JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول سير عمل التحرير الجيني للتحرير الجيني للتكرار الباليندرومي القصير (CRISPR) عالي الإنتاجية المتجمع بانتظام لتحليل شبكة مجموعة microRNA التي تسمح بالتوليد السريع للوحة من خطوط الخلايا المعدلة وراثيا التي تحمل مجموعات فريدة من نوعها لحذف أعضاء مجموعة miRNA بحجم 35 كيلو بايت في تجربة واحدة.

Abstract

ظهرت MicroRNAs (miRNAs) كمنظمات خلوية مهمة (مثبطات الورم ، العوامل المؤيدة للأورام) للسرطان والانبثاث. تركز معظم الدراسات المنشورة على الحمض النووي الريبوزي المرسال (miRNA) واحد عند توصيف دور الحمض النووي الريبي الصغير في السرطان. ومع ذلك ، يتم تنظيم حوالي 30٪ من جينات miRNA البشرية في وحدات مجمعة غالبا ما يتم التعبير عنها بشكل مشترك ، مما يشير إلى نظام معقد ومنسق لتنظيم الحمض النووي الريبي غير المشفر. هناك حاجة إلى توضيح أكثر وضوحا لكيفية عمل شبكات الحمض النووي الريبوزي المرسال المتجمعة بشكل تعاوني لتنظيم نمو الورم وعدوانية السرطان ومقاومة الأدوية قبل ترجمة الحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر إلى العيادة.

تم استخدام إجراء تحرير الجينات بوساطة التكرار الجيني بوساطة (كريسبر) عالي الإنتاجية المتجمع بانتظام لدراسة الدور الورمي لمجموعة جينومية من سبعة جينات miRNA تقع داخل موضع يمتد طوله ~ 35000 نقطة أساس في سياق سرطان البروستاتا. ومن أجل هذا النهج، أصيبت خطوط الخلايا السرطانية البشرية بناقل فيروس لينتي لنواكيز كاس9 المستحثة بالدوكسيسيكلين (DOX) المزروع في وسط يحتوي على DOX لمدة 48 ساعة. تم نقل الخلايا لاحقا مع الحمض النووي الريبي (tracrRNA) المنشط اصطناعيا (tracrRNA) المعقد مع أوليغونوكليوتيدات كريسبر RNA (crRNA) الخاصة بالموقع الجيني للسماح بالتوليد السريع لخطوط الخلايا السرطانية التي تحمل الحذف الكامل لمجموعة miRNA وحذف مجموعة جين miRNA الفردية أو المركبة في تجربة واحدة.

تتمثل مزايا نظام تحرير الجينات عالي الإنتاجية هذا في القدرة على تجنب الاستنساخ الفرعي لناقلات الحمض النووي الذي يستغرق وقتا طويلا ، والمرونة في نقل الخلايا باستخدام مجموعات RNA الإرشادية الفريدة بتنسيق 24 بئرا ، والتنميط الجيني PCR منخفض التكلفة باستخدام lysates الخلايا الخام. تعد الدراسات التي تستخدم هذا النهج المبسط بالكشف عن التكرار الوظيفي والتفاعلات التآزرية / العدائية بين أعضاء مجموعة miRNA ، مما سيساعد في توصيف شبكات الحمض النووي الريبي الصغيرة المعقدة غير المشفرة المشاركة في الأمراض البشرية وإبلاغ التصميم العلاجي المستقبلي بشكل أفضل.

Introduction

هناك حاجة إلى أدوات بحث أفضل للتحقيق في مساهمة الحمض النووي الريبي غير المشفر في الأمراض البشرية. غالبا ما يلاحظ خلل تنظيم الحمض النووي الريبوزي المرسال في الاضطرابات البشرية مثل السرطان عند مقارنة ملامح التعبير عن هذه الحمض النووي الريبي الصغيرة غير المشفرة في الأنسجة وسوائل الجسم (مثل الدم والبول) لمرضى السرطان مقابل غير السرطان ، والأفراد الأصحاء ، واستخدام المصفوفات الدقيقة ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qRT-PCR) ، والجيل التالي من تقنيات التسلسل العميق 1,2 . وقد ميزت الأبحاث الحديثة مجموعة فرعية كبيرة من هذه الحمض النووي الريبوزي المرسال كمثبطات للورم والأورام وعوامل الانبثاث التي تتحكم في تكوين الورم وتطور المرض ومقاومة الأدوية. يؤدي الإفراط التجريبي في التعبير و / أو انخفاض / فقدان الحمض النووي الريبوزي المرسال إلى عواقب وظيفية وتعدد الأضلاع في الخلية ، مما يعكس مجموعة واسعة من الأنشطة المرتبطة بالسرطان التي تنسقها هذه الحمض النووي الريبي غير المشفر - النمو ، موت الخلايا المبرمج ، التمايز ، إعادة تشكيل الكروماتين ، تكوين الأوعية الدموية ، الظهارية إلى الوسيطة (EMT) وتحولات MET ، التمثيل الغذائي ، والاستجابة المناعية3.

يتم ترميز MiRNAs كجينات مفردة أو موجودة في مجموعات جينومية ، والتي يتم نسخها في النواة ومعالجتها على نطاق واسع قبل توليد أنواع miRNA الناضجة بيولوجيا ، أحادية الخيط ~ 22 miRNA (nt) المترجمة في السيتوبلازم4. تمارس هذه الحمض النووي الريبي الصغيرة آثارها بعد النسخ وتعمل كمنظمات جينية سلبية ترتبط بأهداف الحمض النووي الريبي المرسال (mRNA) بطريقة محددة التسلسل لجلب مجمع إسكات الحمض النووي الريبي الحفاز الناجم عن الحمض النووي الريبي (RISC) إلى موقع mRNA ، مما يؤدي إلى تدهور mRNA و / أو كتلة في ترجمة البروتين. MiRNAs هي فئة وفيرة للغاية من الحمض النووي الريبي غير المشفر في الأنظمة الحيوانية ، ويوجد 2,654 miRNAs ناضجة في الجينوم البشري (miRBase release 22.1)5. ترتبط MiRNAs عادة بالتكامل غير الكامل مع أهداف الحمض النووي الريبوزي المرسال4. لذلك ، يمكن ل miRNA واحد تنظيم عشرات إلى مئات من أهداف mRNA المتميزة والتأثير وظيفيا على مجموعة كبيرة من المسارات البيولوجية. ولزيادة تعقيد الآليات القائمة على الحمض النووي الريبوزي المرسال، يمكن تنظيم الحمض النووي الريبوزي المرسال الواحد بواسطة الحمض النووي الريبوزي المرسال المتعدد والمتميز. وبالتالي ، من الصعب التحقيق في كيفية تعطيل خلل تنظيم miRNA للتوازن الاستتبابي في الجسم ويؤدي إلى ورم خبيث بشري.

ركزت غالبية الدراسات المنشورة على الحمض النووي الريبوزي المرسال (miRNA) واحد عند توصيف دورها في أحداث المرض. ومع ذلك ، يتم تنظيم ~ 30٪ من جينات miRNA البشرية في وحدات مجمعة (عادة ~ 10 كيلوقاعدة [kb]) والتي غالبا ما يتم نسخها في نفس الاتجاه والتعبير المشترك عنها ، مما يشير إلى نظام منسق ومعقد من تنظيم الحمض النووي الريبي غير المشفر6. أكبر مجموعة miRNA البشرية متعددة الرؤوس هي مجموعة 14q32 التي تضم 54 سلائف miRNA. واحدة من وحدات الحمض النووي الريبوزي المرسال العنقودي الأكثر دراسة المرتبطة بالسرطانات البشرية هي مجموعة miR-17-92 polycistronic التي تتكون من miR-17 و miR-18a و miR-19a و miR-20a و miR-19b-1 و miR-92-1 المقيمة داخل intron 3 من الحمض النووي الريبي غير المشفر ، c13orf25. غالبا ما يتم تضخيم مجموعة miR-17-92 في الأورام الخبيثة المكونة للدم والإفراط في التعبير عنها في الأورام الصلبة وقد أنشأت أدوارا ورمية المنشأ في تعزيز تطور دورة الخلية ، موت الخلايا المبرمج ، وتكوين الأوعيةالدموية 7. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما يتم حذف مجموعة miR-15a و miR-16-1 القمعية للورم الموجودة داخل مقدمة الجين غير المشفر Leu2 في سرطان الدم وتقليل تنظيمها في مجموعة كبيرة من السرطانات ، وتعمل على منع نمو الورم من خلال استهداف الجين المضاد للاستماتة BCL2 وجينات تطور دورة الخلية الإضافية8. مجموعة miR-888 مرتفعة في المرضى الذين يعانون من سرطان البروستاتا عالي الجودة وتتكون من سبعة جينات miRNA (miR-892c و -890 و -888 و -892a و -892b و -891b و -891a) تقع على الكروموسوم البشري Xq27.3 9,10.

