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  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

La respirométrie à haute résolution couplée à des capteurs de fluorescence détermine la consommation mitochondriale d’oxygène et la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). Le présent protocole décrit une technique pour évaluer la fréquence respiratoire mitochondriale et la production de ROS dans le nerf sciatique perméabilisé.

Résumé

Le dysfonctionnement mitochondrial dans les nerfs périphériques accompagne plusieurs maladies associées à la neuropathie périphérique, qui peuvent être déclenchées par de multiples causes, notamment les maladies auto-immunes, le diabète, les infections, les troubles héréditaires et les tumeurs. L’évaluation de la fonction mitochondriale dans les nerfs périphériques de la souris peut être difficile en raison de la petite taille de l’échantillon, d’un nombre limité de mitochondries présentes dans le tissu et de la présence d’une gaine de myéline. La technique décrite dans ce travail minimise ces défis en utilisant un protocole de perméabilisation unique adapté de celui utilisé pour les fibres musculaires, pour évaluer la fonction mitochondriale du nerf sciatique au lieu d’isoler les mitochondries du tissu. En mesurant la production d’espèces réactives fluorimétriques avec Amplex Red/Peroxyidase et en comparant différents substrats mitochondriaux et inhibiteurs dans les nerfs perméabilisés par la saponine, il a été possible de détecter simultanément les états respiratoires mitochondriaux, les espèces réactives de l’oxygène (ROS) et l’activité des complexes mitochondriaux. Par conséquent, la méthode présentée ici offre des avantages par rapport à l’évaluation de la fonction mitochondriale par d’autres techniques.

Introduction

Les mitochondries sont essentielles au maintien de la viabilité cellulaire et remplissent de nombreuses fonctions cellulaires telles que le métabolisme énergétique (voies de métabolisme du glucose, des acides aminés, des lipides et des nucléotides). En tant que site principal de production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), les mitochondries sont au centre de plusieurs processus de signalisation cellulaire tels que l’apoptose et participent à la synthèse des amas fer-soufre (Fe-S), à l’importation et à la maturation des protéines mitochondriales et au maintien de leur génome et de leurs ribosomes 1,2,3. Le réseau de dynamique de la membrane mitochondriale est contrôlé par des processus de fusion et de fission, et ils ont également des machines pour le contrôle de la qualité et la mitophagie 4,5,6.

Le dysfonctionnement mitochondrial est associé à l’apparition de plusieurs conditions pathologiques telles que le cancer, le diabète et l’obésité7. Des perturbations de la fonction mitochondriale sont détectées dans les troubles neurodégénératifs qui affectent le système nerveux central, comme dans la maladie d’Alzheimer 8,9, la maladie de Parkinson 10,11, la sclérose latérale amyotrophique 12,13 et la maladie de Huntington 14,15 . Dans le système nerveux périphérique, une perte de la fonction mitochondriale dans les axones est observée dans les neuropathies immunitaires, telles que le syndrome de Guillain-Barré16,17, et en association avec une production élevée de ROS mitochondrial dans les axones, ces événements conduisent à l’activation de la MAP Kinase dans les cellules de Schwann18. Cela démontre que la physiologie mitochondriale peut être essentielle non seulement pour une cellule spécifique au site, mais pour un tissu entier. Dans la polyneuropathie sensorielle distale associée au VIH (HIV-DSP), les mitochondries jouent un rôle dans le mécanisme par lequel la protéine trans-activateur de transcription (HIV-TAT) permet au VIH de se répliquer efficacement, ainsi que plusieurs autres rôles dans la pathogenèse de l’infection par le VIH19,20.

L’évaluation de la physiologie mitochondriale du nerf sciatique est devenue une cible essentielle pour étudier la neuropathie 7,21,22. Dans la neuropathie diabétique, les analyses protéomiques et métabolomiques suggèrent que la plupart des altérations moléculaires du diabète affectent la phosphorylation oxydative mitochondriale du nerf sciatique et le métabolisme des lipides7. Ces altérations semblent également être des signes précoces de diabète induit par l’obésité21. Dans un modèle murin de neuropathie douloureuse induite par la chimiothérapie, une altération mitochondriale du nerf sciatique est détectée comme une diminution de la phosphorylation oxydative22 et une réduction des activités des complexes mitochondriaux, du potentiel membranaire et de la teneur en ATP23. Cependant, bien que plusieurs groupes aient cité le dysfonctionnement mitochondrial dans les neuropathies, ces études se limitent aux mesures de l’activité dans les complexes mitochondriaux sans préservation des membranes mitochondriales, sans évaluation de l’intégrité mitochondriale ou mesures de la teneur en ATP comme paramètre de la production mitochondriale d’ATP. En général, une évaluation correcte de la consommation mitochondriale d’oxygène et de la production de ROS nécessite l’isolement des mitochondries par centrifugation différentielle dans un gradient percoll/saccharose. L’isolement des mitochondries peut également être un facteur limitant pour le tissu nerveux sciatique en raison de la grande quantité de tissu nécessaire et de la perte et de la perturbation des mitochondries.

La présente étude vise à fournir un protocole pour mesurer la physiologie mitochondriale comme la consommation d’oxygène mitochondrial et la production de ROS dans le nerf sciatique, en préservant les membranes mitochondriales et sans qu’il soit nécessaire d’isoler les mitochondries. Ce protocole est adapté des mesures de consommation d’oxygène dans les fibres musculaires perméabilisées24 par respirométrie à haute résolution (HRR). Les avantages de cette procédure sont la possibilité d’évaluer les mitochondries dans de petites quantités de tissus tels que le nerf sciatique et d’évaluer les paramètres mitochondriaux in situ, préservant ainsi l’environnement mitochondrial, la structure et le profil bioénergétique, pour obtenir un résultat physiologiquement fiable. Les états respiratoires mitochondriaux ont été déterminés avec des substrats et des inhibiteurs après la perméabilisation du nerf sciatique afin d’évaluer correctement la bioénergétique mitochondriale et le coefficient cytochrome c pour l’intégrité de la membrane mitochondriale, fournissant un guide pour les étapes de l’évaluation du système de transport d’électrons mitochondrial (ETS) et le calcul des paramètres essentiels. Cette étude peut fournir des outils pour répondre aux questions sur les mécanismes physiopathologiques dans lesquels le métabolisme du nerf sciatique est impliqué, tels que les neuropathies périphériques.

Protocole

Le présent protocole est approuvé par le Comité d’éthique sur l’utilisation des animaux dans la recherche, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) et les lignes directrices des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Le nerf sciatique est isolé de souris mâles C57BL/6 âgées de quatre mois, euthanasiées par luxation cervicale conformément aux directives institutionnelles. Les étapes du protocole sont optimisées pour éviter la détérioration mitochondriale. Par conséquent, dans ce protocole, l’étalonnage des capteurs d’oxygène polarographiques a été effectué avant la dissection et la perméabilisation du tissu nerveux sciatique de souris.

1. Préparation des réactifs

  1. Préparez le tampon de préservation tissulaire (tampon TP).
    1. Préparer les réactifs suivants dans une solution d’eau ultrapure : 10 mM de tampon Ca-EGTA avec 0,1 μM de calcium libre, 20 mM d’imidazole, 20 mM de taurine, 50 mM de K-MES, 0,5 mM de TNT, 6,56 mM deMgCl2, 5,77 mM d’ATP, 15 mM de phosphocréatine (voir tableau des matériaux), pH 7,1. Conserver à -20°C.
  2. Préparez le tampon respiratoire des mitochondries (tampon MR).
    1. Préparer les réactifs suivants dans une solution d’eau ultrapure : 0,5 mM deK2EGTA, 3 mM de MgCl2, 60 mM de MES, 20 mM de taurine, 10 mM de KH2PO4, 20 mM de HEPES, 110 mM de D-saccharose, 1 mg/mL de BSA (sans acide gras) (voir tableau des matériaux), pH 7,4. Conserver à -20 °C.
  3. Préparer la solution mère de saponine en dissolvant 5 mg de saponine (voir tableau des matériaux) dans 1 mL de tampon TP (étape 1.1) et la conserver sur la glace. La saponine est préparée fraîchement.
  4. Préparer Amplex Red en remettant la poudre en suspension (voir tableau des matériaux) avec du DMSO pour obtenir une concentration en stock de 2 mM et conserver à -20 °C dans un flacon à l’abri de la lumière.
    REMARQUE: Pour éviter d’user la sonde par congélation et décongélation, faites de petites aliquotes pour le stockage pas plus de 6 mois25.

2. Étalonnage des capteurs d’oxygène polarographiques pour la respirométrie à haute résolution (HRR)

  1. Nettoyez les chambres HRR de l’instrument et des seringues (voir tableau des matériaux).
    1. Ouvrez les chambres HRR, remplissez d’eau distillée jusqu’au sommet et remuez pendant 5 min 3x. Répétez avec de l’éthanol, puis à nouveau avec de l’eau. Lavez les bouchons et les seringues avec de l’eau / éthanol / eau 3x chacun.
  2. Appliquez les paramètres d’étalonnage suivants dans le logiciel HRR (voir Tableau des matériaux).
    1. Dans le contrôle logiciel HRR, ajoutez la température expérimentale (37 °C), les paramètres du capteur d’oxygène (gain, 2; tension de polarisation, 800 mV) et du capteur ampérométrique (gain, 1000; tension de polarisation, 100 mV).
  3. Calibrez les capteurs d’oxygène.
    1. Pipette 2,1 mL de tampon MR (étape 1.2) dans chaque chambre. Fermez avec les bouchons et aspirez l’air dans la chambre jusqu’à ce qu’une bulle se forme. Remuer à 37 °C pendant 1 h en mode étalonnage jusqu’à ce que le flux d’oxygène par masse soit stable.
    2. Effectuer un étalonnage de l’air des capteurs d’oxygène polarographiques dans le logiciel selon le protocole24 du fabricant.
      REMARQUE: L’étape d’étalonnage n’est effectuée qu’une seule fois avant une expérience. Des expériences supplémentaires dans le même milieu respiratoire et à la même température peuvent être effectuées après un simple lavage des chambres (étape 2.1).

3. Dissection et perméabilisation du nerf sciatique

  1. Retirez le nerf sciatique en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Euthanasier l’animal par luxation cervicale après l’avoir retiré de sa cage et doucement retenu pour se reposer sur le banc.
    2. Chez l’animal euthanasié, faites une incision avec des ciseaux dans le bas du dos, en commençant près de la colonne vertébrale et en descendant la cuisse vers le pied. Enlevez la peau et les muscles attachés au nerf, puis coupez et retirez tout le nerf sciatique.
    3. Peser immédiatement le tissu et le placer dans un flacon rempli de tampon TB froid (4 °C). Effectuez les étapes 3.2 à 3.3 sur la glace.
      REMARQUE: Le poids des tissus humides est utilisé pour normaliser la consommation d’oxygène et le flux de production de ROS dans les étapes suivantes. Si le tissu ne peut pas être pesé immédiatement, conservez-le dans un tampon TB froid. La procédure est effectuée dans des tissus frais et ne doit pas être congelée pour éviter des dommages mitochondriaux.
  2. Pour la préparation des tissus, placez le nerf sciatique dans une boîte de Petri avec suffisamment de tampon TP pour le couvrir. Tenez une extrémité du nerf avec une pince, et avec une autre paire de pinces, retirez les faisceaux nerveux horizontalement.
    REMARQUE: Cette procédure doit être effectuée en moins de 10 minutes pour éviter la détérioration des tissus. Le tissu sera prêt lorsqu’il pourra être visualisé sous forme de couches brumeuses transparentes, en face du tissu opaque blanc précédent (Figure 1).
  3. Tout d’abord, transférez le tissu expansé dans un petit plat contenant 1 mL de tampon TP pour la perméabilisation des tissus. Pour commencer la perméabilisation, transférer le tissu avec une pince dans une boîte contenant 1 mL de tampon TP et 10 μL de saponine (à partir de la solution mère, étape 1.3).
    1. Agiter doucement dans un agitateur à microplaques pendant 30 min, puis transférer le tissu avec une pince dans un plat frais contenant du tampon MR (1 mL) et agiter doucement pendant 10 min. Transférer le tissu avec une pince dans une chambre HRR calibrée.

4. Détermination de la consommation d’oxygène et de la production de ROS

  1. Remplissez les chambres HRR avec 2,1 mL de tampon MR, ajoutez Amplex Red (étape 1.4) à une concentration finale de 5 μM et de peroxydase à 2 U/mL, et ajoutez le nerf sciatique perméabilisé (étape 3).
    1. Fixez les capteurs de fluorescence de l’instrument, éteignez les lumières dans la section de commande du logiciel et appuyez sur Connecter à l’oxygraphe. Dans « modifier les protocoles » dans le logiciel, insérez le poids tissulaire mesuré à l’étape 3.1.3.
  2. Allez dans « mise en page », choisissez l’option « flux spécifique par unité d’échantillon » et sélectionnez Tracés pour accéder simultanément à la lecture de la consommation d’oxygène et, si vous le souhaitez, à la production H2O2 . Attendez ~10 min.
    REMARQUE: Ce temps est nécessaire pour stabiliser le flux basal de la consommation d’oxygène sans substrat ajouté (basal). Avant d’autres injections, assurez-vous que le flux d’oxygène est stabilisé.
  3. Injecter deux impulsions deH2O2, chacune à une concentration finale de 260 μM, pour un étalonnage ultérieur dans la chambre.
  4. Injecter 20 μL de succinate (voir Tableau des matériaux), un substrat du complexe mitochondrial II, pour activer le système de transport d’électrons mitochondriaux.
    REMARQUE: Différents substrats mitochondriaux peuvent être ajoutés à ce stade pour évaluer la fonction mitochondriale par différents complexes. Des résultats représentatifs avec des substrats variables pour les complexes mitochondriaux I et II sont présentés à la figure 2 et à la figure 3. À ce stade, une augmentation de la consommation d’O2et de laproduction de H2 O 2, simultanément, est observée à la figure 3.
  5. Ajouter 20 μL d’adénosine diphosphate (ADP) pour activer la synthèse de l’adénosine triphosphate (ATP).
    REMARQUE: ADP stimule la synthèse de l’ATP et réduit le potentiel membranaire. Une augmentation de la consommation d’O2 et une diminution de la production deH2 O2 devraient être observées26,27.
  6. Dans l’ordre, ajouter 5 μL de cytochrome c (voir Tableau des matériaux) comme indicateur de l’intégrité de la membrane.
    REMARQUE: Si le tissu est bien préparé et perméabilisé, le cytochrome c ne devrait pas augmenter la consommation d’oxygène de plus de 15%. Si cela se produit, consultez la section de dépannage pour obtenir des recommandations.
  7. Titrer avec des aliquotes de 0,2 μg/mL d’oligomycine (voir tableau des matériaux) jusqu’à ce qu’aucune autre diminution de la consommation d’O2 ne soit observée.
    REMARQUE: L’oligomycine agit en inhibant la synthèse de l’ATP conduisant à une diminutiondu débit d’O2 et à une amélioration de la formation deH2 O 2 favorisée par le potentiel membranaire élevé26,27.
  8. Titrer avec des aliquotes de 0,5 μmol/L de cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy)phénylhydrazone (FCCP) (voir tableau des matériaux), le découpleur mitochondrial, jusqu’à ce qu’il soit possible de ne plus observer d’augmentation de la consommation d’O2 . Pour terminer l’expérience, injectez 2 μl d’antimycine A à une concentration finale de 5 μM et attendez la stabilisation du débit.
    REMARQUE: Une diminution de la production de H2O2 est observée en raison de la dissipation du potentiel membranaire après l’injection de FCCP. L’antimycine A inhibe le complexe III, empêchant ainsi le flux d’électrons. Par conséquent, la consommation d’O2 dépendant des mitochondries est altérée, diminuant le flux d’oxygène par masse et stimulant les fuites d’électrons, augmentantla production de H2O2 26,27.
  9. Allez dans la barre de commandes, recherchez « multisensoriel » dans le logiciel, cliquez sur Contrôler > Enregistrer le fichier et Déconnecter.
    REMARQUE: L’ajout d’autres substrats et inhibiteurs peut être effectué en fonction de la question à l’étude. Un exemple est décrit dans les résultats représentatifs. L’étalonnage H2O2 est effectué après la fin de l’expérience, conformément au protocole28 du fabricant.
  10. Ouvrez le fichier enregistré et sélectionnez la trace « Flux d’oxygène par masse » pour obtenir les résultats expérimentaux de la consommation d’oxygène. Sélectionnez manuellement la fenêtre entre les injections en appuyant sur Maj + bouton gauche de la souris.
    1. Allez à Marks > Statistics pour visualiser les résultats de chaque injection de substrat/inhibiteurs/protocole découplé. Pour la production H2O2 , effectuez la même procédure avec la trace « Amp-Slope ».
      REMARQUE: Lors de la sélection de la fenêtre, évitez les artefacts d’injections de volume en choisissant une fenêtre où l’oxygène (ou H2O2) est plus stable et constant. Des exemples de fenêtres sélectionnées sont représentés par des accolades noires dans les résultats représentatifs (Figure 2 et Figure 3).

Résultats

La consommation mitochondriale d’oxygène par le nerf sciatique perméabilisé est représentée à la figure 2. La trace rouge représente le fluxd’O2 par unité de masse en pmol/s.mg. Après avoir enregistré une consommation basale d’oxygène avec des substrats endogènes (respiration de routine), du succinate (SUCC) est injecté pour enregistrer la respiration entraînée par le complexe II (succinate déshydrogénase), ce qui entraîne une augmentation du taux de consom...

Discussion

Plusieurs maladies ou affections accompagnant les neuropathies ont un dysfonctionnement mitochondrial comme facteur de risque. L’évaluation de la fonction mitochondriale dans les nerfs périphériques est essentielle pour élucider comment les mitochondries agissent dans ces conditions neurodégénératives. L’évaluation de la fonction mitochondriale est laborieuse en raison de la difficulté de la méthode d’isolement et de la rareté du matériel. Ainsi, le développement de techniques de perméabilisation tiss...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été financée par l’Instituto Serrapilheira, la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), le Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) et le Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES). Nous sommes reconnaissants au Dr Antonio Galina Filho, au Dr Monica Montero Lomeli et au Dr Claudio Masuda pour le soutien apporté aux installations de laboratoire, ainsi qu’au Dr Martha Sorenson pour leurs commentaires aimables et précieux dans l’amélioration de l’article.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrateSigma-AldrichA26209
Adenosine 5′-diphosphate sodium saltSigma-AldrichA2754
Amplex Red ReagentThermo Fisher scientificA12222Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet
Antimycin A (from Streptomyces sp.)Sigma-AldrichA8674
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA7030heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98%
Calcium carbonateSigma-AldrichC6763
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)Sigma-AldrichC2920
Cytochrome cSigma-AldrichC7752(from equine heart; small hemeprotein)
DataLab version 5.1.1.91OROBOROS INSTRUMENTS, AustriaCopyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger
Digital orbital microplate shaker 120VThermo Fisher scientific88882005
DL-DithiothreitolSigma-Aldrich43819
EGTA sodium saltSigma-AldrichE8145
Hamilton syringeSigma-AldrichHAM8007510 uL, 25 uL and 50 uL
HEPESSigma-AldrichH3375
Hydrogen peroxide solution 30% W/WMerckH1009
ImidazoleSigma-AldrichI2399
L-(−)-Malic acidSigma-AldrichM7397
Magnesium chloride hexahydrateSigma-AldrichM2393
MES sodium saltSigma-AldrichM3885
Micro-dissecting forceps, curvedSigma-AldrichF4142
Micro-dissecting forceps, straightSigma-AldrichF4017
O2K - Filter set Amplex RedOROBOROS INSTRUMENTS, Austria44321-01Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17.
O2K - Fluorescence LED2 - module component Fluorscence-Sensor GreenOROBOROS INSTRUMENTS, Austria44210-01
OligomycinSigma-AldrichO4876(from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C
OROBOROS Oxygraph-2kOROBOROS INSTRUMENTS, Austriahttp://www.oroboros.at
Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl)Sigma-AldrichP4509
Peroxidase from horseradishSigma-AldrichP8375
Petri dishes, polystyreneMERCKP5606
Phosphocreatine disodium salt hydrateSigma-AldrichP7936
Potassium dihydrogen phosphate monobasicSigma-AldrichPHR1330
Potassium hydroxideSigma-Aldrich221473
RotenoneSigma-AldrichR8875
SaponinSigma-AldrichSAE0073
Sodium pyruvateSigma-AldrichP5280
Sodium succinate dibasic hexahydrateSigma-AldrichS2378
SucroseSigma-AldrichS9378
TaurineSigma-AldrichT0625

Références

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