إزالته من قفصه وتقييده بلطف للراحة على مقاعد البدلاء.
    2. في الحيوان الرحيم ، قم بعمل شق بمقص في أسفل الظهر ، بدءا من العمود الفقري والمضي قدما أسفل الفخذ نحو القدم. إزالة الجلد والعضلات المرتبطة بالعصب ، ثم قطع وإزالة العصب الوركي بأكمله.
    3. قم بوزن الأنسجة على الفور وضعها في قارورة مليئة بمخزن السل البارد (4 درجات مئوية). نفذ الخطوات من 3.2 إلى 3.3 على الجليد.
      ملاحظة: يتم استخدام وزن الأنسجة الرطبة لتطبيع استهلاك الأكسجين وتدفق إنتاج ROS في الخطوات التالية. إذا تعذر وزن الأنسجة على الفور، فاحفظها في مخزن السل البخاخ البارد. يتم تنفيذ الإجراء في الأنسجة الطازجة ويجب عدم تجميده لتجنب تلف الميتوكوندريا.
  2. لإعداد الأنسجة ، ضع العصب الوركي في طبق بتري مع ما يكفي من TP Buffer لتغطيته. امسك أحد طرفي العصب بملقط ، ومع زوج آخر من الملقط ، اسحب الحزم العصبية أفقيا.
    ملاحظة: يجب أن يتم هذا الإجراء في أقل من 10 دقائق لتجنب تدهور الأنسجة. سيكون النسيج جاهزا عندما يمكن تصوره كطبقات ضبابية شفافة ، مقابل الأنسجة البيضاء غير الشفافة السابقة (الشكل 1).
  3. أولا ، انقل الأنسجة الملتفة إلى طبق صغير يحتوي على 1 مل من TP Buffer لتخلل الأنسجة. لبدء الاختراق ، انقل الأنسجة بالملقط إلى طبق يحتوي على 1 مل من TP Buffer و 10 ميكرولتر من الصابونين (من محلول المخزون ، الخطوة 1.3).
    1. رج المزيج في صفيحة صغيرة بلطف لمدة 30 دقيقة، ثم انقل الأنسجة مع الملقط إلى طبق طازج يحتوي على MR Buffer (1 مل) ورجه بلطف لمدة 10 دقائق. انقل الأنسجة باستخدام الملقط إلى غرفة HRR معايرة.

