Valutazione della funzione mitocondriale nel nervo sciatico mediante respirometria ad alta risoluzione

Riepilogo

La respirometria ad alta risoluzione accoppiata a sensori di fluorescenza determina il consumo di ossigeno mitocondriale e la generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS). Il presente protocollo descrive una tecnica per valutare le frequenze respiratorie mitocondriali e la produzione di ROS nel nervo sciatico permeabilizzato.

Abstract

La disfunzione mitocondriale nei nervi periferici accompagna diverse malattie associate alla neuropatia periferica, che può essere innescata da molteplici cause, tra cui malattie autoimmuni, diabete, infezioni, disturbi ereditari e tumori. Valutare la funzione mitocondriale nei nervi periferici del topo può essere difficile a causa delle piccole dimensioni del campione, di un numero limitato di mitocondri presenti nel tessuto e della presenza di una guaina mielinica. La tecnica descritta in questo lavoro minimizza queste sfide utilizzando un protocollo di permeabilizzazione unico adattato da quello utilizzato per le fibre muscolari, per valutare la funzione mitocondriale del nervo sciatico invece di isolare i mitocondri dal tessuto. Misurando la produzione di specie reattive fluorimetriche con Amplex Red/Peroxidase e confrontando diversi substrati e inibitori mitocondriali nei nervi permeabilizzati alla saponina, è stato possibile rilevare contemporaneamente gli stati respiratori mitocondriali, le specie reattive dell'ossigeno (ROS) e l'attività dei complessi mitocondriali. Pertanto, il metodo qui presentato offre vantaggi rispetto alla valutazione della funzione mitocondriale con altre tecniche.

Introduzione

I mitocondri sono essenziali per mantenere la vitalità cellulare e svolgono numerose funzioni cellulari come il metabolismo energetico (vie metaboliche di glucosio, amminoacidi, lipidi e nucleotidi). Come sito primario della produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), i mitocondri sono centrali in diversi processi di segnalazione cellulare come l'apoptosi e partecipano alla sintesi di cluster ferro-zolfo (Fe-S), all'importazione e alla maturazione delle proteine mitocondriali e al mantenimento del loro genoma e dei ribosomi ^1,2,3. La rete dinamica della membrana mitocondriale è controllata da processi di fusione e fissione e dispone anche di macchinari per il controllo di qualità e mitofagia ^4,5,6.

La disfunzione mitocondriale è associata alla comparsa di diverse condizioni patologiche come il cancro, il diabete e l'obesità⁷. Disturbi della funzione mitocondriale sono rilevati nelle malattie neurodegenerative che colpiscono il sistema nervoso centrale, come nel morbo di Alzheimer ^8,9, nel morbo di Parkinson^10,11, nella sclerosi laterale amiotrofica^12,13 e nella malattia di Huntington ^14,15 . Nel sistema nervoso periferico, la perdita della funzione mitocondriale negli assoni è osservata nelle neuropatie immunitarie, come la sindrome di Guillain-Barré^16,17, e in associazione con un'elevata produzione di ROS mitocondriale negli assoni, questi eventi portano all'attivazione della MAP Chinasi nelle cellule di Schwann¹⁸. Ciò dimostra che la fisiologia mitocondriale può essere essenziale non solo per una cellula sito-specifica, ma per un intero tessuto. Nella polineuropatia sensoriale distale associata all'HIV (HIV-DSP), i mitocondri hanno un ruolo nel meccanismo attraverso il quale il trans-attivatore della proteina di trascrizione (HIV-TAT) consente all'HIV di replicarsi in modo efficiente, così come molti altri ruoli nella patogenesi dell'infezione da HIV^19,20.