الخرائط العنقودية miR-888 داخل موضع HPCX1 (سرطان البروستاتا الوراثي ، X-linked 1) التي تمتد عبر Xq27-2 ، والتي تم تحديدها من خلال تحليل الارتباط لنسب عائلة سرطان البروستاتا الوراثية11،12،13،14،15،29. أشار التوصيف الوظيفي للأعضاء الفرديين المتجمعين في miR-888 باستخدام أدوات التعبير الخاطئ التقليدية miRNA - miRNA يحاكي ومثبطات antisense - إلى أن هذه miRNAs تلعب أدوارا متداخلة في تنظيم نمو ورم البروستاتا وغزوه 9,10. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق التجريبية لا تصلح بسهولة لدراسة كيفية تصرف العديد من أعضاء miR-888 المتجمعين بشكل تآزري أو عدائي في شبكة RNA غير المشفرة للتحكم في توازن الأنسجة وتطور السرطان. تم تعديل هذا البروتوكول المبسط الموصوف باستخدام تقنية تحرير الجينات كريسبر عالية الإنتاجية لتشريح مجموعات الحمض النووي الريبوزي المرسال المرتبطة بالسرطانات البشرية (على سبيل المثال، مجموعة miR-888) لسد هذه الفجوة المعرفية.

تتوسط جينات كريسبر البكتيرية وجينات كريسبر المرتبطة (كاس) المناعة التكيفية ضد العاثيات البكتيرية16. تم تكييف اكتشاف نظام المراقبة البدائية القديم هذا بسرعة كأداة علمية فعالة لاستهداف أي موضع جينومي مرغوب فيه بسهولة وإجراء تعديلات في تسلسل الحمض النووي داخل مجموعة كبيرة من الأنظمة الحيوانية وأنواع الخلايا في المختبر وفي الجسم الحي16,17. هذه التقنية تبشر بخير كبير كوسيلة فعالة لاستجواب شبكات الحمض النووي الريبوزي المرسال في سياق الأمراض البشرية. تحقيقا لهذه الغاية ، تم بناء بروتوكول تحرير الجينات CRISPR عالي الإنتاجية لدراسة مجموعة miR-888 التي تمتد إلى ~ 35 كيلو بايت على الكروموسوم البشري X في خطوط خلايا سرطان البروستاتا البشرية المخلدة (LNCaP ، PC3-ML) لاستجواب كيفية تنسيق أعضاء المجموعة لمسارات تطور السرطان. يمكن تطبيق هذا النهج لتوصيف أي مجموعة miRNA ويسمح للباحثين بتوليد خطوط خلايا بشرية بسرعة تحمل حذف مجموعة miRNA بالكامل وحذف مجموعة جين miRNA الفردية والمركبة في تجربة واحدة.

في هذا الإجراء ، يتم إنشاء خطوط خلوية مستقرة تحمل نظام تعبير فيروسي مضاد للدوكسيسيكلين (DOX) يمكن الباحث من التحكم في المكورات العقدية المقيحة المرتبطة ب CRISPR endonuclease Cas9 (csn1) من خلال المروج التأسيسي المستحث DOX TRE3G. يتضمن نظام Tet-On 3G ثنائي الأطراف عامل استطالة بشري تأسيسي 1 ألفا (hEF1alpha) مروج لدفع نسخ كل من جين Tet-On 3G وجين مقاومة البلاستيسيدين (BlastR) كنسخة ثنائية الشكل. يرتبط بروتين Tet-On 3G transactivator فقط بمروج TRE3G في وجود DOX ، مما يؤدي إلى نسخ Cas9 قوي. في غياب DOX ، لا يوجد تعبير Cas9 قاعدي أو الحد الأدنى جدا. لذلك ، يمكن للباحث تحفيز إنتاج بروتين Cas9 العالي في الخلايا المزروعة في الوسائط المكملة ب DOX خلال خطوات تحرير الجينات CRISPR والتحكم في إزالة بروتين CAS9 السريع عند انسحاب DOX.

يصف هذا البروتوكول أيضا تصميم أوليغونوكليوتيدات الحمض النووي الريبي الاصطناعية كريسبر (crRNA) التي تستهدف المناطق المحيطة بمجموعة miRNA بأكملها ، ومناطق دبوس شعر miRNA الفردية (premiRNA) ، و / أو مجموعات فرعية من جينات miRNA داخل المجموعة. يحتوي كل CRRNA مصمم على تسلسل إرشادي فريد من نوعه 5'-terminal 20 nt (مكمل للتسلسل الجينومي الذي يجب استهدافه) ، متبوعا بتسلسل تكرار ثابت 22 nt S. pyogenes (5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3') الذي يتيح الاقتران الأساسي مع أوليغونوكليوتيدات CRISPR RNA (tracrRNA) العالمية المنشطة18. معا ، يعمل crRNA الملدن و tracrRNA (نسبة مختلطة 1: 1) كدليل الحمض النووي الريبي لهذا البروتوكول (الشكل 1A). في كل تجربة، يتم نقل اثنين من الحمض النووي الريبي المرشد الاصطناعي إلى الخلايا التي يسببها DOX لربط ومرافقة بروتين Cas9 البكتيري إلى مواقع الحمض النووي الجينومي (5 و 3 بوصة) المحيطة بمنطقة عنقود miRNA المستهدفة للإزالة (الشكل 1B).

يجب أن يكون تسلسل الزخارف المتجاور (PAM) (5'-NGG-3' للنوع البري S. pyogenes Cas9) موجودا في جينوم الخلية ويقع مباشرة بجوار تسلسل الحمض النووي 20 nt المستهدف بواسطة RNA17 الدليلي. يعمل تسلسل PAM كإشارة ربط ويضع المنطقة الحفازة لإنزيم endonuclease Cas9 على موقع الحمض النووي الجيني المستهدف ، مما يؤدي لاحقا إلى انقسام الحمض النووي الموجه والمزدوج (ds) الموجود ~ 3 nt في المنبع من PAM. تقوم آلية إصلاح الحمض النووي للخلية بإصلاح نهايات الحمض النووي المشقوق ، مما قد يؤدي إلى ربط مثالي ، ولكن غالبا ما يحدث انضمام نهاية غير متماثل (NHEJ) ، مما يتسبب في عمليات إدخال أو حذف صغيرة (indels) في موقع الإصلاح. نظرا لأن miRNAs هي جينات غير مشفرة غالبا ما تقع داخل المناطق الداخلية والداخلية ، فإن هذه الإندلات تحمل مخاطر منخفضة من خلق طفرات غير مرغوب فيها من الهراء / سوء الفهم.

من خلال استخدام أوليغونوكليوتيدات الحمض النووي الريبي الاصطناعية (crRNA الملدن و tracrRNA ، نسبة مولية 1: 1) لمجمع الحمض النووي الريبي الموجه في هذه التجارب ، تتجنب استراتيجية الضربة القاضية الجينية هذه الاستنساخ الفرعي لناقلات الحمض النووي التي تستغرق وقتا طويلا وتسمح بمرونة كبيرة في نقل مجموعات الحمض النووي الريبي الإرشادية الفريدة إلى الخلايا بتنسيق 24 بئرا. كما أن تحضير محللات الخلايا الخام لفحص النمط الوراثي ل PCR يتجنب أيضا طرق تنقية الحمض النووي المكلفة والمستهلكة للوقت ، مع السماح بتوليد خط خلية مستعمرة واحدة مبسط وتحليل النمط الظاهري. في الواقع ، تم استخدام بروتوكول تحرير الجينات CRISPR عالي الإنتاجية هذا بنجاح لنقل خطوط خلايا سرطان البروستاتا المستزرعة (LNCaP ، PC3-ML) مع 32 تركيبة RNA إرشادية فريدة في تجربة واحدة وإنشاء خطوط خروج المغلوب تحمل عمليات حذف لكامل منطقة الكتلة miR-888 ~ 35 كيلو بايت ؛ مجموعات حذف أصغر لأعضاء مجموعة miR-888 الذين ينتمون إلى عائلتي miR-743 و miR-891a ؛ بالإضافة إلى عمليات الحذف لأعضاء miRNA الفرديين داخل مجموعة miR-888. ستوفر مثل هذه الدراسات توضيحا أوضح لكيفية عمل الحمض النووي الريبوزي المرسال المتجمع بشكل تعاوني لتنظيم نمو الورم والعدوانية ومقاومة الأدوية قبل ترجمة الحمض النووي الريبوزي المرسال إلى العيادة كأدوات علاجية وتشخيصية.

Protocol

1. التحضير لتحرير الجينات كريسبر وتوجيه تصميم الحمض النووي الريبي لتوليد خطوط الخلايا القاضية العنقودية miRNA

  1. قم بإنشاء ملف DNA يحتوي على التسلسل الجينومي الكامل لمنطقة مجموعة miRNA ذات الأهمية (intergenic ، intronic) وما لا يقل عن 1 كيلو بايت من المناطق الجينومية المحيطة باستخدام برنامج التعليق التوضيحي لتسلسل الحمض النووي19.
    1. استخدم أداة تحرير المعالم في ملف الحمض النووي الذي تم إنشاؤه لوضع علامة على موضع مجموعة miRNA المستهدفة (intergenic ، intronic) وكل تسلسل فردي من دبوس شعر miRNA ينتمي إلى مجموعة miRNA ، بالإضافة إلى تدوين الجينات المشفرة وغير المشفرة القريبة الأخرى و / أو الميزات التنظيمية 5,20,21,22.
    2. تأكد من أن مناطق miRNA المستهدفة للحذف لا تعطل عن غير قصد جينات ترميز البروتين القريبة أو الجينات غير المشفرة أو عناصر الحمض النووي التنظيمية المهمة.
      ملاحظة: ضع في اعتبارك التعقيد الجينومي (على سبيل المثال، ازدواجية/اندماجات الكروموسومات) لخط الخلية المستخدم في هذا البروتوكول.
  2. تصميم الحمض النووي الريبوزي المرسال الاصطناعي الذي يستهدف 20 نانوت من تسلسل الحمض النووي الجيني المحيط بمجموعة الحمض النووي الريبوزي المرسال (miRNA) بأكملها، ومناطق دبوس شعر الحمض النووي الريبي الريبي (ما قبل الحمض النووي الريبوزي المرسال) الفردية، و/أو مجموعات فرعية من جينات الحمض النووي الريبي المرسال داخل المجموعة باستخدام أداة برمجية لتصميم الحمض النووي الريبي المرسال (دليل المعلوماتية الحيوية) (على سبيل المثال،23). تأكد من تدوين إنزيم Cas9 المناسب في أداة تصميم الحمض النووي الريبي الإرشادية (أي S. pyogenes كاس 9).
    ملاحظة: سيحتوي crRNA المركب على تسلسل دليل 5'-terminal 20 nt الفريد (مكمل لهدف الحمض النووي) متبوعا بثابت 22 nt S. pyogenes كرر التسلسل للسماح بالاقتران القاعدي مع أوليغونوكليوتيد tracrRNA العالمي المركب. بعد صلبها معا ، ستعمل كدليل الحمض النووي الريبي في هذا البروتوكول.
    1. بالرجوع إلى ملف الحمض النووي الذي تم إنشاؤه (الخطوة 1.1) ، أدخل ~ 150 nt من تسلسل الحمض النووي الموجود على الفور في المنبع (5') أو المصب (3') من موقع miRNA hairpin/cluster المستهدف للحذف في أداة برنامج تصميم الحمض النووي الريبي للدليل المعلوماتي الحيوي23.
      ملاحظة: ستحدد أداة التصميم تسلسلات 20 nt الفريدة لتصميم crRNA oligonucleotide التي تقع مباشرة بجوار تسلسل PAM (على شريط الحمض النووي غير المستهدف) (على سبيل المثال ، S. pyogenes Cas9 PAM تسلسل NGG). فيما يلي مثال على تصميم crRNA الذي يستهدف موقعا فوريا في المنبع (5 أقدام) من موضع جين mir-891a (على وجه التحديد 5A ( 891a ) الذي تمت مناقشته في قسم النتائج التمثيلية والجدول 1).
      1. افتح أداة برنامج تصميم الحمض النووي الريبي الإرشادية23.
      2. أدخل الاسم 5A(891a) في النافذة أدخل الاسم .
      3. في النافذة أدخل تسلسل الحمض النووي، أدخل 150 نانوت من التسلسل الجينومي الموجود مباشرة في المنبع (5 أقدام) من جين السلائف mir-891a : 5'-AAGAAAATATACATGCTGATAGTTACACAGG
        TTGTGAATAGTAAATTAGTATGTCATTTATTT
        TAGGTATTCAATGTTGCATAGTCATATTATA
        ATTACGTAGCTTCTTTGTTTTTTTTTTTCTAGGTT
        CCCAAAGAGTCTACAAATGTTGTCT-3'
      4. حدد المربع الذي يحمل علامة تمكين التحقق من الخصوصية لاستبعاد المواقع غير المستهدفة التي تم اكتشافها حسابيا بواسطة البرنامج. اختر الكائن الحي المناسب (أي الإنسان [الإنسان العاقل]).
      5. حدد إنزيم Cas9 الصحيح PAM المستخدم في الدراسات ، في هذه الحالة ، العقدية المقيحة Cas9-PAM:NGG ، لإنشاء الإعدادات الافتراضية التالية: PAM بالنسبة إلى الهدف: بعد ؛ تكرار التسلسل: GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG; نسبة إلى الدليل: 3; طول التسلسل المستهدف: 20; قطع بالنسبة للهدف 5' بداية: Sense 17 Anti-sense 17.
      6. انقر فوق الزر التالي لعرض نتائج تخليق crRNA الاصطناعي.
        ملاحظة: في هذا المثال، سيتعرف الحمض النووي الريبوزي المرسال المقترح تصنيعه على هدف الحمض النووي ATACATGCTGATAGTTACAC وسيكون موجودا بجوار PAM:AGG.
    2. قم بالرجوع إلى ملف الحمض النووي (الذي تم إنشاؤه في الخطوة 1.1.) لتحديد أفضل تسلسلات هدف crRNA 20 nt المرشحة التي تقع بالقرب من موضع miRNA المراد حذفها وتمتلك أعلى مواصفات للهدف الجينومي المقصود.
      1. استخدام أدوات التحليل الحسابي خارج الاستهداف لتقييم خصوصية الحمض النووي الريبوزي المرسال المرشح والتنبؤ بالمواقع المحتملة خارج الاستهداف في المواقع الجينومية التي لا علاقة لها بمنطقة مجموعة الحمض النووي الريبوزي المرسال المستهدفة ذات الأهمية (على سبيل المثال، 24،25،26،27).
      2. سجل النتائج المحتملة خارج الاستهداف للرجوع إليها لاحقا عند التنميط الجيني لخطوط الخلايا النسيلة CRISPR أحادية المستعمرة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) (الخطوة 4.2.6).
        ملاحظة: إن مدى تكامل التسلسل المشترك بين أوليغونوكليوتيد crRNA المصمم والتسلسل المستهدف الجينومي سوف يملي كيف يشق إنزيم Cas9 الجينوم بشكل انتقائي في ذلك الموضع. نظرا لأن الحمض النووي الريبي الموجه يتجه إلى الهدف الجيني في اتجاه 3 إلى 5 أقدام ، فإن عدم التطابق في نهاية 5 أقدام من تسلسل هدف الحمض النووي (أول 8-10 قواعد) غالبا ما يمنع الانقسام بوساطة Cas9. إذا كان التسلسل المستهدف الجينومي يشترك في التماثل مع موضع جينومي آخر ، باستثناء القواعد الثماني الأولى لتسلسل الحمض النووي ، فمن المتوقع أن يكون لهذا الحمض النووي الريبي الدليل فرصة منخفضة لعدم الاستهداف في هذا الموقع.
      3. صمم أربعة كرنا RNAs فريدة لكل موضع miRNA مستهدف: اثنان من crRNAs المصممة لاستهداف تسلسلات الحمض النووي التكميلية على الفور 5 'من دبوس الشعر / الكتلة miRNA (5'A ، 5'B) واثنين من crRNAs المصممة لاستهداف تسلسلات الحمض النووي التكميلية على الفور 3' من دبوس الشعر / الكتلة miRNA (3'A ، 3'B).
        ملاحظة: عند إجراء عمليات نقل كريسبر (في القسم 3)، سيتم اختبار أربع مجموعات ممكنة من أزواج الحمض النووي الريبي (5 أقدام و3 بوصات (5 أقدام و3 أ و3 أ و5 أ + 3 ب ب و5 ب + 3 ب ب 5 ب + 3 ب) لكل موضع ميرنا مستهدف لزيادة احتمال توليد عمليات حذف ناجحة لموضع الحمض النووي الريبوزي المرسال في تجربة واحدة.
      4. استخدم أداة تحرير المعالم في ملف الحمض النووي الذي تم إنشاؤه (الخطوة 1.1.) لوضع علامة على تسلسل هدف الحمض النووي (مع PAM المجاور) لكل crRNA مصمم ليتم توليفه.
  3. تصميم وتوليف الاشعال PCR (إلى الأمام والعكس) التي تحيط بمناطق مجموعة miRNA المستهدفة للتنميط الجيني لخطوط خلايا كريسبر (وتسمية الاشعال في ملف الحمض النووي الذي تم إنشاؤه).
    1. بالنسبة لخطوط خلايا التنميط الجيني التي تحمل عمليات حذف جينومية صغيرة ل miRNAs المتجمعة أو الفردية بشكل وثيق ، قم بتصميم الاشعال PCR (إلى الأمام ، العكس) التي تعيش حوالي 150 نقطة أساس على كل جانب من جوانب موقع الانقسام Cas9 / منطقة الضربة القاضية التي ستمكن من اكتشاف كل من النوع البري (~ 600 نقطة أساس) والضربة القاضية (~ 300 نقطة أساس) في تفاعل PCR واحد عبر الرحلان الكهربائي الهلامي.
    2. بالنسبة لخطوط خلايا التنميط الجيني التي تحمل عمليات حذف جينومية كبيرة لمجموعات سلائف miRNA أو مجموعة miRNA بأكملها ، قم مرة أخرى بتصميم التمهيدي PCR (إلى الأمام ، العكس) الذي يقيم حوالي 150 نقطة أساس على كل جانب من جوانب موقع الانقسام / الضربة القاضية Cas9. لاحظ أنه إذا كان حذف مجموعة miRNA المستهدفة يمتد >4 كيلو بايت في الطول ، فمن المحتمل أن يكتشف تفاعل PCR فقط جزء الحمض النووي الأصغر (~ 300 نقطة أساس) ولكن ليس جزء الحمض النووي من النوع البري. لذلك ، قم بتصميم اشعال PCR إضافية (أمامية ، عكسية) يمكنها اكتشاف وجود أو عدم وجود جينات عنقودية miRNA داخلية للمساعدة في عملية الفحص والتحقق من صحة خطوط الخلايا القاضية المتجانسة الزيجوت.

2. توليد خطوط الخلايا المستقرة التي تحمل كاسيت تعبير Cas9 المستحث DOX

ملاحظة: إجراء جميع أعمال زراعة الخلايا والفيروسات في غطاء معتمد للسلامة الأحيائية باستخدام إجراءات BSL2 وتقنية التعقيم.

  1. حدد نوع خط الخلية المناسب لدراسات كريسبر ووسائط النمو المفضلة.
    ملاحظة: تم تطوير هذا البروتوكول لخطوط خلايا سرطان البروستاتا البشرية LNCaP (الوسط المفضل: RPMI، 10٪ مصل البقر الجنيني [FBS]) و PC3-ML (الوسط المفضل: DMEM، 10٪ FBS).
  2. قم بإجراء منحنى "موت" البلاستيسيدين لتحديد تركيز الدواء الأمثل لاختيار الخلايا المصابة بفيروس lentivirus التي تحمل كاسيت جين مقاومة البلاستيسيدين (الخطوة 2.3).
    1. خلايا الصفائح في 11 بئرا من صفيحة 24 بئرا وتنمو عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 في الوسط المفضل حتى تلتقي حوالي 75٪.
    2. تمييع البلاستيسيدين (مخزون العمل 1 ملغم/مل) في الوسط المفضل بتركيز نهائي يتراوح من 0، 1، إلى 10 ميكروغرام/مل ويخفف بزيادات قدرها 1 ميكروغرام/مل.
    3. قم بتسمية آبار لوحة 24 بئرا البذرية من 1 إلى 11. إزالة وسط النمو من الآبار واستبداله بتركيزات البلاستيسيدين المناسبة.
    4. تغيير الوسط مع تركيزات البلاستيسيدين المناسبة كل يوم لمدة 7-10 أيام.
    5. فحص الخلايا يوميا خلال الدورة الزمنية وتحديد الحد الأدنى لتركيز البلاستيسيدين المطلوب لقتل جميع الخلايا في غضون 5-7 أيام.
      ملاحظة: يجب إجراء منحنى "قتل" البلاستيسيدين لكل خط خلية محدد يستخدم في تجارب تحرير الجينات كريسبر.
  3. إصابة الخلايا بفيروس lentivirus الذي يحمل كاسيت تعبير Cas9 المستحث DOX وإجراء اختيار blasticidin باستخدام التركيز الأمثل المحدد في الخطوة 2.2.
    1. في ثلاثة آبار من صفيحة من 6 آبار ، البذور 5 × 104 خلايا لكل بئر وتنمو في الوسط المفضل عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO2 بين عشية وضحاها (ON).
    2. في اليوم التالي ، قم بإذابة ناقل تعبير lentivirus ل Cas9 المستحث DOX (Lenti-iCas9) على الجليد. اخلط بلطف (لا تخلط جزيئات الفيروس).
      ملاحظة: قم بتخزين الفيروس في الأليكوتات عند -80 درجة مئوية لتجنب دورات التجميد / الذوبان المتعددة ، مما يقلل من العيار الفيروسي وكفاءة العدوى.
    3. احسب الحجم اللازم لنقل 5 × 104 خلايا مصابة بالفيروس عند تعدد العدوى 0.3 (MOI = 0.3) بناء على تركيز عيار الفيروس.
    4. ويتحول حجم الفيروس المناسب إلى 250 ميكرولتر (لكل بئر) من الوسط المفضل الخالي من المصل والمضادات الحيوية المكمل ببروميد سداسي أديميثرين 0.8 ميكروغرام/مل. اخلطي بلطف.
      ملاحظة: بروميد هيكساديميثرين هو بوليمر كاتيوني وجد أنه يزيد من الامتزاز الفيروسي وكفاءة العدوى.
    5. قم بإزالة الوسيط. أضف 250 ميكرولتر من وسط النقل المحضر مع فيروس Lenti-iCas9 (MOI = 0.3) إلى الخلايا واحتضن ON عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2. (تقصير وقت الحضانة إلى 4-6 ساعات إذا أظهرت الخلايا تأثيرات سامة مرتبطة بالفيروس.)
    6. استبدل الوسط بوسط مفضل طازج واسمح للخلايا بالتعافي لمدة 1-2 أيام.
    7. قم بإجراء اختيار البلاستيسيدين على الخلايا المصابة لمدة 10-14 يوما باستخدام تركيز البلاستسيدين الأمثل المشتق من منحنى "القتل" الموضح في الخطوة 2.2.
      1. في موازاة ذلك ، تنمو الخلايا غير المصابة في وسط مع تركيز البلاستسيدين الأمثل لاستخدامها كعنصر تحكم إيجابي للانتقاء الفيروسي.
    8. تغيير الوسط المكمل بتركيز البلاستيسيدين الأمثل كل 3 أيام خلال دورة وقت الاختيار لإزالة الخلايا الميتة.
      ملاحظة: فقط الخلايا التي تنجو من اختيار البلاستيسيدين ستكون قد دمجت الناقل الفيروسي اللئيم.
    9. قم بتوسيع خطوط خلايا Lenti-iCas9 المحددة من قبل البلاستيسيدين.
      ملاحظة: قم بتسجيل رقم مرور الخلية عند كل توسيع.
      1. قم بتجميد جزء من خلايا Lenti-iCas9 في الوسط المفضل المكمل بنسبة 10٪ من ثاني أكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) للتخزين المبرد على المدى الطويل.
      2. قم بتحليل جزء من خلايا Lenti-iCas9 بواسطة اللطخة الغربية9 لتحديد خط الخلية الذي يعرض أقوى مستويات بروتين Cas9 المستحث ل DOX (انظر الخطوة 2.3).
  4. قم بإجراء منحنى تركيز الدوكسيسيكلين على خطوط خلايا Lenti-iCas9 المنشأة حديثا لتحديد الظروف المثلى لتحريض بروتين Cas9.
    1. قم بإعداد أربعة ألواح مستقلة من 6 آبار لكل خط خلية تم اختباره لتنفيذ دورة وقت تركيز DOX هذه. لوحة 5 × 104 خلايا لكل بئر من كل لوحة 6 آبار وتنمو عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO2 في الوسط المفضل لمدة 24 ساعة.
    2. تمييع DOX (مخزون عامل 1 ملغم / مل) في الوسط المفضل مع منحنى تركيز DOX نهائي يتراوح من 0 و 50 و 100 و 150 و 250 إلى 500 نانوغرام / مل.
    3. قم بتسمية آبار كل طبق من 6 آبار مبذرة من 1 إلى 6. قم بإزالة الوسط واستبدله بتركيزات DOX المناسبة. تنمو الألواح 1-4 حتى النقاط الزمنية التالية: 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة DOX الحث ؛ و 120 ساعة بعد انسحاب DOX (في البداية 72 ساعة DOX المستحثة).
    4. حصاد آبار الصفيحة في كل نقطة زمنية باستخدام الطرق المناسبة (على سبيل المثال ، التربسين). تخزين كريات الخلايا في -80 درجة مئوية. قم بمعالجة كريات الخلايا في مخزن RIPA المؤقت لعزل الليزات وتحليل اللطخة الغربية Cas9.
      1. قم بتشغيل 40 ميكروغرام من محللات الخلايا لكل عينة من دورة DOX-induction الزمنية باستخدام جل Bis-Tris الذي يعمل على تغيير الطبيعة بنسبة 4٪ -12٪ ونقل البروتينات إلى غشاء اللطخة المناعية.
      2. قم بتهجين غشاء اللطخة المناعية بجسم مضاد أساسي ضد Cas9 للكشف عن بروتين 160 kDa. تطبيع مستويات Cas9 باستخدام جين التدبير المنزلي مثل GAPDH (37 kDa).
    5. استنادا إلى نتائج اللطخة الغربية، حدد تركيز DOX الأمثل لتحفيز Cas9 في خطوط خلايا Lenti-iCas9.
      ملاحظة: ستكشف هذه الدورة التدريبية أيضا عن مدى إحكام تنظيم تعبير Cas9 عند إزالة DOX بعد 120 ساعة.
    6. أنشئ مستعمرات أحادية الخلية لخطوط خلايا Lenti-iCas9 التي تظهر تعبيرا قويا عن بروتين Cas9 لتحسين تحويلات CRISPR (في القسم 3).

3. إجراء تفاعلات كريسبر عن طريق تحريض Cas9 ونقل الحمض النووي الريبي الموجه الاصطناعي للخلايا باستخدام تنسيق عالي الإنتاجية

ملاحظة: يظهر رسم تخطيطي لسير العمل في الشكل 1.

  1. على الورق ، قم برسم مجموعات زوج crRNA التي سيتم نقلها إلى كل بئر من صفيحة 24 بئرا تستهدف مجموعة miRNA بأكملها ، ومجموعات جينات miRNA المجمعة المختلفة ، بالإضافة إلى أعضاء مجموعة miRNA الفردية.
    1. على الخريطة ، قم بتسمية أربعة آبار لكل موضع miRNA مستهدف. اجعل كل بئر يمثل تفاعل نقل ، مع اثنين من الحمض النووي الريبوزي المرسال الفريد من نوعه في وضع 5 و 3 بوصة من الموضع الجينومي الضربة القاضية miRNA المطلوب و tracrRNA (نسبة مولية ملدنة 1: 1).
    2. تأكد من أن كل بئر من الآبار الأربعة المصنفة تمثل زوجا فريدا من CRRNA للنقل (على سبيل المثال ، 5'A + 3'A ؛ 5'A + 3'B ؛ 5'B + 3'A ؛ 5'B + 3'B).
      ملاحظة: يتيح تصميم اثنين من الحمض النووي الريبوزي المرسال 5 أقدام واثنين من الحمض النووي الريبوزي المرسال 3 أقدام يحيط بكل موضع مستهدف من الحمض النووي الريبوزي المرسال (القسم 1) توليد أربعة أزواج ممكنة من الحمض النووي الريبي الإرشادي 5 و 3 أقدام في تفاعل النقل.
  2. قم بلوحة خط خلية Lenti-iCas9 عند 5 × 10 4 خلايا/بئر من صفيحة ذات 24 بئرا في الوسط المفضل الذي يحتوي على تركيز DOX الأمثل (المحدد في الخطوة2.4 ). تنمو الخلايا لمدة 24-48 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 للحث على التعبير عن بروتين Cas9.
  3. قم بنقل خلايا Lenti-iCas9 باستخدام الحمض النووي الريبي الإرشادي 5 و 3 بوصة.
    1. إعادة تشكيل crRNA المركب و tracrRNA oligonucleotides مع الماء الخالي من النوكليز إلى تركيز مخزون قدره 10 ميكرومتر.
    2. قم بتسمية أربعة أنابيب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل لكل موضع miRNA مستهدف استنادا إلى الخريطة التجريبية المصممة في الخطوة 3.1 ، والتي تمثل مجموعات أزواج crRNA الأربعة المحتملة 5 و 3 بوصات (5 'A + 3'A ؛ 5'A + 3'B ؛ 5'B + 3'A ؛ 5'B + 3'B).
    3. في كل أنبوب، امزج نسبة مولية 1:1 من tracrRNA و crRNAs الفريدة (5 أقدام و 3 بوصات) معا لتشكيل مركب الحمض النووي الريبي الموجه 2 ميكرومتر باستخدام التفاعل التالي (الحجم النهائي 10 ميكرولتر):
      1. أضف 2.5 ميكرولتر من tracrRNA (مخزون 10 ميكرومتر) ، و 1.25 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المرسال 5 '(10 ميكرومتر) ، و 1.25 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المرسال 3 ' (10 ميكرومتر من المخزون) ، و 5 ميكرولتر من 10 mM tris-HCL الرقم الهيدروجيني 7.5 إلى أنبوب طرد مركزي 1.5 مل. جهاز طرد مركزي دقيق لمدة 30 ثانية عند 16000 × غرام للخلط. احتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق.
    4. يضاف إلى كل أنبوب، 40 ميكرولتر من وسط المصل المنخفض (على سبيل المثال، Opti-MEM) إلى 10 ميكرولتر من تفاعل الحمض النووي الريبي المعقد الموجه (الحجم الإجمالي 50 ميكرولتر). اخلطي بلطف عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.
    5. في أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 1.5 مل، امزج 2 ميكرولتر من كاشف النقل28 (انظر الملاحظة 3.3.5.1) و48 ميكرولتر من وسط المصل المنخفض (على سبيل المثال، Opti-MEM، الحجم النهائي البالغ 50 ميكرولتر) بلطف عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. احتضان في RT لمدة 5 دقائق.
      1. قم بإعداد مزيج رئيسي من كاشف النقل عن طريق ضرب الكاشف (2 ميكرولتر) وتقليل وسط المصل (على سبيل المثال ، Opti-MEM ، 48 ميكرولتر) بعدد الآبار المراد نقلها ، بالإضافة إلى حجم إضافي بنسبة 10٪ لحساب عدم دقة السحب الطفيفة.
        ملاحظة: حدد كاشف نقل تم تحسينه لعمليات نقل الحمض النووي الريبي الصغيرة والحمض النووي الريبي CRISPR oligonucleotide، وكذلك لنوع خط الخلية28.
    6. إلى كل أنبوب يحتوي على 50 ميكرولتر من مزيج الحمض النووي الريبي الموجه (من الخطوة 3.3.4) ، أضف 50 ميكرولتر من كاشف النقل المخفف (من الخطوة 3.3.5). ضع الخليط ببطء لأعلى ولأسفل مرة واحدة للخلط. احتضان في RT لمدة 20 دقيقة.
    7. أضف 400 ميكرولتر من الوسط الخالي من المضادات الحيوية المكمل ب DOX (التركيز الأمثل) إلى كل أنبوب يحتوي على 100 ميكرولتر من مزيج الحمض النووي الريبي / النقل التوجيهي. Pipet بلطف للخلط.
  4. قم بإزالة الوسط من خلايا Lenti-iCas9 المستحثة ب DOX (الخطوة 3.2). أضف 500 ميكرولتر من مزيج الوسائط / DOX / دليل الحمض النووي الريبي / النقل استنادا إلى الخريطة التجريبية للوحة المكونة من 24 بئرا (الخطوة 3.1). احتضن الخلايا المنقولة لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
  5. استبدل الوسط بالوسيط المفضل الطازج بدون DOX (لإزالة بروتين Cas9 من الخلايا). اسمح للخلايا بالتعافي لمدة 24-48 ساعة أخرى عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
  6. حصاد الخلايا المنقولة (التربسينات) والاستعداد للتنميط الجيني وتخفيف الخلية الواحدة.
    ملاحظة: تمثل الخلايا مجموعة مختلطة تحتوي على خلايا من النوع البري منقولة جينيا من كريسبر وغير منقولة. ستحدد هذه الخطوة كفاءة تحرير كريسبر قبل استثمار الوقت/الموارد في توسيع مستعمرة الخلية الواحدة.
    1. اغسل الخلايا 1x ب 1 مل من المياه المالحة العازلة بالفوسفات (PBS). احتضان الخلايا في 100 ميكرولتر من التربسين لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ونقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي نظيف 1.5 مل يحتوي على 1 مل من الوسط.
    2. قم بعكس الخلايا لمزجها وطردها المركزي لمدة 5 دقائق عند 200 × جم عند 20 درجة مئوية. قم بإزالة الوسط وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من PBS.
    3. الطرد المركزي الدقيق الخلايا المغسولة لمدة 5 دقائق عند 200 × غرام عند 20 درجة مئوية. قم بإزالة PBS وإعادة تعليق بيليه الخلية في 150 ميكرولتر من الوسط المفضل.
  7. حدد عدد الخلايا لكل ميكرولتر من 150 ميكرولتر من الخلايا المعاد تعليقها باستخدام مقياس الدم أو أداة عد الخلايا الآلية.
  8. افصل 150 ميكرولتر من الخلايا المعاد تعليقها إلى ثلاثة أجزاء.
    1. قم بتجميد 1/3 من الخلايا المنقولة (50 ميكرولتر) في متوسطة بالإضافة إلى 10٪ DMSO (الحجم النهائي 150 ميكرولتر) في cryovials للتوسع المستقبلي / التخزين طويل الأجل.
    2. نقل 1/3 من الخلايا المنقولة (50 ميكرولتر) إلى أنبوب PCR نظيف 0.2 مل للتنميط الجيني.
      1. الطرد المركزي الدقيق للخلايا لمدة 5 دقائق في 200 × غرام عند 4 درجات مئوية وإزالة الوسط.
      2. أعد تعليق بيليه الخلية في 100 ميكرولتر من PBS.
      3. الطرد المركزي الدقيق للخلايا لمدة 5 دقائق في 200 × غرام عند 4 درجات مئوية وإزالة PBS. تخزين كريات الخلايا المختلطة على المدى الطويل عند -80 درجة مئوية.
      4. معالجة بيليه الخلية للتنميط الجيني باستخدام سير العمل في القسم 4.
    3. قم بإعداد 1/3 النهائي من الخلايا (50 ميكرولتر) للتخفيف والطلاء في شكل لوحة 96 بئرا لتوليد مستعمرات أحادية الخلية.
      1. استنادا إلى عدد الخلايا في الخطوة 3.7.، احسب التخفيفات المطلوبة لتحقيق 10 و 5 و 2 و 1 خلية (خلايا) في 100 ميكرولتر من الوسط لكل بئر من صفيحة 96 بئرا.
      2. باستخدام ماصة متعددة القنوات من 12 قناة وخزان كاشف معقم ، أضف 100 ميكرولتر من الخلايا المخففة لكل بئر إلى صفيفين من الصفيحة (إجمالي 24 بئرا) لكل تخفيف (10 أو 5 أو 2 أو خلية واحدة لكل بئر). اسمح ب 4-6 أسابيع حتى تنمو الخلايا إلى التقاء لتوسيع مستعمرة الخلية الواحدة. راقب الخلايا أسبوعيا تحت المجهر الضوئي ولاحظ ما إذا كانت المستعمرات تمثل مستعمرات أحادية أو متعددة الخلايا.
      3. جمع ~ 10-15 مستعمرات أحادية الخلية للتنميط الجيني (القسم 4). حدد على الأقل ثلاثة خطوط مستعمرة مستقلة أحادية الخلية لكل موضع miRNA مستهدف. احتفظ بخطوط أحادية الخلية من النوع البري كعناصر تحكم.
        ملاحظة: يعتمد رقم الفحص على نوع خط الخلية وتأثير النمط الظاهري للضربة القاضية miRNA على نمو الخلية / قابليتها للحياة.

4. التنميط الجيني PCR لخطوط خلايا كريسبر باستخدام محللات الخلايا الخام

  1. حصاد مستعمرات فردية أحادية الخلية من آبار شبه ملتحقة بلوحة من 96 بئرا.
    ملاحظة: يمكن إجراء إزالة الوسيط/PBS الموصوف في هذه الخطوات يدويا باستخدام شفاط فراغي في خزانة السلامة الأحيائية، ولكن كن حذرا لتجنب التلوث المتبادل. استخدم طرف ماصة "أصفر" معقم جديد سعة 200 ميكرولتر لكل بئر من صفيحة 96 بئرا عند الشفط ، حيث يتم وضع كل طرف أصفر متبادل بإحكام في نهاية ماصة مراعي زجاجية معقمة متصلة بشفاط التفريغ.
    1. اغسل الآبار 1x ب 100 ميكرولتر من PBS. شفط PBS.
    2. أضف 50 ميكرولتر من التربسين واحتضنها لمدة 2-5 دقائق عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
    3. قم بسحب الماصة بلطف لأعلى ولأسفل ونقل الخلايا المعاد تعليقها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل يحتوي على 1 مل من الوسط.
    4. قم بعكس ذلك لخلط الخلايا وتحريكها بلطف في جهاز طرد مركزي دقيق لمدة 5 دقائق عند 200 × جم عند 20 درجة مئوية.
    5. قم بإزالة الوسط وإضافة 1 مل من PBS. قم بتحريك الأنبوب بلطف لتعطيل الكريات وقلبها عدة مرات للخلط.
    6. جهاز طرد مركزي دقيق لمدة 5 دقائق عند 200 × جم عند 20 درجة مئوية لتكوير الخلايا.
    7. قم بإزالة PBS وإعادة تعليق الكريات في 300 ميكرولتر من PBS الطازجة.
    8. قسم عينة 300 ميكرولتر إلى قسمين.
      1. نقل 200 ميكرولتر من الخلايا (2/3 من الكرية) إلى بئر من صفيحة 24 بئر تحتوي على 1 مل من الوسط المفضل. بمجرد التحقق من صحة النمط الوراثي ، استخدم هذه الخلايا لتوسيع خطوط الخلايا القاضية بوساطة كريسبر للتحليل الوظيفي.
      2. نقل 100 ميكرولتر من الخلايا (1/3 من الكرية) إلى أنبوب PCR 0.2 مل. جهاز طرد مركزي دقيق لمدة 5 دقائق عند 3000 × جم عند 4 درجات مئوية. إزالة PBS. تخزين الكريات في -80 درجة مئوية.
  2. قم بإعداد محللات الخلايا الخام للتنميط الجيني وتحليل التسلسل باستخدام الاشعال PCR المصممة في الخطوة 1.3. قم بتضمين محللات الخلايا المحضرة من الخلايا غير المنقولة في هذه التجارب لاستخدامها كعناصر تحكم إيجابية من النوع البري.
    1. أعد تعليق حبيبات الخلية في 4 ميكرولتر من المخزن المؤقت لبوليميراز الحمض النووي 5x (انظر جدول المواد ، التركيز النهائي 1x) ، و 1 ميكرولتر من Proteinase K (20 نانوغرام / مل من مخزون) ، و 1 ميكرولتر من RNase A (مخزون 10 نانوغرام / مل) ، والماء الخالي من النوكليز حتى حجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر.
    2. قم بتحليل الخلايا في جهاز تدوير حراري باستخدام برنامج PCR: 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة و 96 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تخزين الليزات الخلوية في -20 درجة مئوية.
    3. قم بإجراء تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الاشعال PCR المصمم (إلى الأمام والخلف) الذي يحيط بالمواقع المستهدفة للحمض النووي الريبي المرشد RNA 5 و 3 (الجدول 1).
      ملاحظة: تعتمد ظروف المخزن المؤقت لبوليميراز الحمض النووي والدورة الحرارية على إنزيم بوليميراز الحمض النووي Taq المستخدم في تفاعل PCR. تم تحسين هذا البروتوكول لبوليميراز الحمض النووي Phusion HF.
      1. قم بإعداد مزيج تفاعل PCR على الجليد: 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت لبوليميراز الحمض النووي 5x ، و 0.5 ميكرولتر من التمهيدي PCR الأمامي (مخزون 10 ميكرومتر) ، و 0.5 ميكرولتر من التمهيدي PCR العكسي (مخزون 10 ميكرومتر) ، و 0.5 ميكرولتر من 10 mM dNTPs ، و 0.25 μL من DNA Polymerase ، و 1-4 ميكرولتر من تحلل الخلايا ، والماء الخالي من النوكليز حتى حجم إجمالي قدره 25 ميكرولتر.
      2. قم بتشغيل تفاعل PCR في دورة حرارية باستخدام البرنامج: 98 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، و 35 دورة من 98 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، و 62 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، ثم 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. عقد لمدة 4 درجات مئوية. انظر الملاحظة 3.2.4. فوق.
    4. قم بتحميل منتجات PCR على هلام أغاروز بنسبة 1٪ لتحليل الرحلان الكهربائي.
    5. استخراج الحمض النووي من شظايا PCR المعزولة من الحجم الجزيئي المتوقع للأنماط الجينية بالضربة القاضية (والنوع البري). إعداد العينات لتسلسل الحمض النووي.
    6. تحقق من نجاح تفاعل كريسبر وقم بإجراء تسلسل الحمض النووي لشظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل المعزولة لتحديد موقع الانقسام Cas9 وتأكيد حذف موضع الحمض النووي الريبوزي المرسال.
      1. اعزل ما لا يقل عن ثلاثة خطوط خلايا خروج المغلوب المستقلة لكل موضع miRNA مستهدف بواسطة CRISPR. الاحتفاظ بخطوط الخلايا البرية (وغير المتجانسة) لاستخدامها كعناصر تحكم في الدراسات الوظيفية النهائية.
      2. قم بإجراء qRT-PCR أو تحليل اللطخة الشمالية للتأكد من أن خطوط الخلايا القاضية لا تعبر عن miRNA الناضج للموضع المحذوف.
        ملاحظة: تسلسل الجينوم الكامل (WGS) هو الطريقة الأكثر تحديدا للتحقق من صحة تحرير جينات كريسبر وخارج الاستهداف.
      3. اختبار تأثيرات كريسبر خارج الاستهداف بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل، والتي تم التنبؤ بها حسابيا (الخطوة 1.2.3.) 24,25,26,27.
      4. إذا كان الفحص الشامل لمستعمرة الخلية الواحدة يؤدي فقط إلى أنماط وراثية غير متجانسة الزيجوت ، فكرر توجيه نقل الحمض النووي الريبي في خطوط الخلية الواحدة غير المتجانسة.
        ملاحظة: عدم القدرة على الحصول على خطوط الخلايا القاضية متماثلة الزيجوت يمكن أن تشير إلى آثار قاتلة بسبب فقدان miRNA أو التعقيد الجينومي المتأصل (على سبيل المثال ، الازدواجية / الانصهار الكروموسومي) لخط الخلية الأبوية التي تتطلب مزيدا من التحليل.

النتائج

تم استخدام بروتوكول حذف كريسبر عالي الإنتاجية هذا بنجاح باستخدام نقل خطوط الخلايا السرطانية البشرية LNCaP و PC3-ML المستحثة Cas9 مع الحمض النووي الريبي الموجه لأوليغونوكليوتيد الاصطناعي الذي يستهدف مجموعة miR-888 ، والتي تمت دراستها في سياق سرطان البروستاتا. تم تحديد مجموعة miR-888 في البداية في شاشة...

Discussion

يسمح إجراء تحرير الجينات CRISPR هذا للباحث بإنشاء لوحة كاملة من خطوط الخلايا بسرعة تحمل مجموعات فريدة من نوعها لحذف مجموعات miRNA. إن نقل الحمض النووي الريبي الموجه الاصطناعي المكون من 5 و 3 أقدام و 3 من الحمض النووي الريبوزي المرسال الخاص بالموقع الجينومي الملدن مع الحمض النووي الريبي الثلاثي ا...

Disclosures

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

تم توفير خطوط خلايا PC3-ML من قبل مارك ستيرن (كلية الطب بجامعة دريكسل). ساعد جاستن توكسي في التنميط الجيني PCR. تم دعم هذا العمل من خلال منحة مؤسسة بريدان آدامز ، وصندوق ريان للبحوث الانتقالية ، ومنحة مجلس الكومنولث للبحوث الصحية (CHRB-274-11-20) إلى AE-K.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 mL PCR tubes, flat capFisher14-230-225Plasticware
1.5 mL Microcentrifuge TubesSeal-Rite1615-5500Plasticware
24-well tissue culture plateCorning Costar 09761146Plasticware
5x Phusion HF BufferThermo ScientificF-518LPCR reagent, genotyping
6-well tissue culture plateFisherFB012927Plasticware
96-well tissue culture plateFalcon08-772-2CPlasticware
Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonalAbCamab191468Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200
Antibiotic-Antimycotic (100x)Gibco15240062Tisuue culture reagent
BLAST nucleotide search engineNational Center for Biotechnology InformationNAFreeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov
Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenesCalbiochemCAS 589205CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water
Countess 3 Automated Cell CounterInvitrogenA50298Equipment; Cell counter
Cryogenic tubesThermo Scientific50001012Plasticware
Dharmacon CRISPR Design ToolHorizon Discovery Ltd.NAFreeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer
DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2Dharmacon, Inc.T-2002-02Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher BP231100Tisuue culture reagent
DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium PyruvateCorningMT10013CVTisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells
Doxycycline Hydrochloride, Ready Made SolutionSigma-AldrichD3072-1MLCRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water
DPBS, no calcium, no magnesiumGibco14190144Tisuue culture reagent
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designedDharmacon, Inc.U-002005-20CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides
Edit-R Modified Synthetic crRNA,
desalted/deprotected, 2 nmol		Dharmacon, Inc.crRNA-460XXXCRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides
EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 μL, 107 TU/mLDharmacon, Inc.VCAS11227CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system
Ensembl genomic viewerEnsemblNAFreeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences.
GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonalSanta Cruz Biotechnologysc25778Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500
Gel/PCR DNA Fragment Extraction KitIBI ScientificIB47010Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Gibco Fetal Bovine Serum, certifiedGibco16000044Tisuue culture reagent
Hexadimethrine bromideMilliporeSigmaH9268CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL
Immobilon-FL PVDF MembraneMilliporeSigmaIPFL10100Western blot reagent; nitrocellulose
Intercept (TBS) Blocking BufferLI-COR927-60001Western blot reagent
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary AntibodyLI-COR926-68070Western blot reagent
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary AntibodyLI-COR926-32211Western blot reagent
MicrocentrifugeEppendorf 5425 RPlasticware
miRBase microRNA viewermiRBaseNAFreeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb.
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-wellInvitrogenNP0321BOXWestern blot reagent
Odyssey CLx Imaging SystemLI-CORCLxEquipment; Western blot imaging
Opti-MEM Reduced Serum MediumGibco31985062Transfection reagent
Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis SystemOwlD2-BPEquipment; Nucleic acid gel electrophoresis system
PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides)Integrated DNA TechnologyNAPCR reagent, genotyping
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL)Thermo ScientificF530SPCR reagent, genotyping
RIPA Lysis Buffer 10xMilliporeSigma20-188Western blot reagent
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA gradeInvitrogen25530049PCR reagent, genotyping
RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL)Thermo ScientificEN0531PCR reagent, genotyping
RPMI 1640 MediumGibcoMT10041CVTisuue culture reagent; Media for LNCaP cells
SnapGene ViewerSnap GeneNAFreeware; website: [snapgene.com] Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which  highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features
TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol redGibco12563029Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin
UltraPure AgaroseInvitrogen16500100Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Veriti 96-Well Fast Thermal CyclerThermoFisher Scientific4375305Equipment
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis SystemInvitrogenEI0001Equipment; Protein gel electrophoresis system

References

  1. Hasegawa, T., Lewis, H., Esquela-Kerscher, A., Laurence, J. . Translating MicroRNAs to the Clinic. , 329-369 (2017).
  2. Lewis, H., Esquela-Kerscher, A., Thiagalingam, S. . Systems Biology of Cancer. , 134-153 (2015).
  3. Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs - microRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
  4. Breving, K., Esquela-Kerscher, A. The complexities of microRNA regulation: mirandering around the rules. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (8), 1316-1329 (2010).
  5. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, 154-158 (2008).
  6. Kabekkodu, S. P., et al. Clustered miRNAs and their role in biological functions and diseases. Biological Reviews. 93 (4), 1955-1986 (2018).
  7. Xiang, J., Wu, J. Feud or friend? The role of the miR-17-92 cluster in tumorigenesis. Current Genomics. 11 (2), 129-135 (2010).
  8. Aqeilan, R. I., Calin, G. A., Croce, C. M. miR-15a and miR-16-1 in cancer: discovery, function and future perspectives. Cell Death & Differentiation. 17 (2), 215-220 (2010).
  9. Hasegawa, T., et al. Characterization and evidence of the miR-888 cluster as a novel cancer network in prostate. Molecular Cancer Research. , (2018).
  10. Lewis, H., et al. miR-888 is an expressed prostatic secretions-derived microRNA that promotes prostate cell growth and migration. Cell Cycle. 13 (2), 227-239 (2014).
  11. Xu, J., et al. Evidence for a prostate cancer susceptibility locus on the X chromosome. Nature Genetics. 20 (2), 175-179 (1998).
  12. Schleutker, J., et al. A genetic epidemiological study of hereditary prostate cancer (HPC) in Finland: frequent HPCX linkage in families with late-onset disease. Clinical Cancer Research. 6 (12), 4810-4815 (2000).
  13. Farnham, J. M., Camp, N. J., Swensen, J., Tavtigian, S. V., Albright, L. A. Confirmation of the HPCX prostate cancer predisposition locus in large Utah prostate cancer pedigrees. Human Genetics. 116 (3), 179-185 (2005).
  14. Brown, W. M., et al. Hereditary prostate cancer in African American families: linkage analysis using markers that map to five candidate susceptibility loci. British Journal Of Cancer. 90 (2), 510-514 (2004).
  15. Bochum, S., et al. Confirmation of the prostate cancer susceptibility locus HPCX in a set of 104 German prostate cancer families. Prostate. 52 (1), 12-19 (2002).
  16. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
  17. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  18. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  19. . SnapGene® software (from Insightful Science; available at snapgene.com) Available from: https://www.snapgene.com (2022)
  20. . Ensembl Release 104 genome browser (from EMBL-EBI) Available from: https://www.ensembl.org (2022)
  21. Howe, K. L., et al. Ensembl 2021. Nucleic Acids Research. 49, 884-891 (2021).
  22. . miRBase: the microRNA database, Release 22.1 (from Griffiths-Jones laboratory) Available from: https://www.mirbase.org (2022)
  23. . Dharmacon CRISPR Design Tool (from Dharmacon) Available from: https://www.horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer (2022)
  24. . Off-Spotter (Venetia Pliatsika & Isidore Rigoutsos of the Jefferson Computational Medicine Center) Available from: https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/ (2022)
  25. Bao, X. R., Pan, Y., Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. Tools for experimental and computational analyses of off-target editing by programmable nucleases. Nature Protocols. 16 (1), 10-26 (2021).
  26. . Dharmacon DharmaFECT Transfection Reagent Cell Type Guide. Choose Dharmacon DharmaFECT 1, 2, 3, or 4 for optimal transfection of siRNA or miRNA reagents Available from: https://horizondiscovery.com/-/media-Files/Horizon/resources/Selection-guides/dharmafect-cell-type-guidelines.pdf (2022)
  27. Baffoe-Bonnie, A. B., et al. A major locus for hereditary prostate cancer in Finland: localization by linkage disequilibrium of a haplotype in the HPCX region. Human Genetics. 117 (4), 307-316 (2005).
  28. Zhang, R., Peng, Y., Wang, W., Su, B. Rapid evolution of an X-linked microRNA cluster in primates. Genome Research. 17 (5), 612-617 (2007).
  29. Ohnuki, Y., Marnell, M. M., Babcock, M. S., Lechner, J. F., Kaighn, M. E. Chromosomal analysis of human prostatic adenocarcinoma cell lines. Cancer Research. 40 (3), 524-534 (1980).
  30. Beheshti, B., Karaskova, J., Park, P. C., Squire, J. A., Beatty, B. G. Identification of a high frequency of chromosomal rearrangements in the centromeric regions of prostate cancer cell lines by sequential giemsa banding and spectral karyotyping. Molecular Diagnosis. 5 (1), 23-32 (2000).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

182 Cas9 microRNA miR 888

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved