Avaliação da função mitocondrial no nervo ciático por respirometria de alta resolução

Resumo

A respirometria de alta resolução acoplada aos sensores de fluorescência determina o consumo mitocondrial de oxigênio e a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). O presente protocolo descreve uma técnica para avaliar as taxas respiratórias mitocondriais e a produção de ROS no nervo ciático permeabilizado.

Resumo

A disfunção mitocondrial nos nervos periféricos acompanha várias doenças associadas à neuropatia periférica, que podem ser desencadeadas por múltiplas causas, incluindo doenças autoimunes, diabetes, infecções, doenças hereditárias e tumores. Avaliar a função mitocondrial nos nervos periféricos do camundongo pode ser desafiador devido ao pequeno tamanho da amostra, a um número limitado de mitocôndrias presentes no tecido e a presença de uma bainha de mielina. A técnica descrita neste trabalho minimiza esses desafios usando um protocolo único de permeabilização adaptado de um usado para fibras musculares, para avaliar a função mitocondrial do nervo ciático em vez de isolar as mitocôndrias do tecido. Medindo a produção fluormétrica de espécies reativas com Amplex Vermelho/Peroxidase e comparando diferentes substratos mitocondriais e inibidores em nervos de saponina-permeabilized, foi possível detectar estados respiratórios mitocondriais, espécies reativas de oxigênio (ROS) e a atividade de complexos mitocondriais simultaneamente. Portanto, o método aqui apresentado oferece vantagens em relação à avaliação da função mitocondrial por outras técnicas.

Introdução

Mitocôndrias são essenciais para manter a viabilidade celular e desempenham inúmeras funções celulares, como metabolismo energético (glicose, aminoácido, lipídio e metabolismo de nucleotídeos). Como local principal da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), as mitocôndrias são centrais em diversos processos de sinalização celular, como apoptose e participam da síntese de aglomerados de ferro-enxofre (Fe-S), importação e maturação de proteínas mitocondriais, e manutenção de seu genoma e ribossomos ^1,2,3. A rede de dinâmica da membrana mitocondrial é controlada por processos de fusão e fissão, e também possui máquinas para controle de qualidade e mitofagia ^4,5,6.

A disfunção mitocondrial está associada ao aparecimento de várias condições patológicas, como câncer, diabetes e obesidade⁷. Distúrbios na função mitocondrial são detectados em distúrbios neurodegenerativos que afetam o sistema nervoso central, como na doença de Alzheimer ^8,9, doença de Parkinson^10,11, esclerose lateral amiotrófica^12,13 e doença de Huntington^14,15 . No sistema nervoso periférico, a perda da função mitocondrial em axônios é observada em neuropatias imunológicas, como a síndrome de Guillain-Barré^16,17, e em associação com a alta produção de ROS mitocondrial em axônios, esses eventos levam à ativação do MAP Kinase em células schwann¹⁸. Isso demonstra que a fisiologia mitocondrial pode ser essencial não apenas para uma célula específica do local, mas para um tecido inteiro. Na polineuuropatia sensorial distal associada ao HIV (HIV-DSP), as mitocôndrias têm um papel no mecanismo pelo qual o trans-ativador da proteína de transcrição (HIV-TAT) permite que o HIV se replique eficientemente, bem como vários outros papéis na patogênese de infecção pelo HIV^19,20.

A avaliação da fisiologia mitocondrial do nervo ciático emergiu como um alvo essencial para investigar a neuropatia ^7,21,22. Na neuropatia diabética, análises proteômicas e metabolômicas sugerem que a maioria das alterações moleculares no diabetes afetam a fosforilação oxidativa do nervo ciático e o metabolismo lipídico⁷. Essas alterações também parecem ser sinais precoces de diabetes induzido pela obesidade²¹. Em um modelo de camundongos de neuropatia dolorosa induzida pela quimioterapia, o comprometimento mitocondrial no nervo ciático é detectado como uma diminuição na fosforilação oxidativa²², e uma redução das atividades de complexos mitocondriais, potencial de membrana e conteúdo ATP²³. No entanto, embora vários grupos tenham citado disfunção mitocondrial em neuropatias, esses estudos estão limitados às medições de atividade em complexos mitocondriais sem preservação das membranas mitocondriais, sem avaliação da integridade mitocondrial ou medições de conteúdo ATP como parâmetro para a produção mitocondrial da ATP. Em geral, uma avaliação adequada do consumo mitocondrial de oxigênio e da produção de ROS requer o isolamento das mitocôndrias por centrifugação diferencial em um gradiente percoll/sacarose. O isolamento das mitocôndrias também pode ser um fator limitante para o tecido nervoso ciático devido à grande quantidade de tecido necessário e à perda e perturbação das mitocôndrias.

O presente estudo tem como objetivo fornecer um protocolo para medir a fisiologia mitocondrial como consumo mitocondrial de oxigênio e produção de ROS no nervo ciático, preservando membranas mitocondriais e sem a necessidade de isolar mitocôndrias. Este protocolo é adaptado a partir de medidas de consumo de oxigênio em fibras musculares permeabilizadas²⁴ por respirometria de alta resolução (HRR). As vantagens desse procedimento são a possibilidade de avaliar mitocôndrias em pequenas quantidades de tecido, como o nervo ciático e avaliar parâmetros mitocondriais in situ, preservando assim o ambiente mitocondrial, estrutura e perfil bioenergésico, para obter um resultado fisiologicamente confiável. Os estados respiratórios mitocondriais foram determinados com substratos e inibidores após a permeabilização do nervo ciático para avaliar adequadamente o bioenergetics mitocondrial e o coeficiente c citocromo para a integridade da membrana mitocondrial, fornecendo um guia para etapas da avaliação do sistema de transporte eletrônico mitocondrial (ETS) e cálculo de parâmetros essenciais. Este estudo pode fornecer ferramentas para responder a perguntas em mecanismos fisiopatológicos nos quais o metabolismo do nervo ciático está implicado, como neuropatias periféricas.

Protocolo

O presente protocolo é aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais em Pesquisa, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) e Institutos Nacionais de Saúde para o cuidado e uso de animais experimentais. O nervo ciático é isolado de camundongos C57BL/6 machos de quatro meses de idade, eutanizados por deslocamento cervical de acordo com as diretrizes institucionais. As etapas do protocolo são otimizadas para evitar a deterioração mitocondrial. Portanto, neste protocolo, a calibração dos sensores polarográficos de oxigênio foi realizada antes da dissecção do tecido nervoso ciático do camundongo e da permeabilização.

1. Preparação de reagentes

1. Prepare o Tampão de Preservação do Tecido (Tampão TP).
   1. Prepare os seguintes reagentes na solução de água ultrauso: 10 mM de tampão Ca-EGTA com 0,1 μM de cálcio livre, 20 mM de imidazol, 20 mM de taurina, 50 mM de K-MES, 0,5 mM de DTT, 6,56 mM de MgCl₂, 5,77 mM de ATP, 15 mM de fosfocreatina (ver Tabela de Materiais), pH 7.1. Armazene a -20°C.
2. Prepare o Tampão de Respiração mitocôndria (Buffer MR).
   1. Prepare os seguintes reagentes na solução de água ultrauso: 0,5 mM de K₂EGTA, 3 mM de MgCl₂, 60 mM de MES, 20 mM de taurina, 10 mM de KH₂PO₄, 20 mM de HEPES, 110 mM de D-sacarose, 1 mg/mL de BSA (livre de ácidos graxos) (ver Tabela de Materiais), pH 7.4. Armazenar a -20 °C.
3. Prepare a solução de estoque de saponin dissolvendo 5 mg de saponina (ver Tabela de Materiais) em 1 mL de Tampão TP (passo 1.1) e mantenha-a no gelo. Saponina está preparada recentemente.
4. Prepare o Amplex Red reutilizando o pó (ver Tabela de Materiais) com DMSO para obter uma concentração de estoque de 2 mM e armazenar a -20 °C em um frasco protegido contra a luz.
   NOTA: Para evitar o desgaste da sonda congelando e descongelando, faça pequenas alíquotas para armazenamento não superior a 6 meses²⁵.

2. Calibração de sensores polarográficos de oxigênio para respirometria de alta resolução (HRR)

1. Limpe as câmaras hrr do instrumento e das seringas (ver Tabela de Materiais).
   1. Abra as câmaras hrr, encha com água destilada até o topo e mexa por 5 min 3x. Repita com etanol e depois novamente com água. Lave rolhas e seringas com água/etanol/água 3x cada.
2. Aplique as seguintes configurações de calibração no software HRR (ver Tabela de Materiais).
   1. No controle de software HRR, adicione a temperatura experimental (37 °C), os parâmetros para sensor de oxigênio (ganho, 2; tensão de polarização, 800 mV) e para sensor amperométrico (ganho, 1000; tensão de polarização, 100 mV).
3. Calibrar os sensores de oxigênio.
   1. Pipeta 2,1 mL de Mr Buffer (passo 1.2) em cada câmara. Feche com as rolhas e desenhe ar para dentro da câmara até formar uma bolha. Mexa a 37 °C por 1 h no modo de calibração até que o fluxo de oxigênio por massa esteja estável.
   2. Realize uma calibração de ar dos sensores polarográficos de oxigênio no software de acordo com o protocolo²⁴ do fabricante.
      NOTA: A etapa de calibração só é realizada uma vez antes de um experimento. Experimentos adicionais no mesmo meio de respiração e temperatura podem ser realizados após mera lavagem de câmaras (etapa 2.1).

3. Dissecção e permeabilização do nervo ciático

1. Remova o nervo ciático seguindo os passos abaixo.
   1. Eutanize o animal por deslocamento cervical depois de remover de sua gaiola e suavemente contido para descansar no banco.
   2. No animal eutanizado, faça uma incisão com uma tesoura na parte inferior das costas, começando perto da coluna e descendo a coxa em direção ao pé. Remova a pele e o músculo ligados ao nervo, e depois corte e remova todo o nervo ciático.
   3. Pesar o tecido imediatamente e colocá-lo em um frasco cheio de tampão de TB frio (4 °C). Faça as etapas 3.2-3.3 no gelo.
      NOTA: O peso do tecido molhado é usado para normalizar o consumo de oxigênio e o fluxo de produção de ROS nas etapas seguintes. Se o tecido não puder ser pesado imediatamente, conserva-o em tampão frio de TB. O procedimento é realizado em tecido fresco e não deve ser congelado para evitar danos mitocondriais.
2. Para a preparação do tecido, coloque o nervo ciático em uma placa de Petri com tampão TP suficiente para cobri-lo. Segure uma extremidade do nervo com fórceps, e com outro par de fórceps, puxe os feixes nervosos horizontalmente.
   NOTA: Este procedimento precisa ser feito em menos de 10 minutos para evitar a deterioração do tecido. O tecido estará pronto quando puder ser visualizado como camadas nebulosas transparentes, em frente ao tecido opaco branco anterior (Figura 1).
3. Primeiro, transfira o tecido jogado em um pequeno prato contendo 1 mL de TP Buffer para permeabilização tecidual. Para iniciar a permeabilização, transfira o tecido com fórceps para um prato contendo 1 mL de TP Buffer e 10 μL de saponina (a partir da solução de estoque, passo 1.3).
   1. Agite em um agitador de microplaca suavemente por 30 minutos, depois transfira o tecido com fórceps para um prato fresco contendo MR Buffer (1 mL) e agite suavemente por 10 minutos. Transfira o tecido com fórceps para uma câmara HRR calibrada.

4. Consumo de oxigênio e determinação da produção de ROS

1. Encha as câmaras hrr com 2,1 mL de Buffer MR, adicione Amplex Red (passo 1.4) a uma concentração final de 5 μM e peroxidase a 2 U/mL, e adicione o nervo ciático permeabilized (passo 3).
   1. Conecte os sensores de fluorescência do instrumento, desligue as luzes na seção de controle do software e pressione Conecte-se ao oxígrafo. Em "protocolos de edição" no software, insira o peso do tecido medido na etapa 3.1.3.
2. Vá para "layout", escolha a opção "fluxo específico por amostra de unidade" e selecione Plots para acessar simultaneamente a leitura do consumo de oxigênio e, se desejar, a produção H₂O₂ . Espere ~10 min.
   NOTA: Este tempo é necessário para estabilizar o fluxo basal do consumo de oxigênio sem substrato adicionado (basal). Antes de novas injeções, certifique-se de que o fluxo de oxigênio esteja estabilizado.
3. Injete dois pulsos de H₂O₂, cada um a uma concentração final de 260 μM, para calibração posterior na câmara.
4. Injete 20 μL de succinato (ver Tabela de Materiais), um substrato complexo mitocondrial II, para ativar o sistema de transporte de elétrons mitocondrial.
   NOTA: Diferentes substratos mitocondriais podem ser adicionados neste momento para avaliar a função mitocondrial por diferentes complexos. Os resultados representativos com substratos variados para os complexos mitocondriais I e II são mostrados nas Figuras 2 e Figura 3. Neste ponto, observa-se um aumento no consumo de O₂ e H₂O₂ , simultaneamente, na Figura 3.
5. Adicione 20 μL de difosfato de adenosina (ADP) para ativar a síntese de triptosfato de adenosina (ATP).
   NOTA: A ADP estimula a síntese de ATP e reduz o potencial da membrana. Espera-se que seja observado um aumento no consumo de O₂ e uma diminuição na produção de H₂O₂^.
6. Em sequência, adicione 5 μL de citocromo c (ver Tabela de Materiais) como um indicador de integridade da membrana.
   NOTA: Se o tecido estiver bem preparado e permeabilizado, o citocromo c não deve aumentar o consumo de oxigênio em mais de 15%. Se ocorrer, verifique se há recomendações na seção de solução de problemas.
7. Titulação com alíquotas de 0,2 μg/mL de oligomicina (ver Tabela de Materiais) até que não seja observada nenhuma diminuição adicional no consumo de O₂ .
   NOTA: A oligomicina age inibindo a síntese de ATP levando a uma diminuição no fluxo O₂ e um aprimoramento na formação H₂O₂ favorecida pelo potencial de alta membrana^26,27.
8. Titrate com alíquotas de 0,5 μmol/L de cianeto carbonil 4-(trifluorometoxy)fenilhydrazone (FCCP) (ver Tabela de Materiais), o uncoupler mitocondrial, até que seja possível não observar nenhum aumento adicional no consumo de O₂ . Para terminar o experimento, injete 2 μl de antimicina A até uma concentração final de 5 μM e aguarde a estabilização do fluxo.
   NOTA: Observa-se uma diminuição na produção de H₂O₂ devido à dissipação potencial da membrana após a injeção de FCCP. A antimicina A inibe o complexo III, impedindo assim o fluxo de elétrons. Portanto, o consumo de O₂ dependente de mitocôndrias é prejudicado, diminuindo o fluxo de oxigênio por massa e estimulando o vazamento de elétrons, aumentando a produção de H₂O₂ ^{2 26,27}.
9. Vá para a barra de comando, procure por "multissensorial" no software, clique em Controle > Salvar arquivo e Desconecte.
   NOTA: A adição de outros substratos e inibidores pode ser realizada de acordo com a questão em estudo. Um exemplo é descrito nos resultados representativos. A calibração H₂O₂ é realizada após o término do experimento, de acordo com o protocolo²⁸ do fabricante.
10. Abra o arquivo salvo e selecione o traço "Fluxo de Oxigênio por Massa" para obter os resultados experimentais de consumo de oxigênio. Selecione manualmente a janela entre as injeções pressionando shift + botão esquerdo do mouse.
    1. Vá para Marks > Statistics para visualizar os resultados de cada injeção de substrato/inibidores/protocolo desacoplado. Para a produção de H₂O₂ , realize o mesmo procedimento com o traço "Amp-Slope".
       NOTA: Ao selecionar a janela, evite artefatos de injeções de volume escolhendo uma janela onde o oxigênio (ou H₂O₂) é mais estável e constante. Exemplos de janelas selecionadas são representados por aparelhos pretos nos resultados representativos (Figura 2 e Figura 3).

Resultados

O consumo mitocondrial de oxigênio pelo nervo ciático permeabilizado está representado na Figura 2. O traço vermelho representa o fluxo O₂ por unidade em pmol/s.mg. Após registrar um consumo basal de oxigênio com substratos endógenos (respiração de rotina), o succinato (SUCC) é injetado para registrar a respiração complexa II (succinato deshidrogenase), resultando em um aumento na taxa de consumo de oxigênio. Em sequência, adiciona-se uma concentração saturada de A...

Discussão

Várias doenças ou condições que acompanham neuropatias têm disfunção mitocondrial como fator de risco. A avaliação da função mitocondrial nos nervos periféricos é essencial para elucidar como as mitocôndrias agem nessas condições neurodegenerativas. A avaliação da função mitocondrial é trabalhosa devido à dificuldade do método de isolamento e à escassez de material. Assim, o desenvolvimento de técnicas de permeabilização tecidual que não requerem o isolamento das mitocôndrias é essencial.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A26209
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt	Sigma-Aldrich	A2754
Amplex Red Reagent	Thermo Fisher scientific	A12222	Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet
Antimycin A (from Streptomyces sp.)	Sigma-Aldrich	A8674
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7030	heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98%
Calcium carbonate	Sigma-Aldrich	C6763
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Cytochrome c	Sigma-Aldrich	C7752	(from equine heart; small hemeprotein)
DataLab version 5.1.1.91	OROBOROS INSTRUMENTS, Austria		Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger
Digital orbital microplate shaker 120V	Thermo Fisher scientific	88882005
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43819
EGTA sodium salt	Sigma-Aldrich	E8145
Hamilton syringe	Sigma-Aldrich	HAM80075	10 uL, 25 uL and 50 uL
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Hydrogen peroxide solution 30% W/W	Merck	H1009
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
L-(−)-Malic acid	Sigma-Aldrich	M7397
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M2393
MES sodium salt	Sigma-Aldrich	M3885
Micro-dissecting forceps, curved	Sigma-Aldrich	F4142
Micro-dissecting forceps, straight	Sigma-Aldrich	F4017
O2K - Filter set Amplex Red	OROBOROS INSTRUMENTS, Austria	44321-01	Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17.
O2K - Fluorescence LED2 - module component Fluorscence-Sensor Green	OROBOROS INSTRUMENTS, Austria	44210-01
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876	(from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C
OROBOROS Oxygraph-2k	OROBOROS INSTRUMENTS, Austria	http://www.oroboros.at
Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl)	Sigma-Aldrich	P4509
Peroxidase from horseradish	Sigma-Aldrich	P8375
Petri dishes, polystyrene	MERCK	P5606
Phosphocreatine disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	P7936
Potassium dihydrogen phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	PHR1330
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	221473
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
Saponin	Sigma-Aldrich	SAE0073
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
Sodium succinate dibasic hexahydrate	Sigma-Aldrich	S2378
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625