4. استهلاك الأكسجين وتحديد إنتاج ROS

  1. املأ غرف HRR ب 2.1 مل من MR Buffer ، وأضف Amplex Red (الخطوة 1.4) إلى تركيز نهائي قدره 5 ميكرومتر وبيروكسيديز إلى 2 U / mL ، وأضف العصب الوركي المتخلل (الخطوة 3).
    1. قم بتوصيل مستشعرات التألق الخاصة بالجهاز، وأطفئ الأنوار الموجودة في قسم التحكم في البرنامج، واضغط على الاتصال ب oxygraph. في "تحرير البروتوكولات" في البرنامج، أدخل وزن الأنسجة الذي تم قياسه في الخطوة 3.1.3.
  2. انتقل إلى "التخطيط" ، واختر خيار "التدفق المحدد لكل وحدة عينة" ، وحدد المؤامرات للوصول في وقت واحد إلى قراءة استهلاك الأكسجين ، وإذا رغبت في ذلك ، إنتاجH 2 O2. انتظر ~ 10 دقائق.
    ملاحظة: هذه المرة مطلوبة لتحقيق الاستقرار في التدفق القاعدي لاستهلاك الأكسجين بدون ركيزة مضافة (قاعدية). قبل المزيد من الحقن ، تأكد من استقرار تدفق الأكسجين.
  3. حقن نبضتين من H 2 O2، كل واحدة إلى تركيز نهائي قدره 260 ميكرومتر ، للمعايرة اللاحقة في الغرفة.
  4. حقن 20 ميكرولتر من السكسينات (انظر جدول المواد) ، وهي ركيزة مجمع الميتوكوندريا II ، لتنشيط نظام نقل إلكترونات الميتوكوندريا.
    ملاحظة: يمكن إضافة ركائز الميتوكوندريا المختلفة في هذه المرحلة لتقييم وظيفة الميتوكوندريا بواسطة مجمعات مختلفة. تظهر النتائج التمثيلية ذات الركائز المختلفة لمجمعات الميتوكوندريا الأولى والثانية في الشكل 2 والشكل 3. عند هذه النقطة ، لوحظ في الشكل 3 زيادةفي استهلاك O 2وإنتاج H 2 O2 ، في وقت واحد.
  5. أضف 20 ميكرولتر من ثنائي فوسفات الأدينوسين (ADP) لتنشيط تخليق الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP).
    ملاحظة: ADP يحفز تخليق ATP ويقلل من إمكانات الغشاء. ومن المتوقع ملاحظة زيادة في استهلاك O 2 وانخفاض في إنتاج H2O2 26,27.
  6. بالتسلسل ، أضف 5 ميكرولتر من السيتوكروم c (انظر جدول المواد) كمؤشر على سلامة الغشاء.
    ملاحظة: إذا كان النسيج مستعدا جيدا ومتغلغلا ، فيجب ألا يزيد السيتوكروم c من استهلاك الأكسجين بأكثر من 15٪. في حالة حدوث ذلك، راجع قسم استكشاف الأخطاء وإصلاحها للحصول على توصيات.
  7. معايرة مع أليكوتس من 0.2 ميكروغرام / مل من oligomycin (انظر جدول المواد) حتى لا يلاحظ أي انخفاض آخر في استهلاك O2 .
    ملاحظة: يعمل Oligomycin عن طريق تثبيط تخليق ATP مما يؤدي إلى انخفاض في تدفق O 2 وتعزيز في تكوين H 2 O2الذي يفضله إمكانات الغشاء العالية 26,27.
  8. معايرة مع أليكوتس من 0.5 ميكرومول / لتر من سيانيد الكربونيل 4-(ثلاثي فلورو ميثوكسي) فينيل هيدرازون (FCCP) (انظر جدول المواد) ، والميتوكوندريا غير المقترنة ، حتى يصبح من الممكن ملاحظة أي زيادة أخرى في استهلاك O2 . لإنهاء التجربة ، حقن 2 ميكرولتر من antimycin A إلى تركيز نهائي قدره 5 ميكرومتر وانتظر استقرار التدفق.
    ملاحظة: لوحظ انخفاض في إنتاج H 2O2 بسبب تبديد الغشاء المحتمل بعد حقن FCCP. يمنع Antimycin A المركب III ، وبالتالي يمنع تدفق الإلكترونات. لذلك ، فإن استهلاك O 2 المعتمد على الميتوكوندريا ضعيف ، مما يقلل من تدفق الأكسجين لكل كتلة ويحفز تسرب الإلكترون ، مما يزيد من إنتاج H 2 O2 26,27.
  9. انتقل إلى شريط الأوامر ، وابحث عن "متعدد الحواس" في البرنامج ، وانقر فوق التحكم > حفظ الملف وقطع الاتصال.
    ملاحظة: يمكن إجراء إضافة ركائز ومثبطات أخرى وفقا للسؤال قيد الدراسة. يتم وصف مثال في النتائج التمثيلية. يتم إجراءمعايرة H 2 O2 بعد الانتهاء من التجربة ، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة28.
  10. افتح الملف المحفوظ وحدد أثر "تدفق الأكسجين لكل كتلة" للحصول على نتائج استهلاك الأكسجين التجريبية. حدد النافذة يدويا بين الحقن بالضغط على زر Shift + الماوس الأيسر.
    1. انتقل إلى Marks > Statistics لتصور النتائج لكل حقنة من الركيزة / المثبطات / البروتوكول غير المقترن. لإنتاج H 2O2 ، قم بإجراء نفس الإجراء باستخدام تتبع "Amp-Slope".
      ملاحظة: عند تحديد النافذة، تجنب القطع الأثرية لحقن الحجم عن طريق اختيار نافذة يكون فيها الأكسجين (أوH 2 O2) أكثر استقرارا وثباتا. يتم تمثيل أمثلة النوافذ المحددة بواسطة أقواس سوداء في النتائج التمثيلية (الشكل 2 والشكل 3).

النتائج

يتم تمثيل استهلاك أكسجين الميتوكوندريا بواسطة العصب الوركي المتخلل في الشكل 2. يمثل التتبع الأحمر تدفق O2 لكل وحدة كتلة في pmol / s.mg. بعد تسجيل استهلاك الأكسجين القاعدي مع الركائز الداخلية (التنفس الروتيني) ، يتم حقن السكسينات (SUCC) لتسجيل التنفس المعقد الثاني (نازعة هيدرو...