La valutazione della fisiologia mitocondriale del nervo sciatico è emersa come un obiettivo essenziale per lo studio della neuropatia ^7,21,22. Nella neuropatia diabetica, le analisi proteomiche e metabolomiche suggeriscono che la maggior parte delle alterazioni molecolari nel diabete influenzano la fosforilazione ossidativa mitocondriale del nervo sciatico e il metabolismo lipidico⁷. Queste alterazioni sembrano anche essere i primi segni del diabete²¹ indotto dall'obesità. In un modello murino di neuropatia dolorosa indotta dalla chemioterapia, la compromissione mitocondriale nel nervo sciatico viene rilevata come una diminuzione della fosforilazione ossidativa²² e una riduzione delle attività dei complessi mitocondriali, del potenziale di membrana e del contenuto di ATP²³. Tuttavia, sebbene diversi gruppi abbiano citato la disfunzione mitocondriale nelle neuropatie, questi studi sono limitati alle misurazioni dell'attività nei complessi mitocondriali senza conservazione delle membrane mitocondriali, mancando la valutazione dell'integrità mitocondriale o le misurazioni del contenuto di ATP come parametro per la produzione di ATP mitocondriale. In generale, una corretta valutazione del consumo di ossigeno mitocondriale e della produzione di ROS richiede l'isolamento dei mitocondri mediante centrifugazione differenziale in un gradiente percoll/saccarosio. L'isolamento dei mitocondri può anche essere un fattore limitante per il tessuto nervoso sciatico a causa della grande quantità di tessuto necessario e della perdita e interruzione dei mitocondri.

Il presente studio mira a fornire un protocollo per misurare la fisiologia mitocondriale come il consumo di ossigeno mitocondriale e la produzione di ROS nel nervo sciatico, preservando le membrane mitocondriali e senza la necessità di isolare i mitocondri. Questo protocollo è adattato dalle misurazioni del consumo di ossigeno nelle fibre muscolari permeabilizzate²⁴ mediante respirometria ad alta risoluzione (HRR). I vantaggi di questa procedura sono la possibilità di valutare i mitocondri in piccole quantità di tessuto come il nervo sciatico e valutare i parametri mitocondriali in situ, preservando così l'ambiente mitocondriale, la struttura e il profilo bioenergetico, per ottenere un risultato fisiologicamente affidabile. Gli stati respiratori mitocondriali sono stati determinati con substrati e inibitori dopo permeabilizzazione del nervo sciatico per valutare correttamente la bioenergetica mitocondriale e il coefficiente del citocromo c per l'integrità della membrana mitocondriale, fornendo una guida per le fasi della valutazione del sistema di trasporto degli elettroni mitocondriale (ETS) e il calcolo dei parametri essenziali. Questo studio può fornire strumenti per rispondere a domande sui meccanismi fisiopatologici in cui è implicato il metabolismo del nervo sciatico, come le neuropatie periferiche.

Protocollo

Il presente protocollo è approvato dal Comitato etico sull'uso degli animali nella ricerca, CCS / UFRJ (CEUA-101/19) e dalle linee guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso di animali da esperimento. Il nervo sciatico è isolato da topi maschi C57BL/6 di quattro mesi, eutanasia per lussazione cervicale secondo le linee guida istituzionali. I passaggi del protocollo sono ottimizzati per evitare il deterioramento mitocondriale. Pertanto, in questo protocollo, la calibrazione dei sensori polarografici di ossigeno è stata eseguita prima della dissezione e permeabilizzazione del tessuto nervoso sciatico del topo.

1. Preparazione dei reagenti

1. Preparare il Tissue Preservation Buffer (TP Buffer).
   1. Preparare i seguenti reagenti in soluzione acquosa ultrapura: 10 mM di tampone Ca-EGTA con 0,1 μM di calcio libero, 20 mM di imidazolo, 20 mM di taurina, 50 mM di K-MES, 0,5 mM di DTT, 6,56 mM di MgCl₂, 5,77 mM di ATP, 15 mM di fosfocreatina (vedi Tabella dei materiali), pH 7,1. Conservare a -20°C.
2. Preparare il tampone respiratorio dei mitocondri (MR Buffer).
   1. Preparare i seguenti reagenti in soluzione di acqua ultrapura: 0,5 mM di K₂EGTA, 3 mM di MgCl₂, 60 mM di MES, 20 mM di taurina, 10 mM di KH₂PO₄, 20 mM di HEPES, 110 mM di D-saccarosio, 1 mg/mL di BSA (senza acidi grassi) (vedi Tabella dei materiali), pH 7,4. Conservare a -20 °C.
3. Preparare la soluzione madre di saponina sciogliendo 5 mg di saponina (vedere Tabella dei materiali) in 1 mL di tampone TP (fase 1.1) e tenerla sul ghiaccio. La saponina è preparata al momento.
4. Preparare Amplex Red riesegando la polvere (vedere Tabella dei materiali) con DMSO per ottenere una concentrazione di riserva di 2 mM e conservare a -20 °C in un flaconcino protetto dalla luce.
   NOTA: per evitare di logorare la sonda mediante congelamento e scongelamento, fare piccole aliquote per la conservazione non più lunga di 6 mesi²⁵.

