Evaluación de la función mitocondrial en el nervio ciático mediante respirometría de alta resolución

Resumen

La respirometría de alta resolución acoplada a sensores de fluorescencia determina el consumo de oxígeno mitocondrial y la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS). El presente protocolo describe una técnica para evaluar la frecuencia respiratoria mitocondrial y la producción de ROS en el nervio ciático permeabilizado.

Resumen

La disfunción mitocondrial en los nervios periféricos acompaña a varias enfermedades asociadas con la neuropatía periférica, que puede desencadenarse por múltiples causas, incluidas enfermedades autoinmunes, diabetes, infecciones, trastornos hereditarios y tumores. La evaluación de la función mitocondrial en los nervios periféricos del ratón puede ser un desafío debido al pequeño tamaño de la muestra, un número limitado de mitocondrias presentes en el tejido y la presencia de una vaina de mielina. La técnica descrita en este trabajo minimiza estos desafíos mediante el uso de un protocolo de permeabilización único adaptado de uno utilizado para las fibras musculares, para evaluar la función mitocondrial del nervio ciático en lugar de aislar las mitocondrias del tejido. Al medir la producción fluorimétrica de especies reactivas con Amplex Red/Peroxidasa y comparar diferentes sustratos e inhibidores mitocondriales en nervios permeabilizados con saponina, fue posible detectar estados respiratorios mitocondriales, especies reactivas de oxígeno (ROS) y la actividad de complejos mitocondriales simultáneamente. Por lo tanto, el método presentado aquí ofrece ventajas en comparación con la evaluación de la función mitocondrial mediante otras técnicas.

Introducción

Las mitocondrias son esenciales para mantener la viabilidad celular y realizan numerosas funciones celulares, como el metabolismo energético (vías de metabolismo de glucosa, aminoácidos, lípidos y nucleótidos). Como sitio principal de producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), las mitocondrias son centrales en varios procesos de señalización celular como la apoptosis y participan en la síntesis de grupos de hierro-azufre (Fe-S), la importación y maduración de proteínas mitocondriales y el mantenimiento de su genoma y ribosomas ^1,2,3. La red de dinámica de membranas mitocondriales está controlada por procesos de fusión y fisión, y también cuentan con maquinaria para el control de calidad y mitofagia ^4,5,6.

La disfunción mitocondrial se asocia con la aparición de varias afecciones patológicas como el cáncer, la diabetes y la obesidad⁷. Se detectan alteraciones en la función mitocondrial en trastornos neurodegenerativos que afectan al sistema nervioso central, como en la enfermedad de Alzheimer ^8,9, la enfermedad de Parkinson^10,11, la esclerosis lateral amiotrófica^12,13 y la enfermedad de Huntington ^14,15 . En el sistema nervioso periférico, la pérdida de la función mitocondrial en los axones se observa en neuropatías inmunes, como el síndrome de Guillain-Barré^16,17, y en asociación con una alta producción de ROS mitocondriales en axones, estos eventos conducen a la activación de la MAP quinasa en las células de Schwann¹⁸. Esto demuestra que la fisiología mitocondrial puede ser esencial no solo para una célula específica del sitio, sino para un tejido completo. En la polineuropatía sensorial distal asociada al VIH (HIV-DSP), las mitocondrias tienen un papel en el mecanismo por el cual la proteína transactivadora de la transcripción (HIV-TAT) permite que el VIH se replique de manera eficiente, así como varias otras funciones en la patogénesis de la infección por VIH^19,20.

La evaluación de la fisiología mitocondrial del nervio ciático se ha convertido en un objetivo esencial para la investigación de la neuropatía ^7,21,22. En la neuropatía diabética, los análisis proteómicos y metabolómicos sugieren que la mayoría de las alteraciones moleculares en la diabetes afectan a la fosforilación oxidativa mitocondrial del nervio ciático y al metabolismo lipídico⁷. Estas alteraciones también parecen ser signos tempranos de diabetes inducida por la obesidad²¹. En un modelo de ratón de neuropatía dolorosa inducida por quimioterapia, el deterioro mitocondrial en el nervio ciático se detecta como una disminución en la fosforilación oxidativa²² y una reducción de las actividades de los complejos mitocondriales, el potencial de membrana y el contenido de ATP²³. Sin embargo, aunque varios grupos han citado la disfunción mitocondrial en neuropatías, estos estudios se limitan a las mediciones de la actividad en complejos mitocondriales sin preservación de las membranas mitocondriales, careciendo de evaluación de la integridad mitocondrial o mediciones del contenido de ATP como parámetro para la producción de ATP mitocondrial. En general, una evaluación adecuada del consumo de oxígeno mitocondrial y la producción de ROS requiere el aislamiento de las mitocondrias por centrifugación diferencial en un gradiente percol/sacarosa. El aislamiento de las mitocondrias también puede ser un factor limitante para el tejido nervioso ciático debido a la gran cantidad de tejido necesario y la pérdida e interrupción de las mitocondrias.

El presente estudio tiene como objetivo proporcionar un protocolo para medir la fisiología mitocondrial como el consumo de oxígeno mitocondrial y la producción de ROS en el nervio ciático, preservando las membranas mitocondriales y sin necesidad de aislar las mitocondrias. Este protocolo se adapta a partir de mediciones de consumo de oxígeno en fibras musculares permeabilizadas²⁴ mediante respirometría de alta resolución (HRR). Las ventajas de este procedimiento son la posibilidad de evaluar las mitocondrias en pequeñas cantidades de tejido como el nervio ciático y evaluar los parámetros mitocondriales in situ, preservando así el entorno mitocondrial, la estructura y el perfil bioenergético, para obtener un resultado fisiológicamente confiable. Los estados respiratorios mitocondriales se determinaron con sustratos e inhibidores después de la permeabilización del nervio ciático para evaluar adecuadamente la bioenergética mitocondrial y el coeficiente del citocromo c para la integridad de la membrana mitocondrial, proporcionando una guía para los pasos de la evaluación del sistema de transporte de electrones mitocondrial (ETS) y el cálculo de los parámetros esenciales. Este estudio puede proporcionar herramientas para responder preguntas sobre mecanismos fisiopatológicos en los que está implicado el metabolismo del nervio ciático, como las neuropatías periféricas.

Protocolo

El presente protocolo está aprobado por el Comité de Ética sobre el Uso de Animales en la Investigación, CCS/UFRJ (CEUA-101/19), y las directrices de los Institutos Nacionales de Salud para el cuidado y uso de animales de experimentación. El nervio ciático se aísla de ratones machos C57BL/6 de cuatro meses de edad, sacrificados por luxación cervical según las pautas institucionales. Los pasos del protocolo están optimizados para evitar el deterioro mitocondrial. Por lo tanto, en este protocolo, la calibración de los sensores polarográficos de oxígeno se realizó antes de la disección y permeabilización del tejido nervioso ciático del ratón.

1. Preparación de reactivos

1. Prepare el tampón de preservación de tejidos (TP Buffer).
   1. Preparar los siguientes reactivos en solución de agua ultrapura: 10 mM de tampón de Ca-EGTA con 0,1 μM de calcio libre, 20 mM de imidazol, 20 mM de taurina, 50 mM de K-MES, 0,5 mM de TDT, 6,56 mM de MgCl₂, 5,77 mM de ATP, 15 mM de fosfocreatina (ver Tabla de Materiales), pH 7.1. Conservar a -20°C.
2. Prepare el Mitochondria Respiration Buffer (MR Buffer).
   1. Preparar los siguientes reactivos en solución de agua ultrapura: 0,5 mM de K₂EGTA, 3 mM de MgCl₂, 60 mM de MES, 20 mM de taurina, 10 mM de KH₂PO₄, 20 mM de HEPES, 110 mM de D-sacarosa, 1 mg/mL de BSA (libre de ácidos grasos) (ver Tabla de Materiales), pH 7.4. Conservar a -20 °C.
3. Prepare la solución madre de saponina disolviendo 5 mg de saponina (ver Tabla de Materiales) en 1 ml de TP Buffer (paso 1.1) y manténgala en hielo. La saponina se prepara fresca.
4. Preparar Amplex Red resuspendiendo el polvo (ver Tabla de Materiales) con DMSO para obtener una concentración de stock de 2 mM y almacenar a -20 °C en un vial protegido de la luz.
   NOTA: Para evitar el desgaste de la sonda por congelación y descongelación, haga pequeñas alícuotas para almacenamiento de no más de 6 meses²⁵.

2. Calibración de sensores polarográficos de oxígeno para respirometría de alta resolución (HRR)

1. Limpie las cámaras HRR del instrumento y las jeringas (consulte la Tabla de materiales).
   1. Abra las cámaras HRR, llene con agua destilada hasta la parte superior y revuelva durante 5 min 3x. Repetir con etanol y luego de nuevo con agua. Lave los tapones y las jeringas con agua/etanol/agua 3 veces cada uno.
2. Aplique los siguientes ajustes de calibración en el software HRR (consulte la Tabla de materiales).
   1. En el control de software HRR, agregue la temperatura experimental (37 ° C), los parámetros para el sensor de oxígeno (ganancia, 2; voltaje de polarización, 800 mV) y para el sensor amperométrico (ganancia, 1000; voltaje de polarización, 100 mV).
3. Calibrar los sensores de oxígeno.
   1. Pipetear 2,1 ml de tampón MR (paso 1,2) en cada cámara. Cierre con los tapones y extraiga aire hacia la cámara hasta que se forme una burbuja. Revuelva a 37 °C durante 1 h en modo de calibración hasta que el flujo de oxígeno por masa sea estable.
   2. Realizar una calibración de aire de los sensores polarográficos de oxígeno en el software según el protocolo del fabricante²⁴.
      NOTA: El paso de calibración solo se realiza una vez antes de un experimento. Se pueden realizar experimentos adicionales en el mismo medio de respiración y temperatura después de simplemente lavar las cámaras (paso 2.1).

3. Disección y permeabilización del nervio ciático

1. Retire el nervio ciático siguiendo los pasos a continuación.
   1. Eutanasiar al animal por luxación cervical después de retirarlo de su jaula y sujetarlo suavemente para descansar en el banco.
   2. En el animal sacrificado, haga una incisión con tijeras en la parte baja de la espalda, comenzando cerca de la columna vertebral y avanzando por el muslo hacia el pie. Retire la piel y el músculo unidos al nervio, y luego corte y elimine todo el nervio ciático.
   3. Pesar el tejido inmediatamente y colocarlo en un vial lleno de tampón para la tuberculosis fría (4 °C). Realice los pasos 3.2-3.3 sobre hielo.
      NOTA: El peso del tejido húmedo se utiliza para normalizar el consumo de oxígeno y el flujo de producción de ROS en los siguientes pasos. Si el tejido no se puede pesar inmediatamente, consérvelo en Cold TB Buffer. El procedimiento se realiza en tejido fresco y no debe congelarse para evitar daños mitocondriales.
2. Para la preparación del tejido, coloque el nervio ciático en una placa de Petri con suficiente TP Buffer para cubrirlo. Sostenga un extremo del nervio con fórceps, y con otro par de fórceps, extraiga los haces nerviosos horizontalmente.
   NOTA: Este procedimiento debe realizarse en menos de 10 minutos para evitar el deterioro del tejido. El tejido estará listo cuando se pueda visualizar como capas de niebla transparentes, opuestas al tejido opaco blanco anterior (Figura 1).
3. Primero, transfiera el tejido estirado a un plato pequeño que contenga 1 ml de TP Buffer para la permeabilización del tejido. Para iniciar la permeabilización, transfiera el tejido con fórceps a un plato que contenga 1 ml de TP Buffer y 10 μL de saponina (de la solución madre, paso 1.3).
   1. Agite en un agitador de microplacas suavemente durante 30 minutos, luego transfiera el tejido con fórceps a un plato fresco que contenga MR Buffer (1 ml) y agite suavemente durante 10 minutos. Transfiera el tejido con fórceps a una cámara HRR calibrada.

4. Consumo de oxígeno y determinación de la producción de ROS

1. Llene las cámaras HRR con 2,1 ml de MR Buffer, agregue Amplex Red (paso 1.4) a una concentración final de 5 μM y peroxidasa a 2 U / ml, y agregue el nervio ciático permeabilizado (paso 3).
   1. Conecte los sensores de fluorescencia del instrumento, apague las luces en la sección de control del software y presione Conectar al oxógrafo. En "protocolos de edición" en el software, inserte el peso del tejido medido en el paso 3.1.3.
2. Vaya a "diseño", elija la opción "flujo específico por unidad de muestra" y seleccione Parcelas para acceder simultáneamente a la lectura del consumo de oxígeno y, si lo desea, a la producción de H₂O₂ . Espere ~ 10 min.
   NOTA: Este tiempo es necesario para estabilizar el flujo basal del consumo de oxígeno sin sustrato añadido (basal). Antes de nuevas inyecciones, asegúrese de que el flujo de oxígeno esté estabilizado.
3. Inyectar dos pulsos de H₂O₂, cada uno a una concentración final de 260 μM, para su posterior calibración en la cámara.
4. Inyectar 20 μL de succinato (ver Tabla de Materiales), un sustrato del complejo mitocondrial II, para activar el sistema de transporte de electrones mitocondrial.
   NOTA: Se pueden agregar diferentes sustratos mitocondriales en este punto para evaluar la función mitocondrial mediante diferentes complejos. Los resultados representativos con sustratos variables para los complejos mitocondriales I y II se muestran en la Figura 2 y la Figura 3. En este punto, se observa un aumento en el consumo de O₂y la producción de H_{2 O 2}, simultáneamente, en la Figura 3.
5. Añadir 20 μL de difosfato de adenosina (ADP) para activar la síntesis de trifosfato de adenosina (ATP).
   NOTA: ADP estimula la síntesis de ATP y reduce el potencial de membrana. Se espera observar un aumento en el consumo de O₂y una disminución en la producción de H₂ O^{2 2 26,27}.
6. En secuencia, agregue 5 μL de citocromo c (ver Tabla de Materiales) como indicador de la integridad de la membrana.
   NOTA: Si el tejido está bien preparado y permeabilizado, el citocromo c no debe aumentar el consumo de oxígeno en más del 15%. Si ocurre, consulte la sección de solución de problemas para obtener recomendaciones.
7. Valorar con alícuotas de 0,2 μg/ml de oligomicina (ver Tabla de Materiales) hasta que no se observe una nueva disminución en el consumo de O₂ .
   NOTA: La oligomicina actúa inhibiendo la síntesis de ATP dando lugar a una disminución en el flujo de O₂ y una mejora en la formación_{de H2 O 2} favorecida por el alto potencial de membrana^26,27.
8. Valorar con alícuotas de 0,5 μmol/L de cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona (FCCP) (ver Tabla de Materiales), el desacoplador mitocondrial, hasta que no sea posible observar más aumento en el consumo de O₂ . Para finalizar el experimento, inyecte 2 μl de antimicina A a una concentración final de 5 μM y espere la estabilización del flujo.
   NOTA: Se observa una disminución en la producción de H₂O₂ debido a la disipación del potencial de membrana después de inyectar FCCP. La antimicina A inhibe el complejo III, impidiendo así el flujo de electrones. Por lo tanto, el consumo de O₂ dependiente de las mitocondrias se ve afectado, disminuyendo el flujo de oxígeno por masa y estimulando la fuga de electrones, aumentando_laproducción_{de H 2} O^{2 26,27}.
9. Vaya a la barra de comandos, busque "multisensorial" en el software, haga clic en Control > Guardar archivo y Desconectar.
   NOTA: La adición de otros sustratos e inhibidores se puede realizar de acuerdo con la pregunta en estudio. Un ejemplo se describe en los resultados representativos. La calibración H₂O₂ se realiza después de terminar el experimento, de acuerdo con el protocolo del fabricante²⁸.
10. Abra el archivo guardado y seleccione el rastro "Flujo de oxígeno por masa" para obtener los resultados experimentales de consumo de oxígeno. Seleccione manualmente la ventana entre inyecciones pulsando Mayús + Botón izquierdo del ratón.
    1. Vaya a Marcas > Estadísticas para visualizar los resultados de cada inyección de sustrato/inhibidores/protocolo desacoplado. Para la producción de H₂O₂ , realice el mismo procedimiento con el trazado "Amp-Slope".
       NOTA: Al seleccionar la ventana, evite los artefactos de las inyecciones de volumen eligiendo una ventana donde el oxígeno (o H₂O₂) sea más estable y constante. Los ejemplos de ventanas seleccionadas están representados por llaves negras en los resultados representativos (Figura 2 y Figura 3).

Resultados

El consumo de oxígeno mitocondrial por el nervio ciático permeabilizado está representado en la Figura 2. La traza roja representa el flujo de O₂ por unidad de masa en pmol/s.mg. Después de registrar un consumo basal de oxígeno con sustratos endógenos (respiración de rutina), se inyecta succinato (SUCC) para registrar la respiración impulsada por el complejo II (succinato deshidrogenasa), lo que resulta en un aumento en la tasa de consumo de oxígeno. En secuencia, se agre...

Discusión

Varias enfermedades o afecciones que acompañan a las neuropatías tienen la disfunción mitocondrial como factor de riesgo. La evaluación de la función mitocondrial en los nervios periféricos es esencial para dilucidar cómo actúan las mitocondrias en estas condiciones neurodegenerativas. La evaluación de la función mitocondrial es laboriosa debido a la dificultad del método de aislamiento y la escasez de material. Por lo tanto, el desarrollo de técnicas de permeabilización tisular que no requieran el aislamien...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A26209
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt	Sigma-Aldrich	A2754
Amplex Red Reagent	Thermo Fisher scientific	A12222	Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet
Antimycin A (from Streptomyces sp.)	Sigma-Aldrich	A8674
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7030	heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98%
Calcium carbonate	Sigma-Aldrich	C6763
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Cytochrome c	Sigma-Aldrich	C7752	(from equine heart; small hemeprotein)
DataLab version 5.1.1.91	OROBOROS INSTRUMENTS, Austria		Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger
Digital orbital microplate shaker 120V	Thermo Fisher scientific	88882005
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43819
EGTA sodium salt	Sigma-Aldrich	E8145
Hamilton syringe	Sigma-Aldrich	HAM80075	10 uL, 25 uL and 50 uL
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Hydrogen peroxide solution 30% W/W	Merck	H1009
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
L-(−)-Malic acid	Sigma-Aldrich	M7397
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M2393
MES sodium salt	Sigma-Aldrich	M3885
Micro-dissecting forceps, curved	Sigma-Aldrich	F4142
Micro-dissecting forceps, straight	Sigma-Aldrich	F4017
O2K - Filter set Amplex Red	OROBOROS INSTRUMENTS, Austria	44321-01	Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17.
O2K - Fluorescence LED2 - module component Fluorscence-Sensor Green	OROBOROS INSTRUMENTS, Austria	44210-01
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876	(from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C
OROBOROS Oxygraph-2k	OROBOROS INSTRUMENTS, Austria	http://www.oroboros.at
Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl)	Sigma-Aldrich	P4509
Peroxidase from horseradish	Sigma-Aldrich	P8375
Petri dishes, polystyrene	MERCK	P5606
Phosphocreatine disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	P7936
Potassium dihydrogen phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	PHR1330
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	221473
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
Saponin	Sigma-Aldrich	SAE0073
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
Sodium succinate dibasic hexahydrate	Sigma-Aldrich	S2378
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625