Discussion

العديد من الأمراض أو الحالات المصاحبة للاعتلالات العصبية لديها خلل وظيفي في الميتوكوندريا كعامل خطر. يعد تقييم وظيفة الميتوكوندريا في الأعصاب الطرفية أمرا ضروريا لتوضيح كيفية عمل الميتوكوندريا في هذه الحالات التنكسية العصبية. تقييم وظيفة الميتوكوندريا شاق بسبب صعوبة طريقة العزل وندرة ...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقد مول هذه الدراسة كل من المعهد السريبيليهيرا، ومؤسسة إنفاذ الحقوق الدستورية في ريو دي جانيرو، والمجلس الوطني للتنمية المدنية والتكنولوجية (CNPq)، وتنسيقية الأعمال الصديقة للفيزياء في نيفيل العليا - البرازيل. نحن ممتنون للدكتور أنطونيو غالينا فيلهو والدكتورة مونيكا مونتيرو لوميلي والدكتور كلاوديو ماسودا على الدعم مع مرافق المختبر ، والدكتورة مارثا سورنسون على التعليقات اللطيفة والقيمة في تحسين المقالة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrateSigma-AldrichA26209
Adenosine 5′-diphosphate sodium saltSigma-AldrichA2754
Amplex Red ReagentThermo Fisher scientificA12222Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet
Antimycin A (from Streptomyces sp.)Sigma-AldrichA8674
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA7030heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98%
Calcium carbonateSigma-AldrichC6763
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)Sigma-AldrichC2920
Cytochrome cSigma-AldrichC7752(from equine heart; small hemeprotein)
DataLab version 5.1.1.91OROBOROS INSTRUMENTS, AustriaCopyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger
Digital orbital microplate shaker 120VThermo Fisher scientific88882005
DL-DithiothreitolSigma-Aldrich43819
EGTA sodium saltSigma-AldrichE8145
Hamilton syringeSigma-AldrichHAM8007510 uL, 25 uL and 50 uL
HEPESSigma-AldrichH3375
Hydrogen peroxide solution 30% W/WMerckH1009
ImidazoleSigma-AldrichI2399
L-(−)-Malic acidSigma-AldrichM7397
Magnesium chloride hexahydrateSigma-AldrichM2393
MES sodium saltSigma-AldrichM3885
Micro-dissecting forceps, curvedSigma-AldrichF4142
Micro-dissecting forceps, straightSigma-AldrichF4017
O2K - Filter set Amplex RedOROBOROS INSTRUMENTS, Austria44321-01Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17.
O2K - Fluorescence LED2 - module component Fluorscence-Sensor GreenOROBOROS INSTRUMENTS, Austria44210-01
OligomycinSigma-AldrichO4876(from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C
OROBOROS Oxygraph-2kOROBOROS INSTRUMENTS, Austriahttp://www.oroboros.at
Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl)Sigma-AldrichP4509
Peroxidase from horseradishSigma-AldrichP8375
Petri dishes, polystyreneMERCKP5606
Phosphocreatine disodium salt hydrateSigma-AldrichP7936
Potassium dihydrogen phosphate monobasicSigma-AldrichPHR1330
Potassium hydroxideSigma-Aldrich221473
RotenoneSigma-AldrichR8875
SaponinSigma-AldrichSAE0073
Sodium pyruvateSigma-AldrichP5280
Sodium succinate dibasic hexahydrateSigma-AldrichS2378
SucroseSigma-AldrichS9378
TaurineSigma-AldrichT0625

References

  1. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial protein organization: from biogenesis to networks and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
  2. Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological roles of mitochondrial reactive oxygen species. Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).
  3. Van Der Bliek, A. M., Sedensky, M. M., Morgan, P. G. Cell biology of the mitochondrion. Genetics. 207 (3), 843-871 (2017).
  4. Rugarli, E. I., Langer, T. Mitochondrial quality control: A matter of life and death for neurons. EMBO Journal. 31 (6), 1336-1349 (2012).
  5. Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 872-884 (2010).
  6. Pickles, S., Vigié, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
  7. Freeman, O. J., et al. Metabolic dysfunction is restricted to the sciatic nerve in experimental diabetic neuropathy. Diabetes. 65 (1), 228-238 (2016).
  8. Sheng, B., et al. Impaired mitochondrial biogenesis contributes to mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease. Journal of Neurochemistry. 120 (3), 419-429 (2012).
  9. Wang, X., et al. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1842 (8), 1240-1247 (2014).
  10. Li, W., Fu, Y. H., Halliday, G. M., Sue, C. M. PARK genes link mitochondrial dysfunction and alpha-synuclein pathology in sporadic Parkinson's disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 1-11 (2021).
  11. Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1802 (1), 29-44 (2010).
  12. Harley, J., Clarke, B. E., Patani, R. The interplay of rna binding proteins, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in ALS. Antioxidants. 10 (4), 552 (2021).
  13. Nakagawa, Y., Yamada, S. A novel hypothesis on metal dyshomeostasis and mitochondrial dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis: Potential pathogenetic mechanism and therapeutic implications. European Journal of Pharmacology. 892, 173737 (2021).
  14. Franco-Iborra, S., et al. Mutant HTT (huntingtin) impairs mitophagy in a cellular model of Huntington disease. Autophagy. 17 (3), 672-689 (2021).
  15. Wang, Y., Guo, X., Ye, K., Orth, M., Gu, Z. Accelerated expansion of pathogenic mitochondrial DNA heteroplasmies in Huntington's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (30), 2014610118 (2021).
  16. Sajic, M., et al. Mitochondrial damage and 'plugging' of transport selectively in myelinated, small-diameter axons are major early events in peripheral neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 61 (2018).
  17. Muke, I., et al. Ultrastructural characterization of mitochondrial damage in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 343, 577218 (2020).
  18. Rodella, U., et al. An animal model of Miller Fisher Syndrome: mitochondrial hydrogen peroxide is produced by the autoimmune attack of nerve terminals and activates Schwann cells. Neurobiology of Disease. 96, 95-104 (2016).
  19. Han, M. M., Frizzi, K. E., Ellis, R. J., Calcutt, N. A., Fields, J. A. Prevention of HIV-1 TAT protein-induced Ppripheral neuropathy and mitochondrial disruption by the antimuscarinic pirenzepine. Frontiers in Neurology. 12, 663373 (2021).
  20. Roda, R. H., Hoke, A. Mitochondrial dysfunction in HIV-induced peripheral neuropathy. International Review of Neurobiology. 145, (2019).
  21. Palavicini, J. P., et al. Early disruption of nerve mitochondrial and myelin lipid homeostasis in obesity-induced diabetes. JCI Insight. 5 (21), 137286 (2020).
  22. Zheng, H., Xiao, W. H., Bennett, G. J. Functional deficits in peripheral nerve mitochondria in rats with paclitaxel- and oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Experimental Neurology. 232 (2), 154-161 (2011).
  23. Lim, T. K. Y., Rone, M. B., Lee, S., Antel, J. P., Zhang, J. Mitochondrial and bioenergetic dysfunction in trauma-induced painful peripheral neuropathy. Molecular Pain. 11, 58 (2015).
  24. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
  25. Komlódi, T., et al. Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).
  26. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. Journal of Biological Chemistry. 217 (1), 409-427 (1955).
  27. Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS Letters. 416 (1), 15-18 (1997).
  28. Gnaiger, E. Mitochondr Physiol Network. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th ed. , 80 (2014).
  29. Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial defects and heterogeneous cytochrome c release after cardiac cold ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (5), 1633-1641 (2004).
  30. Ruas, J. S., et al. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), 0150967 (2016).
  31. Boveris, A., Chance, B. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochemical Journal. 134 (3), 707-716 (1973).
  32. Skulachev, V. P. Membrane-linked systems preventing superoxide formation. Bioscience Reports. 17 (3), 347-366 (1997).
  33. Majava, V., et al. Structural and functional characterization of human peripheral nervous system myelin protein P2. PLoS One. 5, 10300 (2010).
  34. Greenfield, S., Brostoff, S., Eylar, E. H., Morell, P. Protein composition of myelin of the peripheral nervous system. Journal of Neurochemistry. 20 (4), 1207-1216 (1973).
  35. Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3, 965-976 (2008).
  36. Saks, V. A., et al. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. 184 (1-2), 81-100 (1998).
  37. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
  38. Porter, C., et al. Mitochondrial respiratory capacity and coupling control decline with age in human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 309 (3), 224-232 (2015).
  39. Martins, E. L., et al. Rapid regulation of substrate use for oxidative phosphorylation during a single session of high intensity interval or aerobic exercises in different rat skeletal muscles. Comparative Biochemistry and Physiology B. 217, 40-50 (2018).
  40. Areti, A., Komirishetty, P., Kumar, A. Carvedilol prevents functional deficits in peripheral nerve mitochondria of rats with oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Toxicology and Applied Pharmacology. 322, 97-103 (2017).
  41. Cooper, M. A., et al. Reduced mitochondrial reactive oxygen species production in peripheral nerves of mice fed a ketogenic diet. Experimental Physiology. 103 (9), 1206-1212 (2018).
  42. Jia, M., et al. Activation of NLRP3 inflammasome in peripheral nerve contributes to paclitaxel-induced neuropathic pain. Molecular Pain. 13, 1744806917719804 (2017).
  43. Muller, F. L., et al. Denervation-induced skeletal muscle atrophy is associated with increased mitochondrial ROS production. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1159-1168 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

183

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved