JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Респирометрия высокого разрешения в сочетании с флуоресцентными датчиками определяет потребление митохондриального кислорода и генерацию активных форм кислорода (АФК). Настоящий протокол описывает метод оценки скорости дыхания митохондрий и продукции АФК в пермеабилизированном седалищном нерве.

Аннотация

Митохондриальная дисфункция в периферических нервах сопровождает несколько заболеваний, связанных с периферической невропатией, которые могут быть вызваны несколькими причинами, включая аутоиммунные заболевания, диабет, инфекции, наследственные расстройства и опухоли. Оценка митохондриальной функции в периферических нервах мыши может быть сложной задачей из-за небольшого размера выборки, ограниченного количества митохондрий, присутствующих в ткани, и наличия миелиновой оболочки. Метод, описанный в этой работе, минимизирует эти проблемы, используя уникальный протокол пермеабилизации, адаптированный из того, который используется для мышечных волокон, для оценки митохондриальной функции седалищного нерва вместо выделения митохондрий из ткани. Измеряя продукцию флуориметрических реактивных видов с помощью Amplex Red/Peroxidase и сравнивая различные митохондриальные субстраты и ингибиторы в сапонин-пермеабилизированных нервах, можно было одновременно обнаружить митохондриальные респираторные состояния, активные формы кислорода (АФК) и активность митохондриальных комплексов. Таким образом, метод, представленный здесь, предлагает преимущества по сравнению с оценкой митохондриальной функции другими методами.

Введение

Митохондрии необходимы для поддержания жизнеспособности клеток и выполняют многочисленные клеточные функции, такие как энергетический метаболизм (пути метаболизма глюкозы, аминокислот, липидов и нуклеотидов). Как основной участок производства активных форм кислорода (АФК), митохондрии занимают центральное место в нескольких клеточных сигнальных процессах, таких как апоптоз, и участвуют в синтезе железо-серных (Fe-S) кластеров, импорте и созревании митохондриального белка и поддержании их генома и рибосом 1,2,3. Сеть динамики митохондриальных мембран контролируется процессами слияния и деления, а также имеет механизм контроля качества и митофагии 4,5,6.

Митохондриальная дисфункция связана с появлением нескольких патологических состояний, таких как рак, диабет и ожирение7. Нарушения митохондриальной функции выявляются при нейродегенеративных расстройствах, влияющих на центральную нервную систему, таких как болезнь Альцгеймера 8,9, болезнь Паркинсона10,11, боковой амиотрофический склероз12,13 и болезнь Хантингтона14,15 . В периферической нервной системе потеря митохондриальной функции в аксонах наблюдается при иммунных невропатиях, таких как синдром Гийена-Барре16,17, и в связи с высокой митохондриальной продукцией АФК в аксонах эти события приводят к активации MAP киназы в шванновских клетках18. Это демонстрирует, что митохондриальная физиология может быть необходима не только для клетки, специфичной для сайта, но и для всей ткани. При ВИЧ-ассоциированной дистальной сенсорной полинейропатии (ВИЧ-ДСП) митохондрии играют роль в механизме, с помощью которого трансактиватор транскрипционного белка (ВИЧ-ТАТ) позволяет ВИЧ эффективно реплицироваться, а также ряд других ролей в патогенезе ВИЧ-инфекции19,20.

Оценка физиологии митохондрий седалищного нерва стала важной целью для исследования нейропатии 7,21,22. При диабетической нейропатии протеомный и метаболомный анализы показывают, что большинство молекулярных изменений при диабете влияют на митохондриальное окислительное фосфорилирование седалищного нерва и липидный обмен7. Эти изменения также, по-видимому, являются ранними признаками диабета21, вызванного ожирением. В мышиной модели вызванной химиотерапией болезненной нейропатии митохондриальные нарушения в седалищном нерве обнаруживаются как снижение окислительного фосфорилирования22 и снижение активности митохондриальных комплексов, мембранного потенциала и содержания АТФ23. Однако, хотя несколько групп ссылались на митохондриальную дисфункцию при невропатиях, эти исследования ограничены измерениями активности в митохондриальных комплексах без сохранения митохондриальных мембран, без оценки целостности митохондрий или измерений содержания АТФ в качестве параметра для митохондриальной продукции АТФ. В целом, правильная оценка потребления митохондриального кислорода и производства АФК требует выделения митохондрий путем дифференциального центрифугирования в градиенте перколл/сахарозы. Выделение митохондрий также может быть ограничивающим фактором для ткани седалищного нерва из-за большого количества необходимой ткани и потери и разрушения митохондрий.

Настоящее исследование направлено на обеспечение протокола для измерения митохондриальной физиологии как потребления митохондриального кислорода и производства АФК в седалищном нерве, сохраняя митохондриальные мембраны и без необходимости выделения митохондрий. Этот протокол адаптирован из измерений потребления кислорода в пермеабилизированных мышечных волокнах24 с помощью респирометрии высокого разрешения (HRR). Преимуществами этой процедуры являются возможность оценки митохондрий в небольших количествах ткани, таких как седалищный нерв, и оценка митохондриальных параметров in situ, тем самым сохраняя митохондриальную среду, структуру и биоэнергетический профиль, для получения физиологически достоверного результата. Митохондриальные респираторные состояния определяли с помощью субстратов и ингибиторов после пермеабилизации седалищного нерва для правильной оценки митохондриальной биоэнергетики и коэффициента цитохрома C для целостности митохондриальной мембраны, обеспечивая руководство для этапов оценки митохондриальной электронной транспортной системы (ETS) и расчета существенных параметров. Это исследование может предоставить инструменты для ответа на вопросы в патофизиологических механизмах, в которых участвует метаболизм седалищного нерва, таких как периферические невропатии.

протокол

Настоящий протокол одобрен Комитетом по этике использования животных в исследованиях, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) и руководящими принципами Национальных институтов здравоохранения по уходу за экспериментальными животными и их использованию. Седалищный нерв изолирован от четырехмесячных самцов мышей C57BL/6, усыпленных вывихом шейки матки в соответствии с институциональными руководящими принципами. Этапы протокола оптимизированы, чтобы избежать ухудшения митохондрий. Поэтому в этом протоколе калибровка полярографических датчиков кислорода выполнялась до рассечения и пермеабилизации ткани седалищного нерва мыши.

1. Подготовка реагентов

  1. Подготовьте буфер сохранения тканей (TP Buffer).
    1. В сверхчистом водном растворе готовят следующие реагенты: 10 мМ буфера Ca-EGTA с 0,1 мкМ свободного кальция, 20 мМ имидазола, 20 мМ таурина, 50 мМ K-MES, 0,5 мМ DTT, 6,56 мМ MgCl2, 5,77 мМ АТФ, 15 мМ фосфокреатина (см. Таблицу материалов), рН 7,1. Хранить при температуре -20°C.
  2. Подготовьте буфер дыхания митохондрий (MR Buffer).
    1. В сверхчистом водном растворе готовят следующие реагенты: 0,5 мМ K2EGTA, 3 мМ MgCl2, 60 мМ MES, 20 мМ таурина, 10 мМ KH2PO4, 20 мМ HEPES, 110 мМ D-сахарозы, 1 мг/мл BSA (без жирных кислот) (см. Таблицу материалов), рН 7,4. Хранить при -20 °C.
  3. Готовят раствор сапонина, растворяя 5 мг сапонина (см. Таблицу материалов) в 1 мл буфера ТП (этап 1.1) и держат его на льду. Сапонин готовят свежим способом.
  4. Готовят Amplex Red путем повторного использования порошка (см. Таблицу материалов) с ДМСО для получения концентрации запаса 2 мМ и хранят при -20 °C во флаконе, защищенном от света.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать износа зонда путем замораживания и оттаивания, сделайте небольшие аликвоты для хранения не дольше 6 месяцев25.

2. Калибровка полярографических датчиков кислорода для респирометрии высокого разрешения (HRR)

  1. Очистите камеры HRR инструмента и шприцев (см. Таблицу материалов).
    1. Откройте камеры HRR, залейте дистиллированной водой до самого верха и перемешайте в течение 5 мин 3x. Повторить с этанолом, а затем снова с водой. Промывные пробки и шприцы водой/этанолом/водой по 3 раза каждая.
  2. Примените следующие параметры калибровки в программном обеспечении HRR (см. Таблицу материалов).
    1. В программном управлении HRR добавьте экспериментальную температуру (37 °C), параметры для датчика кислорода (усиление, 2; поляризационное напряжение, 800 мВ) и для амперометрического датчика (усиление, 1000; поляризационное напряжение, 100 мВ).
  3. Калибровка датчиков кислорода.
    1. Пипетка 2,1 мл MR Buffer (шаг 1.2) в каждую камеру. Закройте пробками и втягивайте воздух в камеру, пока не образуется пузырь. Перемешивайте при 37 °C в течение 1 ч в режиме калибровки до тех пор, пока поток кислорода на массу не станет стабильным.
    2. Выполнить воздушную калибровку полярографических датчиков кислорода в программном обеспечении в соответствии с протоколомпроизводителя 24.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этап калибровки выполняется только один раз перед экспериментом. Дополнительные эксперименты в той же среде дыхания и температуре могут быть выполнены после простой промывки камер (этап 2.1).

3. Рассечение и пермеабилизация седалищного нерва

  1. Удалите седалищный нерв, следуя приведенным ниже шагам.
    1. Усыпить животное путем вывиха шейки матки после извлечения из его клетки и осторожно удерживаемого для отдыха на скамейке.
    2. У усыпленного животного сделайте разрез ножницами в пояснице, начиная с позвоночника и продолжая вниз по бедру к стопе. Удалите кожу и мышцы, прикрепленные к нерву, а затем отрежьте и удалите весь седалищный нерв.
    3. Немедленно взвесьте ткань и поместите ее во флакон, наполненный холодным TB Buffer (4 °C). Выполните шаги 3.2-3.3 на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Масса влажных тканей используется для нормализации потребления кислорода и производственного потока АФК на следующих этапах. Если ткань не может быть взвешена немедленно, сохраните ее в холодном туберкулезном буфере. Процедура проводится в свежих тканях и не должна быть заморожена, чтобы избежать повреждения митохондрий.
  2. Для приготовления ткани поместите седалищный нерв в чашку Петри с достаточным количеством буфера TP, чтобы покрыть его. Удерживайте один конец нерва щипцами, а другой парой щипцов вытягивайте нервные пучки горизонтально.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура должна быть выполнена менее чем за 10 минут, чтобы избежать ухудшения состояния тканей. Ткань будет готова, когда ее можно будет визуализировать в виде прозрачных туманных слоев, противоположных предыдущей белой непрозрачной ткани (рисунок 1).
  3. Во-первых, переложите очищенную ткань в небольшую посуду, содержащую 1 мл TP Buffer для пермеабилизации тканей. Чтобы начать пермеабилизацию, переложите ткань щипцами в посуду, содержащую 1 мл TP Buffer и 10 мкл сапонина (из исходного раствора, стадия 1.3).
    1. Аккуратно встряхните в микропластинчатом шейкере в течение 30 мин, затем переложите ткань щипцами в свежую посуду, содержащую MR Buffer (1 мл) и аккуратно встряхните в течение 10 мин. Перенесите ткань щипцами в калиброванную камеру HRR.