2. Calibrazione di sensori polarografici di ossigeno per respirometria ad alta risoluzione (HRR)

1. Pulire le camere HRR dello strumento e delle siringhe (vedere Tabella dei materiali).
   1. Aprire le camere HRR, riempire con acqua distillata fino in cima e mescolare per 5 minuti 3x. Ripetere con etanolo e poi di nuovo con acqua. Lavare tappi e siringhe con acqua/etanolo/acqua 3 volte ciascuno.
2. Applicare le seguenti impostazioni di calibrazione nel software HRR (vedere Tabella dei materiali).
   1. Nel controllo software HRR, aggiungere la temperatura sperimentale (37 °C), i parametri per il sensore di ossigeno (guadagno, 2; tensione di polarizzazione, 800 mV) e per il sensore amperometrico (guadagno, 1000; tensione di polarizzazione, 100 mV).
3. Calibrare i sensori di ossigeno.
   1. Pipettare 2,1 mL di MR Buffer (fase 1.2) in ciascuna camera. Chiudere con i tappi e aspirare l'aria nella camera fino a formare una bolla. Mescolare a 37 °C per 1 ora in modalità di calibrazione fino a quando il flusso di ossigeno per massa è stabile.
   2. Eseguire una calibrazione dell'aria dei sensori polarografici di ossigeno nel software secondo il protocollo²⁴ del produttore.
      NOTA: la fase di calibrazione viene eseguita una sola volta prima di un esperimento. Ulteriori esperimenti nello stesso mezzo respiratorio e temperatura possono essere eseguiti dopo aver semplicemente lavato le camere (fase 2.1).

3. Dissezione e permeabilizzazione del nervo sciatico

1. Rimuovere il nervo sciatico seguendo i passaggi seguenti.
   1. Eutanasia dell'animale per lussazione cervicale dopo la rimozione dalla sua gabbia e delicatamente trattenuto a riposare sulla panchina.
   2. Nell'animale eutanasizzato, fai un'incisione con le forbici nella parte bassa della schiena, iniziando vicino alla colonna vertebrale e procedendo lungo la coscia verso il piede. Rimuovere la pelle e il muscolo attaccati al nervo, quindi tagliare e rimuovere l'intero nervo sciatico.
   3. Pesare immediatamente il tessuto e metterlo in un flaconcino pieno di tampone TB freddo (4 °C). Eseguire i passaggi 3.2-3.3 sul ghiaccio.
      NOTA: il peso del tessuto umido viene utilizzato per normalizzare il consumo di ossigeno e il flusso di produzione di ROS nei passaggi seguenti. Se il tessuto non può essere pesato immediatamente, conservarlo nel tampone TB freddo. La procedura viene eseguita in tessuto fresco e non deve essere congelata per evitare danni mitocondriali.
2. Per la preparazione del tessuto, posizionare il nervo sciatico in una capsula di Petri con abbastanza tampone TP per coprirlo. Tenere un'estremità del nervo con una pinza e, con un altro paio di pinze, estrarre i fasci nervosi orizzontalmente.
   NOTA: Questa procedura deve essere eseguita in meno di 10 minuti per evitare il deterioramento dei tessuti. Il tessuto sarà pronto quando potrà essere visualizzato come strati nebbiosi trasparenti, opposti al precedente tessuto bianco opaco (Figura 1).
3. In primo luogo, trasferire il tessuto strombato in un piccolo piatto contenente 1 mL di tampone TP per la permeabilizzazione dei tessuti. Per iniziare la permeabilizzazione, trasferire il tessuto con pinza in un piatto contenente 1 mL di tampone TP e 10 μL di saponina (dalla soluzione madre, fase 1.3).
   1. Agitare delicatamente in uno shaker a micropiastra per 30 minuti, quindi trasferire il tessuto con una pinza in un piatto fresco contenente MR Buffer (1 mL) e agitare delicatamente per 10 minuti. Trasferire il tessuto con pinza in una camera HRR calibrata.

4. Determinazione del consumo di ossigeno e della produzione di ROS

1. Riempire le camere HRR con 2,1 mL di tampone MR, aggiungere Amplex Red (fase 1.4) a una concentrazione finale di 5 μM e perossidasi a 2 U/mL e aggiungere il nervo sciatico permeabilizzato (fase 3).
   1. Collegare i sensori di fluorescenza dello strumento, spegnere le luci nella sezione di controllo del software e premere Connetti all'ossigrafo. In "edit protocols" nel software, inserire il peso del tessuto misurato nel passaggio 3.1.3.
2. Vai su "layout", scegli l'opzione "flusso specifico per unità campione" e seleziona Trame per accedere contemporaneamente alla lettura del consumo di ossigeno e, se lo desideri, alla produzione H₂O₂ . Attendere ~ 10 min.
   NOTA: Questo tempo è necessario per stabilizzare il flusso basale di consumo di ossigeno senza substrato aggiunto (basale). Prima di ulteriori iniezioni, assicurarsi che il flusso di ossigeno sia stabilizzato.
3. Iniettare due impulsi di H₂O₂, ciascuno ad una concentrazione finale di 260 μM, per una successiva calibrazione in camera.
4. Iniettare 20 μL di succinato (vedi Tabella dei materiali), un substrato del complesso mitocondriale II, per attivare il sistema di trasporto degli elettroni mitocondriale.
   NOTA: A questo punto possono essere aggiunti diversi substrati mitocondriali per valutare la funzione mitocondriale da diversi complessi. I risultati rappresentativi con substrati variabili per i complessi mitocondriali I e II sono mostrati in Figura 2 e Figura 3. A questo punto, un aumento del consumo di O_{2 e della produzione}di H_{2 O 2} , contemporaneamente, si osserva nella Figura 3.
5. Aggiungere 20 μL di adenosina difosfato (ADP) per attivare la sintesi dell'adenosina trifosfato (ATP).
   NOTA: ADP stimola la sintesi di ATP e riduce il potenziale di membrana. Si prevede un aumento del consumo di O₂ e una diminuzione della produzione_{di H2 O 2} ^27.
6. In sequenza, aggiungere 5 μL di citocromo c (vedere Tabella dei materiali) come indicatore dell'integrità della membrana.
   NOTA: Se il tessuto è ben preparato e permeabilizzato, il citocromo c non deve aumentare il consumo di ossigeno di oltre il 15%. In tal caso, consultare la sezione relativa alla risoluzione dei problemi per suggerimenti.
7. Titolare con aliquote di 0,2 μg/mL di oligomicina (vedi Tabella dei materiali) fino a quando non si osserva un'ulteriore diminuzione del consumo di O₂ .
   NOTA: L'oligomicina agisce inibendo la sintesi di ATP portando ad una diminuzione del flusso di O₂ e ad un potenziamento della_{formazione di H2 O 2} favorito dall'elevato potenziale di membrana^26,27.
8. Titolare con aliquote di 0,5 μmol/L di carbonil cianuro 4-(trifluorometoss)fenilidrazone (FCCP) (vedi Tabella dei materiali), il disaccoppiatore mitocondriale, fino a quando non è possibile osservare alcun ulteriore aumento del consumo di O₂ . Per completare l'esperimento, iniettare 2 μl di antimicina A ad una concentrazione finale di 5 μM e attendere la stabilizzazione del flusso.
   NOTA: Si osserva una diminuzione della produzione di H₂O₂ a causa della dissipazione del potenziale di membrana dopo l'iniezione di FCCP. L'antimicina A inibisce il complesso III, impedendo così il flusso di elettroni. Pertanto, il consumo di O₂ dipendente dai mitocondri è compromesso, diminuendo il flusso di ossigeno per massa e stimolando la perdita di elettroni, aumentando la_{produzione di H2} O^{2 26,27}.
9. Vai alla barra dei comandi, cerca "multisensoriale" nel software, fai clic su Control > Salva file e Disconnetti.
   NOTA: L'aggiunta di altri substrati e inibitori può essere eseguita in base alla domanda in studio. Un esempio è descritto nei risultati rappresentativi. La calibrazione H₂O₂ viene eseguita dopo aver terminato l'esperimento, secondo il protocollo²⁸ del produttore.
10. Aprire il file salvato e selezionare la traccia "Flusso di ossigeno per massa" per ottenere i risultati sperimentali del consumo di ossigeno. Selezionare manualmente la finestra tra le iniezioni premendo Maiusc + pulsante sinistro del mouse.
    1. Vai a Marks > Statistics per visualizzare i risultati per ogni iniezione di substrato/ inibitori / protocollo disaccoppiato. Per la produzione di H₂O₂ , eseguire la stessa procedura con la traccia "Amp-Slope".
       NOTA: quando si seleziona la finestra, evitare artefatti di iniezioni di volume scegliendo una finestra in cui l'ossigeno (o H₂O₂) è più stabile e costante. Esempi di finestre selezionate sono rappresentati da parentesi graffe nere nei risultati rappresentativi (Figura 2 e Figura 3).

Risultati

Il consumo di ossigeno mitocondriale da parte del nervo sciatico permeabilizzato è rappresentato nella Figura 2. La traccia rossa rappresenta il flusso di O₂ per unità di massa in pmol/s.mg. Dopo aver registrato un consumo basale di ossigeno con substrati endogeni (respirazione di routine), il succinato (SUCC) viene iniettato per registrare la respirazione guidata dal complesso II (succinato deidrogenasi), con conseguente aumento del tasso di consumo di ossigeno. In sequenza, vi...

Discussione

Diverse malattie o condizioni che accompagnano le neuropatie hanno la disfunzione mitocondriale come fattore di rischio. La valutazione della funzione mitocondriale nei nervi periferici è essenziale per chiarire come agiscono i mitocondri in queste condizioni neurodegenerative. La valutazione della funzione mitocondriale è laboriosa a causa della difficoltà del metodo di isolamento e della scarsità di materiale. Pertanto, lo sviluppo di tecniche di permeabilizzazione dei tessuti che non richiedono l'isolamento dei mi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A26209
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt	Sigma-Aldrich	A2754
Amplex Red Reagent	Thermo Fisher scientific	A12222	Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet
Antimycin A (from Streptomyces sp.)	Sigma-Aldrich	A8674
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7030	heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98%
Calcium carbonate	Sigma-Aldrich	C6763
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Cytochrome c	Sigma-Aldrich	C7752	(from equine heart; small hemeprotein)
DataLab version 5.1.1.91	OROBOROS INSTRUMENTS, Austria		Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger
Digital orbital microplate shaker 120V	Thermo Fisher scientific	88882005
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43819
EGTA sodium salt	Sigma-Aldrich	E8145
Hamilton syringe	Sigma-Aldrich	HAM80075	10 uL, 25 uL and 50 uL
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Hydrogen peroxide solution 30% W/W	Merck	H1009
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
L-(−)-Malic acid	Sigma-Aldrich	M7397
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M2393
MES sodium salt	Sigma-Aldrich	M3885
Micro-dissecting forceps, curved	Sigma-Aldrich	F4142
Micro-dissecting forceps, straight	Sigma-Aldrich	F4017
O2K - Filter set Amplex Red	OROBOROS INSTRUMENTS, Austria	44321-01	Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17.
O2K - Fluorescence LED2 - module component Fluorscence-Sensor Green	OROBOROS INSTRUMENTS, Austria	44210-01
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876	(from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C
OROBOROS Oxygraph-2k	OROBOROS INSTRUMENTS, Austria	http://www.oroboros.at
Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl)	Sigma-Aldrich	P4509
Peroxidase from horseradish	Sigma-Aldrich	P8375
Petri dishes, polystyrene	MERCK	P5606
Phosphocreatine disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	P7936
Potassium dihydrogen phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	PHR1330
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	221473
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
Saponin	Sigma-Aldrich	SAE0073
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
Sodium succinate dibasic hexahydrate	Sigma-Aldrich	S2378
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625