4. Потребление кислорода и определение производства АФК

  1. Заполните камеры HRR 2,1 мл буфера MR, добавьте Amplex Red (шаг 1,4) к конечной концентрации 5 мкМ и пероксидазу до 2 Ед/мл и добавьте пермеабилизированный седалищный нерв (шаг 3).
    1. Подключите флуоресцентные датчики прибора, выключите свет в разделе управления программного обеспечения и нажмите Connect to oxygraph. В поле "Протоколы редактирования" в программном обеспечении вставьте вес ткани, измеренный на этапе 3.1.3.
  2. Перейдите в раздел «Макет», выберите опцию «Удельный поток на единицу образца» и выберите Графики, чтобы одновременно получить доступ к показаниям потребления кислорода и, при необходимости, к производству H2O2 . Подождите ~10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это время требуется для стабилизации базального потока потребления кислорода без добавления субстрата (базального). Перед дальнейшими инъекциями убедитесь, что поток кислорода стабилизирован.
  3. Вводят два импульса H2O2, каждый до конечной концентрации 260 мкМ, для последующей калибровки в камере.
  4. Введите 20 мкл сукцината (см. Таблицу материалов), субстрата митохондриального комплекса II, чтобы активировать митохондриальную систему переноса электронов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Различные митохондриальные субстраты могут быть добавлены на этом этапе для оценки митохондриальной функции различными комплексами. Репрезентативные результаты с различными субстратами для митохондриальных комплексов I и II показаны на рисунках 2 и 3. В этот момент одновременно наблюдается увеличение потребленияO2 и производстваH2 O2 одновременно на рисунке 3.
  5. Добавьте 20 мкл аденозиндифосфата (АДФ) для активации синтеза аденозинтрифосфата (АТФ).
    ПРИМЕЧАНИЕ: АДФ стимулирует синтез АТФ и снижает мембранный потенциал. Ожидается рост потребленияО2 и снижение производстваН2О2 ожидается26,27.
  6. В последовательности добавляют 5 мкл цитохрома c (см. Таблицу материалов) в качестве индикатора целостности мембраны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если ткань хорошо подготовлена и пермеабилизирована, цитохром c не должен увеличивать потребление кислорода более чем на 15%. Если это произойдет, обратитесь к разделу устранения неполадок для получения рекомендаций.
  7. Титруйте с аликвотами 0,2 мкг/мл олигомицина (см. Таблицу материалов) до тех пор, пока не наблюдается дальнейшего снижения потребленияО2 .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Олигомицин действует путем ингибирования синтеза АТФ, что приводит к уменьшению потокаО2 и усилению образованияН2О2, чему способствует высокий мембранный потенциал26,27.
  8. Титруйте с аликвотами 0,5 мкмоль/л карбонилцианида 4-(трифторметокси)фенилгидразона (FCCP) (см. Таблицу материалов), митохондриального разъединителя, до тех пор, пока не удастся наблюдать дальнейшего увеличения потребленияО2 . Чтобы закончить эксперимент, вводят 2 мкл антимицина А до конечной концентрации 5 мкМ и ждут стабилизации потока.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Снижение продукцииH2O2 наблюдается из-за диссипации мембранного потенциала после инъекции FCCP. Антимицин А ингибирует комплекс III, тем самым предотвращая поток электронов. Таким образом, митохондриально-зависимое потребление O2 нарушается, уменьшая поток кислорода на массу и стимулируя утечку электронов, увеличивая выработкуH2 O2 26,27.
  9. Перейдите в панель команд, найдите «мультисенсорный» в программном обеспечении, нажмите «Управление > «Сохранить файл» и «Отключить».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление других субстратов и ингибиторов может быть выполнено в соответствии с исследуемым вопросом. Пример описан в репрезентативных результатах. КалибровкаH2 O 2 выполняется после завершения эксперимента, согласно протоколупроизводителя 28.
  10. Откройте сохраненный файл и выберите трассировку «Поток кислорода на массу», чтобы получить результаты экспериментального потребления кислорода. Вручную выберите окно между инъекциями, нажав Shift + Левая кнопка мыши.
    1. Перейдите в Marks > Statistics , чтобы визуализировать результаты для каждой инъекции субстрата/ингибиторов/несвязанного протокола. Для производства H2O2 выполните ту же процедуру со следом «Amp-Slope».
      ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе окна избегайте артефактов объемных инъекций, выбрав окно, в котором кислород (или H2O2) более стабилен и постоянен. Примеры выбранных окон представлены черными фигурными скобками в репрезентативных результатах (рисунок 2 и рисунок 3).

Результаты

Потребление митохондриального кислорода пермеабилизированным седалищным нервом представлено на рисунке 2. Красный след представляет собой поток O2 на единицу массы в pmol/s.mg. После регистрации базального потребления кислорода эндогенными субстратами (рутинное ды?...

Обсуждение

Некоторые заболевания или состояния, сопровождающие невропатии, имеют митохондриальную дисфункцию в качестве фактора риска. Оценка функции митохондрий в периферических нервах имеет важное значение для выяснения того, как митохондрии действуют в этих нейродегенеративных состояниях....

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование финансировалось Институтом Серрапилхейры, Фондом организации ампаро в Пескисе по вопросам развития Рио-де-Жанейро (ФАПЕРЖ), Национальным советом по научным вопросам и технологиям (CNPq) и Координационным советом по вопросам образования в Нижнем Бразилии (CAPES). Мы благодарны д-ру Антонио Галине Фильо, д-ру Монике Монтеро Ломели и д-ру Клаудио Масуде за поддержку с лабораторным оборудованием, а также доктору Марте Соренсон за добрые и ценные комментарии по улучшению статьи.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrateSigma-AldrichA26209
Adenosine 5′-diphosphate sodium saltSigma-AldrichA2754
Amplex Red ReagentThermo Fisher scientificA12222Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet
Antimycin A (from Streptomyces sp.)Sigma-AldrichA8674
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA7030heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98%
Calcium carbonateSigma-AldrichC6763
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)Sigma-AldrichC2920
Cytochrome cSigma-AldrichC7752(from equine heart; small hemeprotein)
DataLab version 5.1.1.91OROBOROS INSTRUMENTS, AustriaCopyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger
Digital orbital microplate shaker 120VThermo Fisher scientific88882005
DL-DithiothreitolSigma-Aldrich43819
EGTA sodium saltSigma-AldrichE8145
Hamilton syringeSigma-AldrichHAM8007510 uL, 25 uL and 50 uL
HEPESSigma-AldrichH3375
Hydrogen peroxide solution 30% W/WMerckH1009
ImidazoleSigma-AldrichI2399
L-(−)-Malic acidSigma-AldrichM7397
Magnesium chloride hexahydrateSigma-AldrichM2393
MES sodium saltSigma-AldrichM3885
Micro-dissecting forceps, curvedSigma-AldrichF4142
Micro-dissecting forceps, straightSigma-AldrichF4017
O2K - Filter set Amplex RedOROBOROS INSTRUMENTS, Austria44321-01Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17.
O2K - Fluorescence LED2 - module component Fluorscence-Sensor GreenOROBOROS INSTRUMENTS, Austria44210-01
OligomycinSigma-AldrichO4876(from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C
OROBOROS Oxygraph-2kOROBOROS INSTRUMENTS, Austriahttp://www.oroboros.at
Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl)Sigma-AldrichP4509
Peroxidase from horseradishSigma-AldrichP8375
Petri dishes, polystyreneMERCKP5606
Phosphocreatine disodium salt hydrateSigma-AldrichP7936
Potassium dihydrogen phosphate monobasicSigma-AldrichPHR1330
Potassium hydroxideSigma-Aldrich221473
RotenoneSigma-AldrichR8875
SaponinSigma-AldrichSAE0073
Sodium pyruvateSigma-AldrichP5280
Sodium succinate dibasic hexahydrateSigma-AldrichS2378
SucroseSigma-AldrichS9378
TaurineSigma-AldrichT0625

Ссылки

  1. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial protein organization: from biogenesis to networks and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
  2. Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological roles of mitochondrial reactive oxygen species. Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).
  3. Van Der Bliek, A. M., Sedensky, M. M., Morgan, P. G. Cell biology of the mitochondrion. Genetics. 207 (3), 843-871 (2017).
  4. Rugarli, E. I., Langer, T. Mitochondrial quality control: A matter of life and death for neurons. EMBO Journal. 31 (6), 1336-1349 (2012).
  5. Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 872-884 (2010).
  6. Pickles, S., Vigié, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
  7. Freeman, O. J., et al. Metabolic dysfunction is restricted to the sciatic nerve in experimental diabetic neuropathy. Diabetes. 65 (1), 228-238 (2016).
  8. Sheng, B., et al. Impaired mitochondrial biogenesis contributes to mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease. Journal of Neurochemistry. 120 (3), 419-429 (2012).
  9. Wang, X., et al. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1842 (8), 1240-1247 (2014).
  10. Li, W., Fu, Y. H., Halliday, G. M., Sue, C. M. PARK genes link mitochondrial dysfunction and alpha-synuclein pathology in sporadic Parkinson's disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 1-11 (2021).
  11. Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1802 (1), 29-44 (2010).
  12. Harley, J., Clarke, B. E., Patani, R. The interplay of rna binding proteins, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in ALS. Antioxidants. 10 (4), 552 (2021).
  13. Nakagawa, Y., Yamada, S. A novel hypothesis on metal dyshomeostasis and mitochondrial dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis: Potential pathogenetic mechanism and therapeutic implications. European Journal of Pharmacology. 892, 173737 (2021).
  14. Franco-Iborra, S., et al. Mutant HTT (huntingtin) impairs mitophagy in a cellular model of Huntington disease. Autophagy. 17 (3), 672-689 (2021).
  15. Wang, Y., Guo, X., Ye, K., Orth, M., Gu, Z. Accelerated expansion of pathogenic mitochondrial DNA heteroplasmies in Huntington's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (30), 2014610118 (2021).
  16. Sajic, M., et al. Mitochondrial damage and 'plugging' of transport selectively in myelinated, small-diameter axons are major early events in peripheral neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 61 (2018).
  17. Muke, I., et al. Ultrastructural characterization of mitochondrial damage in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 343, 577218 (2020).
  18. Rodella, U., et al. An animal model of Miller Fisher Syndrome: mitochondrial hydrogen peroxide is produced by the autoimmune attack of nerve terminals and activates Schwann cells. Neurobiology of Disease. 96, 95-104 (2016).
  19. Han, M. M., Frizzi, K. E., Ellis, R. J., Calcutt, N. A., Fields, J. A. Prevention of HIV-1 TAT protein-induced Ppripheral neuropathy and mitochondrial disruption by the antimuscarinic pirenzepine. Frontiers in Neurology. 12, 663373 (2021).
  20. Roda, R. H., Hoke, A. Mitochondrial dysfunction in HIV-induced peripheral neuropathy. International Review of Neurobiology. 145, (2019).
  21. Palavicini, J. P., et al. Early disruption of nerve mitochondrial and myelin lipid homeostasis in obesity-induced diabetes. JCI Insight. 5 (21), 137286 (2020).
  22. Zheng, H., Xiao, W. H., Bennett, G. J. Functional deficits in peripheral nerve mitochondria in rats with paclitaxel- and oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Experimental Neurology. 232 (2), 154-161 (2011).
  23. Lim, T. K. Y., Rone, M. B., Lee, S., Antel, J. P., Zhang, J. Mitochondrial and bioenergetic dysfunction in trauma-induced painful peripheral neuropathy. Molecular Pain. 11, 58 (2015).
  24. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
  25. Komlódi, T., et al. Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).
  26. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. Journal of Biological Chemistry. 217 (1), 409-427 (1955).
  27. Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS Letters. 416 (1), 15-18 (1997).
  28. Gnaiger, E. Mitochondr Physiol Network. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th ed. , 80 (2014).
  29. Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial defects and heterogeneous cytochrome c release after cardiac cold ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (5), 1633-1641 (2004).
  30. Ruas, J. S., et al. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), 0150967 (2016).
  31. Boveris, A., Chance, B. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochemical Journal. 134 (3), 707-716 (1973).
  32. Skulachev, V. P. Membrane-linked systems preventing superoxide formation. Bioscience Reports. 17 (3), 347-366 (1997).
  33. Majava, V., et al. Structural and functional characterization of human peripheral nervous system myelin protein P2. PLoS One. 5, 10300 (2010).
  34. Greenfield, S., Brostoff, S., Eylar, E. H., Morell, P. Protein composition of myelin of the peripheral nervous system. Journal of Neurochemistry. 20 (4), 1207-1216 (1973).
  35. Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3, 965-976 (2008).
  36. Saks, V. A., et al. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. 184 (1-2), 81-100 (1998).
  37. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
  38. Porter, C., et al. Mitochondrial respiratory capacity and coupling control decline with age in human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 309 (3), 224-232 (2015).
  39. Martins, E. L., et al. Rapid regulation of substrate use for oxidative phosphorylation during a single session of high intensity interval or aerobic exercises in different rat skeletal muscles. Comparative Biochemistry and Physiology B. 217, 40-50 (2018).
  40. Areti, A., Komirishetty, P., Kumar, A. Carvedilol prevents functional deficits in peripheral nerve mitochondria of rats with oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Toxicology and Applied Pharmacology. 322, 97-103 (2017).
  41. Cooper, M. A., et al. Reduced mitochondrial reactive oxygen species production in peripheral nerves of mice fed a ketogenic diet. Experimental Physiology. 103 (9), 1206-1212 (2018).
  42. Jia, M., et al. Activation of NLRP3 inflammasome in peripheral nerve contributes to paclitaxel-induced neuropathic pain. Molecular Pain. 13, 1744806917719804 (2017).
  43. Muller, F. L., et al. Denervation-induced skeletal muscle atrophy is associated with increased mitochondrial ROS production. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1159-1168 (2007).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

183

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены