JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, mikroRNA küme ağ analizi için düzenli aralıklarla aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) gen düzenleme iş akışını tanımlayan yüksek verimli bir kümelenmiş ve tek bir deneyde 35 kb kadar büyük benzersiz miRNA kümesi üyesi delesyon kombinasyonları taşıyan genetiği değiştirilmiş hücre hatlarından oluşan bir panelin hızlı bir şekilde üretilmesini sağlar.

Özet

MikroRNA'lar (miRNA'lar) kanser ve metastazın önemli hücresel düzenleyicileri (tümör baskılayıcılar, pro-onkojenik faktörler) olarak ortaya çıkmıştır. Yayınlanan çalışmaların çoğu, küçük RNA'ların kanserdeki rolünü karakterize ederken tek bir miRNA'ya odaklanmaktadır. Bununla birlikte, insan miRNA genlerinin ~% 30'u, genellikle birlikte eksprese edilen kümelenmiş birimlerde düzenlenmiştir, bu da karmaşık ve koordineli bir kodlamayan RNA düzenleme sistemini gösterir. Kodlanmamış küçük RNA'ları kliniğe çevirmeden önce kümelenmiş miRNA ağlarının tümör büyümesini, kanser saldırganlığını ve ilaç direncini düzenlemek için işbirliği içinde nasıl çalıştığının daha net bir şekilde belirtilmesi gerekir.

Prostat kanseri bağlamında ~ 35.000 bp uzunluğunda bir lokus içinde bulunan yedi miRNA geninden oluşan genomik bir kümenin onkojenik rolünü incelemek için düzenli olarak aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) aracılı gen düzenleme prosedürünün kullanılması, yüksek verimli bir kümelenmiş olarak kullanılmıştır. Bu yaklaşım için, insan kanseri hücre hatları, DOX içeren ortamda 48 saat boyunca yetiştirilen doksisiklin (DOX) ile indüklenebilir Cas9 nükleaz için bir lentivirüs vektörü ile enfekte edildi. Hücreler daha sonra, tüm miRNA kümesi delesyonunu ve bireysel veya kombinasyon miRNA gen kümesi delesyonlarını tek bir deneyde taşıyan kanser hücresi hatlarının hızlı bir şekilde üretilmesine izin vermek için genomik bölgeye özgü CRISPR RNA (crRNA) oligonükleotidleri ile komplekslenmiş sentetik trans-aktive edici CRISPR RNA (tracrRNA) ile birlikte transfekte edildi.

Bu yüksek verimli gen düzenleme sisteminin avantajları, zaman alıcı DNA vektör alt klonlamasından kaçınma yeteneği, 24 kuyucuklu bir formatta benzersiz kılavuz RNA kombinasyonları ile hücreleri transfekte etme esnekliği ve ham hücre lizatları kullanarak daha düşük maliyetli PCR genotiplemesidir. Bu kolaylaştırılmış yaklaşımı kullanan çalışmalar, insan hastalığında yer alan karmaşık küçük kodlamayan RNA ağlarının karakterize edilmesine yardımcı olacak ve gelecekteki terapötik tasarımı daha iyi bilgilendirecek olan miRNA kümesi üyeleri arasındaki fonksiyonel fazlalıkları ve sinerjik / antagonistik etkileşimleri ortaya çıkarmayı vaat etmektedir.

Giriş

Kodlamayan RNA'ların insan hastalığına katkısını araştırmak için daha iyi araştırma araçlarına ihtiyaç vardır. MiRNA disregülasyonu, kanser gibi insan bozukluklarında, kanser hastalarının dokularındaki ve vücut sıvılarındaki (örneğin, kan, idrar) bu küçük kodlamayan RNA'ların ekspresyon profillerini kanser olmayanlara, sağlıklı bireylere, mikrodizilerin kullanılmasına, kantitatif gerçek zamanlı PCR'ye (qRT-PCR) ve yeni nesil derin dizileme teknolojilerine karşı karşılaştırırken sıklıkla gözlenir 1,2 . Son zamanlarda yapılan çalışmalar, bu miRNA'ların büyük bir alt kümesini, tümör oluşumunu, hastalık progresyonunu ve ilaç direncini kontrol eden tümör baskılayıcı, onkojenik ve metastaz faktörleri olarak karakterize etmiştir. MiRNA'ların deneysel aşırı ekspresyonu ve / veya downregülasyon / kaybı, hücrede fonksiyonel ve pleiotropik sonuçlara neden olur ve bu kodlamayan RNA'ların koordine ettiği kanserle ilişkili çok çeşitli aktiviteleri yansıtır - büyüme, apoptoz, farklılaşma, kromatin yeniden şekillenmesi, anjiyogenez, mezenkimal epitel (EMT) ve MET geçişleri, metabolizma ve immün yanıt3.

MiRNA'lar tek genler olarak kodlanır veya çekirdekte transkribe edilen ve sitoplazmada lokalize olan biyolojik olarak olgunlaşmış, tek sarmallı ~ 22 nükleotid (nt) miRNA türlerini üretmeden önce kapsamlı bir şekilde işlenen genomik kümelerde bulunur4. Bu küçük RNA'lar etkilerini transkripsiyon sonrası uygularlar ve katalitik RNA kaynaklı susturma kompleksini (RISC) mRNA bölgesine getirmek için mesajcı RNA (mRNA) hedeflerine bağlanan negatif gen düzenleyicileri olarak hareket ederler, bu da mRNA bozulmasına ve / veya protein translasyonunda bir bloğa neden olur. MiRNA'lar, hayvan sistemlerinde kodlamayan RNA'ların son derece bol bir sınıfıdır ve insan genomunda 2.654 olgun miRNA bulunur (miRBaz salınımı 22.1)5. MiRNA'lar tipik olarak mRNA hedeflerine eksik tamamlayıcılık ile ilişkilidir4. Bu nedenle, tek bir miRNA onlarca ila yüzlerce farklı mRNA hedefini düzenleyebilir ve işlevsel olarak çok çeşitli biyolojik yolları etkileyebilir. MiRNA tabanlı mekanizmaların karmaşıklığına katkıda bulunmak için, tek bir mRNA çoklu, farklı miRNA'lar tarafından düzenlenebilir. Bu nedenle, miRNA disregülasyonunun vücudun homeostatik dengesini nasıl bozduğunu ve insan malignitesine nasıl yol açtığını araştırmak zordur.

Yayınlanan çalışmaların çoğu, hastalık olaylarındaki rollerini karakterize ederken tek bir miRNA'ya odaklanmıştır. Bununla birlikte, insan miRNA genlerinin ~% 30'u, genellikle aynı yönde transkripte edilen ve birlikte eksprese edilen, kodlanmamış RNA regülasyonunun koordineli ve karmaşık bir sistemini gösteren kümelenmiş birimler (tipik olarak ~ 10 kilobaz [kb]) halinde organize edilmiştir6. En büyük polisistronik insan miRNA kümesi, 54 miRNA öncülünden oluşan 14q32 kümesidir. İnsan kanserleri ile ilişkili en iyi çalışılmış kümelenmiş miRNA birimlerinden biri, kodlamayan RNA, c13orf25'in intron 3'ünde bulunan miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1 ve miR-92-1'den oluşan miR-17-92 polisistronik kümesidir. MiR-17-92 kümesi hematopoetik malignitelerde sıklıkla çoğalır ve solid tümörlerde aşırı eksprese edilir ve hücre döngüsü progresyonunu, apoptozu ve anjiyogenezi teşvik etmede onkojenik roller oluşturmuştur7. Ek olarak, kodlamayan gen Leu2'nin intronunda bulunan tümör baskılayıcı miR-15a ve miR-16-1 kümesi genellikle lösemilerde silinir ve antiapoptotik gen BCL2'yi ve ek hücre döngüsü ilerleme genleri8'i hedefleyerek tümör büyümesini bloke etmek için işlev gören çok çeşitli kanserlerde aşağı regüle edilir. Yüksek dereceli prostat kanseri olan hastalarda miR-888 kümesi yükselir ve insan kromozomu Xq27.3 9,10 üzerinde bulunan yedi miRNA geninden (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b ve -891a) oluşur.

MiR-888 kümesi, HPCX1 lokusu (Kalıtsal Prostat Kanseri, X'e bağlı 1) içinde, kalıtsal prostat kanseri ailesi soyağacı 11,12,13,14,15,29'un bağlantı analizi ile tanımlanan Xq27-2'yi kapsayan haritalardır. Geleneksel miRNA yanlış ekspresyon araçları (miRNA taklitleri ve antisens inhibitörleri) kullanılarak bireysel miR-888 kümelenmiş üyelerinin fonksiyonel karakterizasyonu, bu miRNA'ların prostat tümörü büyümesini ve invazyonunu düzenlemede örtüşen roller oynadığını göstermiştir 9,10. Bununla birlikte, bu deneysel yöntemler, çoklu miR-888 kümelenmiş üyelerinin, doku homeostazını ve kanser ilerlemesini kontrol etmek için kodlamayan bir RNA ağında sinerjik veya antagonistik olarak nasıl hareket ettiğini incelemek için kendilerini kolayca ödünç vermez. Yüksek verimli CRISPR gen düzenleme teknolojisini kullanan bu tarif edilen kolaylaştırılmış protokol, bu bilgi boşluğunu kapatmak için insan kanserleriyle ilişkili miRNA kümelerini (örneğin, miR-888 kümesi) moleküler olarak diseke etmek için modifiye edilmiştir.

Bakteriyel CRISPR ve CRISPR ile ilişkili (cas) genler, bakteriyofajlara karşı adaptif bağışıklığa aracılık eder16. Bu eski prokaryotik gözetim sisteminin keşfi, istenen herhangi bir genomik lokusu kolayca hedeflemek ve hem in vitro hem de in vivo16,17 çok çeşitli hayvan sistemleri ve hücre tipleri içinde DNA dizisi değişiklikleri yapmak için etkili bir bilimsel araç olarak hızla uyarlandı. Bu teknik, insan hastalığı bağlamında miRNA ağlarını sorgulamak için etkili bir yöntem olarak büyük umut vaat ediyor. Bu amaçla, ölümsüzleştirilmiş insan prostat kanseri hücre hatlarında (LNCaP, PC3-ML) insan kromozomu X üzerinde ~ 35 kb'yi kapsayan miR-888 kümesini incelemek için bu yüksek verimli CRISPR gen düzenleme protokolü, küme üyelerinin kanser ilerleme yollarını nasıl koordine ettiğini sorgulamak için inşa edilmiştir. Bu yaklaşım, herhangi bir miRNA kümesini karakterize etmek için uygulanabilir ve araştırmacıların tüm miRNA kümesi delesyonunu ve bireysel ve kombinasyon miRNA gen kümesi delesyonlarını tek bir deneyde taşıyan insan hücre hatlarını hızla üretmelerini sağlar.

Bu prosedürde, araştırmacının Streptococcus pyogenes CRISPR ile ilişkili endonükleaz Cas9 (csn1) gen ekspresyonunu kurucu DOX ile indüklenebilir promotör TRE3G aracılığıyla kontrol etmesini sağlayan bir doksisiklin (DOX) ile indüklenebilir lentiviral ekspresyon sistemi taşıyan stabil hücre hatları kurulur. Tet-On 3G iki parçalı sistemi, hem Tet-On 3G geninin hem de blastistronic direnç geninin (BlastR) transkripsiyonunu sağlamak için kurucu bir insan uzama faktörü 1 alfa (hEF1alfa) promotörünü içerir. Tet-On 3G transaktivatör proteini sadece DOX varlığında TRE3G promotörüne bağlanır ve sağlam Cas9 transkripsiyonu ile sonuçlanır. DOX'un yokluğunda, bazal Cas9 ifadesi yoktur veya çok azdır. Bu nedenle, araştırmacı, CRISPR gen düzenleme adımları sırasında DOX ile desteklenmiş ortamda yetiştirilen hücrelerde yüksek Cas9 protein üretimini indükleyebilir ve DOX çekilmesi üzerine hızlı CAS9 protein klirensini kontrol edebilir.

Bu protokol aynı zamanda tüm miRNA kümesini çevreleyen bölgeleri, bireysel miRNA saç tokası (premiRNA) bölgelerini ve / veya küme içindeki miRNA genlerinin alt kümelerini hedefleyen sentetik CRISPR RNA (crRNA) oligonükleotidlerinin tasarımını da tanımlar. Tasarlanan her crRNA, benzersiz bir 5'-terminal 20 nt kılavuz dizisi (hedeflenecek genomik ilgi dizisinin tamamlayıcısı), ardından evrensel trans-aktive edici CRISPR RNA (tracrRNA) oligonükleotidleri18 ile baz eşleşmesini sağlayan değişmez bir 22 nt S. pyogenes tekrar dizisi (5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3') içerir. Birlikte, tavlanmış crRNA ve tracrRNA (karışık 1: 1 oranı) bu protokol için kılavuz RNA olarak işlev görür (Şekil 1A). Her deneyde, iki sentetik kılavuz RNA, bakteriyel Cas9 proteinini, çıkarılması hedeflenen miRNA küme bölgesini çevreleyen genomik DNA bölgelerine (5' ve 3') ilişkilendirmek ve eşlik etmek için DOX ile indüklenen hücrelere dönüştürülür (Şekil 1B).

Hücre genomunda bir protospacer bitişik motif (PAM) dizisi (vahşi tip S. pyogenes Cas9 için 5'-NGG-3') bulunmalı ve kılavuz RNA17 tarafından hedeflenen 20 nt DNA dizisinin hemen bitişiğinde bulunmalıdır. PAM dizisi bağlayıcı bir sinyal görevi görür ve endonükleaz Cas9 enziminin katalitik bölgesini hedeflenen genomik DNA bölgesine konumlandırır, daha sonra PAM'ın ~ 3 nt yukarı yönünde bulunan yönlendirilmiş, çift sarmallı (ds) DNA bölünmesine yol açar. Hücrenin DNA onarım makinesi, parçalanmış DNA uçlarını onarır, bu da mükemmel ligasyonla sonuçlanabilir, ancak genellikle homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) meydana gelir ve onarım bölgesinde küçük eklemelere veya silmelere (indels) neden olur. MiRNA'lar genellikle intergenik ve intronik bölgelerde bulunan kodlamayan genler olduğundan, bu indeller istenmeyen saçmalık / yanlış mutasyonlar yaratma riski düşüktür.

Bu deneylerde kılavuz RNA kompleksi için sentetik RNA oligonükleotidleri (tavlanmış crRNA ve tracrRNA, 1: 1 molar oran) kodlayarak, bu gen nakavt stratejisi, zaman alıcı DNA vektör alt klonlamasını önler ve benzersiz kılavuz RNA kombinasyonlarını hücrelere 24 kuyucuklu bir formatta transfekte etmede büyük esneklik sağlar. PCR genotip taraması için ham hücre lizatlarının hazırlanması, pahalı ve zaman alıcı DNA saflaştırma yöntemlerinden de kaçınırken, kolaylaştırılmış tek koloni hücre hattı üretimi ve fenotipik analize izin verir. Gerçekten de, bu yüksek verimli CRISPR gen düzenleme protokolü, kültürlenmiş prostat kanseri hücre hatlarını (LNCaP, PC3-ML) tek bir deneyde 32 benzersiz kılavuz RNA kombinasyonu ile transfekte etmek ve tüm ~ 35 kb miR-888 küme bölgesi için delesyon taşıyan nakavt hatları üretmek için başarıyla kullanılmıştır; miR-743 ve miR-891a ailelerine ait miR-888 küme üyeleri için daha küçük delesyon kombinasyonları; miR-888 kümesi içindeki bireysel miRNA üyeleri için delesyonların yanı sıra. Bunun gibi çalışmalar, kümelenmiş miRNA'ların, miRNA'ları kliniğe terapötik ve tanısal araçlar olarak çevirmeden önce tümör büyümesini, saldırganlığını ve ilaç direncini düzenlemek için işbirliği içinde nasıl işlev gördüğünün daha net bir şekilde belirtilmesini sağlayacaktır.

Protokol

1. CRISPR gen düzenlemesi için hazırlık ve miRNA kümesi nakavt hücre hatları oluşturmak için kılavuz RNA tasarımı

  1. Bir DNA dizisi ek açıklama yazılımı programı19 kullanarak, ilgilenilen miRNA küme bölgesinin (intergenik, intronik) ve çevredeki genomik bölgelerin en az 1 kB'sinin tam genomik dizisini içeren bir DNA dosyası oluşturun.
    1. Hedeflenen miRNA kümesi lokusunu (intergenik, intronik) ve miRNA kümesine ait her bir miRNA saç tokası dizisini işaretlemek ve ayrıca yakındaki diğer kodlama ve kodlamayan genleri ve / veya düzenleyici özellikleri belirtmek için oluşturulan DNA dosyasında bir özellik düzenleme aracı kullanın 5,20,21,22.
    2. Delesyon için hedeflenen miRNA bölgelerinin, yakındaki protein kodlayan genleri, kodlamayan genleri veya önemli düzenleyici DNA elementlerini yanlışlıkla bozmadığından emin olun.
      NOT: Bu protokolde kullanılan hücre hattının genomik karmaşıklığını (örneğin, kromozom duplikasyonları / füzyonları) göz önünde bulundurun.
  2. Tüm miRNA kümesini, bireysel miRNA saç tokası (pre-miRNA) bölgelerini ve / veya küme içindeki miRNA genlerinin alt kümelerini çevreleyen 20 nt genomik DNA dizisini hedefleyen sentetik crRNA'ları, biyoinformatik kılavuz RNA tasarım yazılımı aracını kullanarak tasarlayın (örneğin;23). Uygun Cas9 enziminin kılavuz RNA tasarım aracında belirtildiğinden emin olun (örneğin, S. pyogenes Cas9).
    NOT: Sentezlenen crRNA, bu benzersiz 5'-terminal 20 nt kılavuz dizisini (DNA hedefine tamamlayıcı) ve ardından bir değişmez 22 nt içerecektir. S. pyogenes sentezlenmiş evrensel tracrRNA oligonükleotid ile baz eşleşmesine izin vermek için tekrar sekansı. Birlikte tavlandıklarında, bu protokolde kılavuz RNA olarak işlev görecekler.
    1. Oluşturulan DNA dosyasına atıfta bulunarak (Adım 1.1.), biyoinformatik kılavuz RNA tasarım yazılımı aracı 23'e silinmek üzere hedeflenen miRNA saç tokası / küme lokusunun hemen yukarı akımında (5') veya aşağı akışında (3') bulunan ~ 150 nt DNA dizisini girin.
      NOT: Tasarım aracı, PAM dizisine (hedeflenmemiş DNA ipliği üzerinde) hemen bitişik olarak bulunan crRNA oligonükleotid tasarımı için benzersiz 20 nt'lik dizileri tanımlayacaktır (örneğin, S. pyogenes Cas9 PAM dizisi NGG). Aşağıda verilen bir crRNA tasarım örneği, mir-891a gen lokusunun hemen yukarı akışını (5') hedefleyen bir bölgeyi (özellikle temsili sonuçlar bölümünde ve Tablo 1'de tartışılan 5A (891a) 'dir.
      1. RNA tasarım yazılımı aracı23 kılavuzunu açın.
      2. Adı Gir penceresine 5A(891a) adını girin .
      3. Bir DNA dizisi girin penceresinde, mir-891a öncü geninin hemen yukarı akımında (5') bulunan 150 nt genomik dizi girin:5'-AAGAAAATATACATGCTGATAGTTACACAGG
        TTGTGAATAGTAAATTAGTATGTCATTTATTT
        TAGGTATTCAATGTTGCATAGTCATATTATA
        ATTACGTAGCTTCTTTTTTTTTTTGTTTTTTTAGGTT
        CCCAAAGAGTCTACAAATGTTGTCT-3'
      4. Program tarafından hesaplamalı olarak algılanan hedefleme dışı siteleri hariç tutmak için Özgüllük Denetimini Etkinleştir işaretli kutuyu işaretleyin. Uygun organizmayı seçin (yani, İnsan [Homo sapiens]).
      5. Çalışmalar için kullanılan doğru Cas9 enzimi PAM'ı belirtin, bu durumda, Streptococcus pyogenes Cas9-PAM: NGG, aşağıdaki varsayılan ayarları oluşturmak için: Hedefe göre PAM: Sonra; Tekrarlama Sekansı: GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG; Kılavuza göre: 3; Hedef dizi uzunluğu: 20; Hedef 5' başlangıcına göre kesinti: Sense 17 Anti-sense 17.
      6. Sentetik crRNA sentezi sonuçlarını görüntülemek için İleri düğmesine tıklayın.
        NOT: Bu örnekte, sentezlenecek önerilen crRNA, DNA hedefi ATACATGCTGATAGTTACAC'ı tanıyacak ve PAM:AGG'ye bitişik olarak yerleştirilecektir.
    2. Silinecek miRNA lokusuna en yakın bulunan ve amaçlanan genomik hedef için en yüksek özgüllüğe sahip en iyi aday crRNA 20 nt hedef dizilerini belirlemek için DNA dosyasına (Adım 1.1'de oluşturulan) başvurun.
      1. Aday crRNA spesifikliğini değerlendirmek ve hedeflenen miRNA kümesi bölgesi ile ilgisi olmayan genomik lokuslardaki potansiyel hedefleme dışı bölgeleri tahmin etmek için hesaplamalı hedefleme dışı analiz araçlarını kullanın (örneğin, 24,25,26,27).
      2. Tek kolonili CRISPR klonal hücre hatlarını PCR ile genotiplendirirken daha sonra başvurmak üzere potansiyel hedefleme dışı sonuçları kaydedin (Adım 4.2.6.).
        NOT: Tasarlanan crRNA oligonükleotid ile genomik hedef dizisi arasında paylaşılan dizi tamamlayıcılığının derecesi, Cas9 enziminin genomu bu lokusta ne kadar seçici bir şekilde böldüğünü belirleyecektir. Kılavuz RNA, genomik hedefe 3' ila 5' yönde tavlandığından, DNA hedef dizisinin 5' ucundaki uyumsuzluklar (ilk 8-10 baz) genellikle Cas9 aracılı bölünmeyi bloke edecektir. Genomik hedef dizi, DNA dizisinin ilk sekiz baz dışında, homolojiyi başka bir genomik lokusla paylaşıyorsa, bu kılavuz RNA'nın bu bölgede hedefleme dışı kalma şansının düşük olduğu tahmin edilmektedir.
      3. Hedeflenen her miRNA lokusu için dört benzersiz crRNA tasarlayın: miRNA saç tokası / kümesinin (5'A, 5'B) hemen 5' 'ini tamamlayıcı DNA dizilerini hedeflemek için iki tasarlanmış crRNA ve miRNA saç tokası / kümesinin (3'A, 3'B) hemen 3' 'ünü tamamlayıcı DNA dizilerini hedeflemek için iki tasarlanmış crRNA.
        NOT: CRISPR transfeksiyonları gerçekleştirilirken (Bölüm 3'te), tek bir deneyde başarılı miRNA lokus delesyonları üretme olasılığını artırmak için hedeflenen her miRNA lokusu için dört olası 5' ve 3' kılavuz RNA çifti kombinasyonu (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'B) test edilecektir.
      4. Sentezlenecek her bir crRNA için DNA hedef dizisini (bitişik PAM ile) işaretlemek için oluşturulan DNA dosyasında (Adım 1.1.) bir özellik düzenleme aracı kullanın.
  3. CRISPR hücre çizgilerini genotiplemek için hedeflenen miRNA küme bölgelerini çevreleyen PCR primerlerini (ileri, geri) tasarlayın ve sentezleyin (ve oluşturulan DNA dosyasındaki primerleri etiketleyin).
    1. Yakından kümelenmiş veya bireysel miRNA'lar için küçük genomik delesyonlar taşıyan genotipleme hücre hatları için, Cas9 bölünme bölgesi / nakavt bölgesinin her iki tarafında yaklaşık 150 bp bulunan PCR primerlerini (ileri, geri) tasarlayın, bu da jel elektroforezi yoluyla tek bir PCR reaksiyonunda hem vahşi tip (~ 600 bp) hem de nakavt (~ 300 bp) DNA fragmanlarının tespit edilmesini sağlayacaktır.
    2. MiRNA öncü kombinasyonları veya tüm miRNA kümesi için büyük genomik delesyonlar taşıyan genotipleme hücre hatları için, yine Cas9 bölünme / nakavt bölgesinin her iki tarafında yaklaşık 150 bp bulunan PCR primerlerini (ileri, geri) tasarlayın. Hedeflenen miRNA kümesi delesyonunun >4 kb uzunluğunda olması durumunda, PCR reaksiyonunun muhtemelen yalnızca daha küçük (~ 300 bp) nakavt DNA fragmanını tespit edeceğini, ancak vahşi tip DNA fragmanını tespit etmeyeceğini unutmayın. Bu nedenle, tarama sürecine yardımcı olmak ve homozigot nakavt hücre hatlarını doğrulamak için dahili miRNA küme genlerinin varlığını veya yokluğunu tespit edebilen ek PCR primerleri (ileri, geri) tasarlayın.

2. DOX ile indüklenebilir Cas9 ekspresyon kasetini taşıyan stabil lentiviral hücre hatlarının oluşturulması

NOT: Tüm hücre kültürü ve virüs çalışmalarını BSL2 prosedürleri ve aseptik tekniği kullanarak sertifikalı bir biyogüvenlik başlığında gerçekleştirin.

  1. CRISPR çalışmaları ve tercih edilen büyüme ortamları için uygun hücre hattı tipini belirleyin.
    NOT: Bu protokol, insan prostat kanseri hücre hatları LNCaP (tercih edilen ortam: RPMI,% 10 fetal sığır serumu [FBS]) ve PC3-ML (tercih edilen ortam: DMEM,% 10 FBS) için geliştirilmiştir.
  2. Blascidin direnç gen kasetini taşıyan lentivirüs ile enfekte olmuş hücreler için seçilecek en uygun ilaç konsantrasyonunu belirlemek için bir blasticidin "ölüm" eğrisi uygulayın (Adım 2.3.).
    1. Plaka hücreleri, 24 delikli bir plakanın 11 kuyucuğuna dönüşür ve 37 ° C'de, tercih edilen ortamda% 5 CO2'de yaklaşık% 75 birleşene kadar büyür.
    2. Blasticidin'i (çalışma stoğu 1 mg / mL) tercih edilen ortamda 0, 1, ila 10 μg / mL arasında değişen bir son konsantrasyonla seyreltin ve 1 μg / mL'lik artışlarla seyreltin.
    3. Tohumlanmış 24 kuyucuklu plakanın kuyularını 1'den 11'e kadar etiketleyin. Büyüme ortamını kuyucuklardan çıkarın ve uygun blastisidin konsantrasyonları ile değiştirin.
    4. Ortamı 7-10 gün boyunca her gün uygun blastisidin konsantrasyonları ile değiştirin.
    5. Zaman boyunca hücreleri günlük olarak inceleyin ve 5-7 gün içinde tüm hücreleri öldürmek için gereken minimum blastisidin konsantrasyonunu belirleyin.
      NOT: CRISPR gen düzenleme deneyleri için kullanılan her bir spesifik hücre hattı için bir blasticidin "öldürme" eğrisinin yapılması gerekecektir.
  3. DOX ile indüklenebilir Cas9 ekspresyon kasetini taşıyan hücreleri lentivirüs ile enfekte edin ve Adım 2.2'de belirlenen optimum konsantrasyonu kullanarak blastisidin seçimi yapın.
    1. 6 kuyucuklu bir plakanın üç kuyusunda, kuyu başına 5 × 104 hücre tohumu ve 37 ° C'de tercih edilen ortamda, gece boyunca% 5 CO2 (AÇIK) büyür.
    2. Ertesi gün, buz üzerinde DOX ile indüklenebilir Cas9 (Lenti-iCas9) için lentivirüs ekspresyon vektörünü çözün. Yavaşça karıştırın (virüs parçacıklarını vortekse etmeyin).
      NOT: Viral titreleri ve enfeksiyon verimliliğini azaltacak çoklu donma/çözülme döngülerinden kaçınmak için lentivirüsü -80 °C'de alikotlarda saklayın.
    3. Viral titre konsantrasyonuna bağlı olarak 5 × 104 hücreyi virüslü 0.3 (MOI = 0.3) enfeksiyon çokluğunda dönüştürmek için gereken hacmi hesaplayın.
    4. Pipet uygun virüs hacmini 250 μL'ye (kuyucuk başına) serumsuz ve antibiyotik içermeyen tercih edilen ortama 0.8 μg / mL hekzadimetrin bromür ile desteklenir. Yavaşça karıştırın.
      NOT: Hekzadimetrin bromür, viral adsorpsiyonu ve enfeksiyon etkinliğini arttırdığı tespit edilen katyonik bir polimerdir.
    5. Ortamı çıkarın. Lenti-iCas9 virüsü (MOI = 0.3) ile hazırlanan 250 μL'lik transdüksiyon ortamını hücrelere ekleyin ve 37 ° C'de,% 5 CO2'de AÇIK inkübe edin. (Hücreler virüsle ilişkili toksik etkiler gösteriyorsa kuluçka süresini 4-6 saate kadar kısaltın.)
    6. Ortamı taze tercih edilen ortamla değiştirin ve hücrelerin 1-2 gün boyunca iyileşmesine izin verin.
    7. Adım 2.2'de açıklanan "öldürme" eğrisinden türetilen optimal blastisidin konsantrasyonunu kullanarak enfekte olmuş hücreler üzerinde 10-14 gün boyunca blastisidin seçimi yapın.
      1. Paralel olarak, enfekte olmamış hücreleri, viral seleksiyon için pozitif bir kontrol olarak kullanılacak optimal blastisidin konsantrasyonu ile ortamda büyütün.
    8. Ölü hücreleri çıkarmak için seçim süresi boyunca her 3 günde bir optimal blasticidin konsantrasyonu ile desteklenen ortamı değiştirin.
      NOT: Sadece blastisidin seçiminden kurtulan hücreler lentiviral vektörü entegre etmiş olacaktır.
    9. Blastisidin tarafından seçilen Lenti-iCas9 hücre hatlarını genişletin.
      NOT: Her genişletme üzerine hücre geçiş numarasını kaydedin.
      1. Lenti-iCas9 hücrelerinin bir kısmını, uzun süreli kriyovyal depolama için% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) ile desteklenmiş tercih edilen ortamda dondurun.
      2. En sağlam DOX ile indüklenebilen Cas9 protein seviyelerini sergileyen hücre hattını tanımlamak için Lenti-iCas9 hücrelerinin bir kısmını batı leke 9 ile analiz edin (bkz. Adım 2.3.).
  4. Cas9 protein indüksiyonu için en uygun koşulları belirlemek üzere yeni kurulan Lenti-iCas9 hücre hatları üzerinde bir doksisiklin konsantrasyon eğrisi gerçekleştirin.
    1. Bu DOX konsantrasyon süresi seyrini gerçekleştirmek için test edilen her hücre hattı için dört bağımsız 6 delikli plaka ayarlayın. Plaka 5, her 6 delikli plakanın kuyusu başına 104 hücre × ve 37 ° C'de,24 saat boyunca tercih edilen ortamda% 5 CO 2'de büyür.
    2. DOX (çalışma stoğu 1 mg/mL) tercih edilen ortamda, 0, 50, 100, 150, 250 ila 500 ng/mL arasında değişen son DOX konsantrasyon eğrisi ile seyreltin.
    3. Her tohumlanmış 6 kuyucuklu plakanın kuyularını 1'den 6'ya kadar etiketleyin. Ortamı çıkarın ve uygun DOX konsantrasyonlarıyla değiştirin. Aşağıdaki zaman noktalarına kadar plakaları 1-4 büyütün: 24 saat, 48 saat ve 72 saat DOX indüksiyonu; ve 120 saat DOX çekilmesinden sonra (başlangıçta 72 saat DOX kaynaklı).
    4. Plakanın kuyularını her zaman noktasında uygun yöntemler (örneğin, tripsinizasyon) kullanarak hasat edin. Hücre peletlerini -80 °C'de saklayın. Lizin izolasyonu ve Cas9 batı leke analizi için hücre peletlerini RIPA tamponunda işleyin.
      1. DOX-indüksiyon süresi kursunun her örneği için% 4-12 Bis-Tris jeli kullanarak 40 μg hücre lizatı çalıştırın ve proteinleri bir immünoblot membranına aktarın.
      2. 160 kDa proteinini tespit etmek için immünoblot membranını Cas9'a karşı birincil bir antikor ile hibridize edin. GAPDH (37 kDa) gibi bir temizlik geni kullanarak Cas9 seviyelerini normalleştirin.
    5. Batı lekesi sonuçlarına dayanarak, Lenti-iCas9 hücre hatlarında Cas9'u indüklemek için en uygun DOX konsantrasyonunu belirleyin.
      NOT: Bu seferki kurs, DOX çıkarıldıktan sonra 120 saat sonra Cas9 ifadesinin ne kadar sıkı bir şekilde düzenlendiğini de ortaya koyacaktır.
    6. CRISPR transfeksiyonlarını optimize etmek için sağlam Cas9 protein ekspresyonu gösteren Lenti-iCas9 hücre hatları için tek hücreli koloniler oluşturun (Bölüm 3'te).

3. Cas9 indüksiyonu ve yüksek verimli bir format kullanarak hücrelerin sentetik kılavuz RNA transfeksiyonu ile CRISPR reaksiyonlarının gerçekleştirilmesi

NOT: Bir iş akışı diyagramı Şekil 1'de gösterilmiştir.

  1. Kağıt üzerinde, tüm miRNA kümesini, çeşitli kümelenmiş miRNA gen kombinasyonlarını ve ayrıca bireysel miRNA kümesi üyelerini hedef alan 24 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna aktarılacak crRNA çifti kombinasyonlarını haritalandırın.
    1. Haritada, hedeflenen miRNA lokusu başına dört kuyuyu etiketleyin. Her kuyunun bir transfeksiyon reaksiyonunu temsil etmesini sağlayın, istenen miRNA nakavt genomik lokusunun 5' ve 3' konumlandırılmış iki benzersiz crRNA'sı ve tracrRNA (tavlanmış 1: 1 molar oranı).
    2. Etiketlenmiş dört kuyucuğun her birinin transfeksiyon için benzersiz bir crRNA çiftini temsil ettiğinden emin olun (örneğin; 5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B).
      NOT: Her hedeflenen miRNA lokusunu çevreleyen iki adet 5' crRNA ve iki adet 3' crRNA'nın tasarımı (Bölüm 1), transfeksiyon reaksiyonunda dört olası 5' ve 3' kılavuz RNA çiftinin üretilmesini sağlar.
  2. Lenti-iCas9 hücre hattını, optimize edilmiş DOX konsantrasyonunu içeren tercih edilen ortamda24 delikli bir plakanın 5 x 10 4 hücre/kuyusunda plakalayın (Adım 2.4'te belirlenir). Cas9 protein ekspresyonunu indüklemek için hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2'de 24-48 saat büyütün.
  3. Lenti-iCas9 hücrelerini hazırlanan 5' ve 3' kılavuz RNA'larla transfekte edin.
    1. Sentezlenmiş crRNA ve tracrRNA oligonükleotidleri nükleaz içermeyen su ile 10 μM'lik bir stok konsantrasyonuna yeniden oluşturun.
    2. Adım 3.1.'de tasarlanan deneysel haritaya dayanarak, hedeflenen miRNA lokusu başına dört adet 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünü etiketleyin ve dört olası 5' ve 3' crRNA çifti kombinasyonunu (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'B) temsil edin.
    3. Her tüpte, aşağıdaki reaksiyonu (10 μL'lik son hacim) kullanarak 2 μM kılavuz RNA kompleksini oluşturmak için 1: 1 molar tracrRNA oranını ve benzersiz crRNA'ları (5' ve 3') karıştırın:
      1. 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne 2,5 μL tracrRNA (10 μM stok), 5' konumlandırılmış crRNA'nın 1,25 μL'si (10 μM stok), 1,25 μL ve 10 mM TRIS-HCL pH 7,5 μL'lik 5 μL ekleyin. Karıştırmak için 16.000 × g'da 30 s için mikrosantrifüj. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) inkübe edin.
    4. Her tüpe, 10 μL kılavuz RNA kompleks reaksiyonuna (toplam 50 μL hacim) 40 μL indirgenmiş serum ortamı (örneğin, Opti-MEM) ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetle çekerek hafifçe karıştırın.
    5. Temiz bir 1,5 mL'lik santrifüj tüpünde, 2 μL transfeksiyon reaktifi 28 (bakınız NOT 3.3.5.1.) ve48 μL indirgenmiş serum ortamı (örneğin, Opti-MEM, son hacim 50 μL) yukarı ve aşağı pipetleyerek, yavaşça karıştırın. RT'de 5 dakika boyunca kuluçkaya yatın.
      1. Reaktifi (2 μL) ve azaltılmış serum ortamı (örneğin, Opti-MEM, 48 μL) miktarlarını, transfekte edilecek kuyu sayısına ve ayrıca hafif pipetleme yanlışlıklarını hesaba katmak için %10 ekstra hacme çarparak transfeksiyon reaktifinin ana karışımını hazırlayın.
        NOT: Küçük RNA ve CRISPR RNA oligonükleotid transfeksiyonlarının yanı sıra hücre hattı tip28 için optimize edilmiş bir transfeksiyon reaktifi seçin.
    6. 50 μL kılavuz RNA karışımını içeren her tüpe (Adım 3.3.4.'ten), seyreltilmiş transfeksiyon reaktifinin 50 μL'sini ekleyin (Adım 3.3.5'ten). Pipet karışımı karıştırmak için yavaşça yukarı ve aşağı bir kez. RT'de 20 dakika boyunca inkübe edin.
    7. Kılavuz RNA / transfeksiyon karışımının 100 μL'sini içeren her tüpe DOX (optimal konsantrasyon) ile desteklenmiş 400 μL antibiyotiksiz ortam ekleyin. Pipet hafifçe karıştırmak için.
  4. Ortamı DOX kaynaklı Lenti-iCas9 hücrelerinden çıkarın (Adım 3.2.). 24 delikli plaka deney haritasına dayanarak 500 μL medya/DOX/kılavuz RNA/transfeksiyon karışımı ekleyin (Adım 3.1.). Transfekte hücreleri 37 ° C'de 48 saat boyunca,% 5 CO2 inkübe edin.
  5. Ortamı DOX içermeyen taze tercih edilen ortamla değiştirin (Cas9 proteinini hücrelerden temizlemek için). Hücrelerin 37 ° C'de 24-48 saat daha iyileşmesine izin verin,% 5 CO2.
  6. Transfekte hücreleri toplayın (tripsinizasyon) ve genotipleme ve tek hücreli seyreltmeler için hazırlanın.
    NOT: Hücreler, transfekte CRISPR geni düzenlenmiş ve transfekte edilmemiş vahşi tip hücreler içeren karışık bir popülasyonu temsil eder. Bu adım, tek hücreli koloni genişlemesine zaman / kaynak yatırmadan önce CRISPR düzenlemesinin verimliliğini belirleyecektir.
    1. Hücreleri 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile 1x yıkayın. Hücreleri 37 ° C'de 5 dakika boyunca 100 μL tripsin içinde,% 5 CO2 inkübe edin ve hücreleri 1 mL ortam içeren temiz bir 1.5 mL santrifüj tüpüne aktarın.
    2. Hücreleri karıştırmak ve 20 ° C'de 200 × g'de 5 dakika boyunca mikrosantrifüj yapmak için ters çevirin. Ortamı çıkarın ve hücre peletini 1 mL PBS içinde yeniden askıya alın.
    3. Yıkanmış hücreleri 200 °C'de 5 dakika × g mikrosantrifüj edin. PBS'yi çıkarın ve hücre peletini tercih edilen ortamın 150 μL'sinde yeniden askıya alın.
  7. Bir hemositometre veya otomatik hücre sayma cihazı kullanarak 150 μL yeniden askıya alınmış hücrelerin mikrolitresi başına hücre sayısını belirleyin.
  8. 150 μL yeniden askıya alınmış hücreleri üç parçaya ayırın.
    1. Transfekte hücrelerin 1/3'ünü (50 μL) orta düzeyde artı %10 DMSO'da (150 μL'lik son hacim) gelecekteki genişleme/uzun süreli depolama için kriyovyallerde dondurun.
    2. Transfekte hücrelerin 1/3'ünü (50 μL) genotipleme için temiz bir 0.2 mL PCR tüpüne aktarın.
      1. Hücreleri 4 ° C'de 200 × g'da 5 dakika boyunca mikrosantrifüj yapın ve ortamı çıkarın.
      2. Hücre peletini 100 μL PBS'de yeniden askıya alın.
      3. Hücreleri 4 ° C'de 200 × g'da 5 dakika boyunca mikrosantrifüj yapın ve PBS'yi çıkarın. Karışık popülasyonlu hücre peletlerini -80 °C'de uzun süreli depolayın.
      4. Bölüm 4'teki iş akışını kullanarak genotipleme için hücre peletini işleyin.
    3. Tek hücreli koloniler oluşturmak için hücrelerin son 1 / 3'ünü (50 μL) seyreltme ve kaplama için 96 delikli bir plaka formatında hazırlayın.
      1. Adım 3.7.'deki hücre sayısına dayanarak, 96 delikli bir plakanın kuyucuğu başına 100 μL ortamda 10, 5, 2 ve 1 hücre (ler) elde etmek için gereken seyreltmeleri hesaplayın.
      2. 12 kanallı çok kanallı bir pipettör ve steril bir reaktif rezervuarı kullanarak, her seyreltme için plakanın iki sırasına (toplam 24 kuyu) kuyu başına 100 μL seyreltilmiş hücre ekleyin (kuyu başına 10, 5, 2 veya 1 hücre). Hücrelerin tek hücreli koloni genişlemesi için akıcılığa büyümesi için 4-6 hafta bekleyin. Hücreleri haftalık olarak bir ışık mikroskobu altında gözlemleyin ve kolonilerin tek veya çok hücreli kolonileri temsil edip etmediğini not edin.
      3. Genotipleme için ~ 10-15 tek hücreli koloni toplayın (Bölüm 4). Hedeflenen her miRNA lokusu için en az üç bağımsız, nakavt, tek hücreli koloni hattı tanımlayın. Vahşi tipteki tek hücreli satırları denetim olarak saklayın.
        NOT: Tarama sayısı, hücre hattı tipine ve miRNA nakavt fenotipinin hücre büyümesi / canlılığı üzerindeki etkisine bağlı olacaktır.

4. Ham hücre lizatları kullanılarak CRISPR hücre hatlarının PCR genotiplemesi

  1. 96 kuyucuklu bir plakanın neredeyse birleşimli kuyularından bireysel, tek hücreli kolonileri hasat edin.
    NOT: Bu adımlarda açıklanan ortam/PBS'nin uzaklaştırılması, biyogüvenlik kabinindeki bir vakum aspiratörü kullanılarak manuel olarak gerçekleştirilebilir, ancak çapraz kontaminasyonu önlemek için dikkatli olun. Aspirasyon sırasında 96 delikli plakanın her bir kuyucuğu için yeni bir steril "sarı" 200 μL pipetman ucu kullanın, burada değiştirilen her sarı uç, vakum aspiratörüne bağlı steril bir cam mera pipetinin sonuna sıkıca yerleştirilir.
    1. Kuyucukları 100 μL PBS ile 1x yıkayın. PBS'yi aspire edin.
    2. 50 μL tripsin ekleyin ve 37 ° C'de,% 5 CO 2'de2-5 dakika inkübe edin.
    3. Yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin ve yeniden askıya alınan hücreleri 1 mL ortam içeren 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
    4. Hücreleri karıştırmak için ters çevirin ve 20 ° C'de 200 × g'de 5 dakika boyunca bir mikrosantrifüjde hafifçe peletleyin.
    5. Ortamı çıkarın ve 1 mL PBS ekleyin. Pelet bozmak için tüpe hafifçe hafifçe vurun ve karıştırmak için birkaç kez ters çevirin.
    6. Hücreleri peletlemek için 200 × g'de 20 °C'de 5 dakika boyunca mikrosantrifüj yapın.
    7. PBS'yi çıkarın ve peleti 300 μL taze PBS içinde yeniden askıya alın.
    8. 300 μL numuneyi iki parçaya bölün.
      1. Hücrelerin 200 μL'sini (peletin 2 / 3'ü), tercih edilen ortamın 1 mL'sini içeren 24 delikli bir plakanın kuyucuğuna aktarın. Genotip doğrulandıktan sonra, fonksiyonel analiz için CRISPR aracılı nakavt hücre hatlarını genişletmek için bu hücreleri kullanın.
      2. Hücrelerin 100 μL'sini (peletin 1 / 3'ü) 0.2 mL'lik bir PCR tüpüne aktarın. 4 °C'de 3.000 x g'de 5 dakika boyunca mikrosantrifüj. PBS'yi kaldırın. Peleti -80 °C'de saklayın.
  2. Adım 1.3'te tasarlanan PCR primerlerini kullanarak genotipleme ve dizi analizi için ham hücre lizatları hazırlayın. Transfekte edilmemiş hücrelerden hazırlanan hücre lizatlarını, vahşi tip pozitif kontroller olarak kullanmak üzere bu deneylere dahil edin.
    1. Hücre peletini 4 μL 5x DNA polimeraz tamponunda ( Malzeme Tablosuna bakınız, son konsantrasyon 1x), 1 μL Proteinaz K (20 ng / mL stok), 1 μL RNaz A (10 ng / mL stok) ve toplam 20 μL hacme kadar nükleaz içermeyen suda yeniden askıya alın.
    2. Bir PCR programı kullanarak bir termosikler içindeki hücreleri lize edin: 30 dakika boyunca 56 °C ve 5 dakika için 96 °C. Hücre lizatlarını -20 °C'de saklayın.
    3. Kılavuz RNA 5' ve 3' kılavuz RNA hedeflenen bölgeleri çevreleyen tasarlanmış PCR primerlerini (ileri, geri) kullanarak bir PCR reaksiyonu gerçekleştirin (Tablo 1).
      NOT: DNA polimeraz tamponu ve termosikler koşulları, PCR reaksiyonu için kullanılan Taq DNA polimeraz enzimine bağlı olacaktır. Bu protokol Phusion HF DNA Polimeraz için optimize edilmiştir.
      1. PCR reaksiyon karışımını buz üzerinde kurun: 5 μL 5x DNA polimeraz tamponu, 0.5 μL ileri PCR primer (10 μM stok), 0.5 μL ters PCR primer (10 μM stok), 0.5 μL 10 mM dNTP, 0.25 μL DNA Polimeraz, 1-4 μL hücre lizatı ve toplam 25 μL hacme kadar nükleaz içermeyen su.
      2. PCR reaksiyonunu programı kullanarak bir termosikler içinde çalıştırın: 3 dakika boyunca 98 °C ve 10 s için 98 °C'lik 35 döngü, 15 s için 62 °C, 15 s için 72 °C ve daha sonra 10 dakika için 72 °C. 4 °C bekletin. Bkz. NOT 4.2.3. üstünde.
    4. PCR ürünlerini elektroforez analizi için% 1'lik bir agaroz jeli üzerine yükleyin.
    5. Nakavt (ve vahşi tip) genotipler için öngörülen moleküler boyutun izole PCR fragmanlarından DNA çıkarın. DNA dizilimi için örnekleri hazırlayın.
    6. CRISPR reaksiyonunun başarılı olduğunu doğrulayın ve Cas9 bölünme bölgesini tanımlamak ve miRNA lokus delesyonunu doğrulamak için izole PCR fragmanlarının DNA dizilimini gerçekleştirin.
      1. CRISPR tarafından hedeflenen her miRNA lokusu için en az üç bağımsız nakavt hücre hattını izole edin. Aşağı akış fonksiyonel etütlerinde kontrol olarak kullanmak için vahşi tip (ve heterozigot) hücre hatlarını koruyun.
      2. Nakavt hücre hatlarının silinen lokus için olgun miRNA'yı ifade etmediğini doğrulamak için qRT-PCR veya kuzey leke analizi yapın.
        NOT: Tüm genom dizilimi (WGS), CRISPR gen düzenlemesini ve hedef dışı hedeflemeyi doğrulamak için en kesin yöntemdir.
      3. Hesaplamalı olarak tahmin edilen PCR ile CRISPR hedefleme dışı etkileri test edin (Adım 1.2.3.) 24,25,26,27.
      4. Kapsamlı tek hücreli koloni taraması sadece heterozigot genotiplerle sonuçlanırsa, kılavuz RNA transfeksiyonunu tek hücreli heterozigot çizgilerde tekrarlayın.
        NOT: Homozigot nakavt hücre hatlarının elde edilememesi, miRNA kaybı veya ebeveyn hücre hattının daha fazla analiz gerektiren doğal genomik karmaşıklığı (örneğin, kromozom duplikasyonları / füzyonları) nedeniyle ölümcül etkilere işaret edebilir.

Sonuçlar

Bu yüksek verimli CRISPR delesyon protokolü, Cas9 ile indüklenebilir LNCaP ve PC3-ML insan kanseri hücre hatlarının, prostat kanseri bağlamında incelenen miR-888 kümesini hedef alan sentetik oligonükleotid kılavuz RNA'ları ile transfeksiyonu kullanılarak başarıyla kullanılmıştır. MiR-888 kümesi başlangıçta bir ekspresyon profilleme ekranında, düşük dereceli ve kanser dışı hastalara kıyasla yüksek dereceli hastalığı olan prostat kanseri hastalarında yüksek olarak tanımlanmıştır

Tartışmalar

Bu CRISPR gen düzenleme prosedürü, araştırmacının benzersiz miRNA kümesi delesyon kombinasyonlarını taşıyan tüm hücre hatları panelini hızlı bir şekilde oluşturmasını sağlar. Bu protokolde sentetik tracrRNA (1: 1 molar oran) ile tavlanmış 5' ve 3' genomik bölgeye özgü crRNA'lardan oluşan sentetik kılavuz RNA'ların transfeksiyonu, zaman alıcı plazmid vektör alt klonlamasını önler ve 24 kuyucuklu bir format kullanarak daha esnek ve yüksek verimli bir deneysel tasarıma izin verir. DOX i...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

PC3-ML hücre hatları Mark Stearn (Drexel Üniversitesi Tıp Fakültesi) tarafından sağlanmıştır. Justin Toxey PCR genotiplemesine yardımcı oldu. Bu çalışma, AE-K'ya bir Breedan Adams Vakfı Hibesi, bir Ryan Translasyonel Araştırma Fonu ve bir Commonwealth Sağlık Araştırma Kurulu Hibesi (CHRB-274-11-20) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 mL PCR tubes, flat capFisher14-230-225Plasticware
1.5 mL Microcentrifuge TubesSeal-Rite1615-5500Plasticware
24-well tissue culture plateCorning Costar 09761146Plasticware
5x Phusion HF BufferThermo ScientificF-518LPCR reagent, genotyping
6-well tissue culture plateFisherFB012927Plasticware
96-well tissue culture plateFalcon08-772-2CPlasticware
Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonalAbCamab191468Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200
Antibiotic-Antimycotic (100x)Gibco15240062Tisuue culture reagent
BLAST nucleotide search engineNational Center for Biotechnology InformationNAFreeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov
Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenesCalbiochemCAS 589205CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water
Countess 3 Automated Cell CounterInvitrogenA50298Equipment; Cell counter
Cryogenic tubesThermo Scientific50001012Plasticware
Dharmacon CRISPR Design ToolHorizon Discovery Ltd.NAFreeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer
DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2Dharmacon, Inc.T-2002-02Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher BP231100Tisuue culture reagent
DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium PyruvateCorningMT10013CVTisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells
Doxycycline Hydrochloride, Ready Made SolutionSigma-AldrichD3072-1MLCRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water
DPBS, no calcium, no magnesiumGibco14190144Tisuue culture reagent
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designedDharmacon, Inc.U-002005-20CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides
Edit-R Modified Synthetic crRNA,
desalted/deprotected, 2 nmol		Dharmacon, Inc.crRNA-460XXXCRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides
EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 μL, 107 TU/mLDharmacon, Inc.VCAS11227CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system
Ensembl genomic viewerEnsemblNAFreeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences.
GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonalSanta Cruz Biotechnologysc25778Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500
Gel/PCR DNA Fragment Extraction KitIBI ScientificIB47010Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Gibco Fetal Bovine Serum, certifiedGibco16000044Tisuue culture reagent
Hexadimethrine bromideMilliporeSigmaH9268CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL
Immobilon-FL PVDF MembraneMilliporeSigmaIPFL10100Western blot reagent; nitrocellulose
Intercept (TBS) Blocking BufferLI-COR927-60001Western blot reagent
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary AntibodyLI-COR926-68070Western blot reagent
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary AntibodyLI-COR926-32211Western blot reagent
MicrocentrifugeEppendorf 5425 RPlasticware
miRBase microRNA viewermiRBaseNAFreeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb.
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-wellInvitrogenNP0321BOXWestern blot reagent
Odyssey CLx Imaging SystemLI-CORCLxEquipment; Western blot imaging
Opti-MEM Reduced Serum MediumGibco31985062Transfection reagent
Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis SystemOwlD2-BPEquipment; Nucleic acid gel electrophoresis system
PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides)Integrated DNA TechnologyNAPCR reagent, genotyping
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL)Thermo ScientificF530SPCR reagent, genotyping
RIPA Lysis Buffer 10xMilliporeSigma20-188Western blot reagent
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA gradeInvitrogen25530049PCR reagent, genotyping
RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL)Thermo ScientificEN0531PCR reagent, genotyping
RPMI 1640 MediumGibcoMT10041CVTisuue culture reagent; Media for LNCaP cells
SnapGene ViewerSnap GeneNAFreeware; website: [snapgene.com] Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which  highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features
TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol redGibco12563029Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin
UltraPure AgaroseInvitrogen16500100Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Veriti 96-Well Fast Thermal CyclerThermoFisher Scientific4375305Equipment
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis SystemInvitrogenEI0001Equipment; Protein gel electrophoresis system

Referanslar

  1. Hasegawa, T., Lewis, H., Esquela-Kerscher, A., Laurence, J. . Translating MicroRNAs to the Clinic. , 329-369 (2017).
  2. Lewis, H., Esquela-Kerscher, A., Thiagalingam, S. . Systems Biology of Cancer. , 134-153 (2015).
  3. Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs - microRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
  4. Breving, K., Esquela-Kerscher, A. The complexities of microRNA regulation: mirandering around the rules. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (8), 1316-1329 (2010).
  5. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, 154-158 (2008).
  6. Kabekkodu, S. P., et al. Clustered miRNAs and their role in biological functions and diseases. Biological Reviews. 93 (4), 1955-1986 (2018).
  7. Xiang, J., Wu, J. Feud or friend? The role of the miR-17-92 cluster in tumorigenesis. Current Genomics. 11 (2), 129-135 (2010).
  8. Aqeilan, R. I., Calin, G. A., Croce, C. M. miR-15a and miR-16-1 in cancer: discovery, function and future perspectives. Cell Death & Differentiation. 17 (2), 215-220 (2010).
  9. Hasegawa, T., et al. Characterization and evidence of the miR-888 cluster as a novel cancer network in prostate. Molecular Cancer Research. , (2018).
  10. Lewis, H., et al. miR-888 is an expressed prostatic secretions-derived microRNA that promotes prostate cell growth and migration. Cell Cycle. 13 (2), 227-239 (2014).
  11. Xu, J., et al. Evidence for a prostate cancer susceptibility locus on the X chromosome. Nature Genetics. 20 (2), 175-179 (1998).
  12. Schleutker, J., et al. A genetic epidemiological study of hereditary prostate cancer (HPC) in Finland: frequent HPCX linkage in families with late-onset disease. Clinical Cancer Research. 6 (12), 4810-4815 (2000).
  13. Farnham, J. M., Camp, N. J., Swensen, J., Tavtigian, S. V., Albright, L. A. Confirmation of the HPCX prostate cancer predisposition locus in large Utah prostate cancer pedigrees. Human Genetics. 116 (3), 179-185 (2005).
  14. Brown, W. M., et al. Hereditary prostate cancer in African American families: linkage analysis using markers that map to five candidate susceptibility loci. British Journal Of Cancer. 90 (2), 510-514 (2004).
  15. Bochum, S., et al. Confirmation of the prostate cancer susceptibility locus HPCX in a set of 104 German prostate cancer families. Prostate. 52 (1), 12-19 (2002).
  16. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
  17. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  18. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  19. . SnapGene® software (from Insightful Science; available at snapgene.com) Available from: https://www.snapgene.com (2022)
  20. . Ensembl Release 104 genome browser (from EMBL-EBI) Available from: https://www.ensembl.org (2022)
  21. Howe, K. L., et al. Ensembl 2021. Nucleic Acids Research. 49, 884-891 (2021).
  22. . miRBase: the microRNA database, Release 22.1 (from Griffiths-Jones laboratory) Available from: https://www.mirbase.org (2022)
  23. . Dharmacon CRISPR Design Tool (from Dharmacon) Available from: https://www.horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer (2022)
  24. . Off-Spotter (Venetia Pliatsika & Isidore Rigoutsos of the Jefferson Computational Medicine Center) Available from: https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/ (2022)
  25. Bao, X. R., Pan, Y., Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. Tools for experimental and computational analyses of off-target editing by programmable nucleases. Nature Protocols. 16 (1), 10-26 (2021).
  26. . Dharmacon DharmaFECT Transfection Reagent Cell Type Guide. Choose Dharmacon DharmaFECT 1, 2, 3, or 4 for optimal transfection of siRNA or miRNA reagents Available from: https://horizondiscovery.com/-/media-Files/Horizon/resources/Selection-guides/dharmafect-cell-type-guidelines.pdf (2022)
  27. Baffoe-Bonnie, A. B., et al. A major locus for hereditary prostate cancer in Finland: localization by linkage disequilibrium of a haplotype in the HPCX region. Human Genetics. 117 (4), 307-316 (2005).
  28. Zhang, R., Peng, Y., Wang, W., Su, B. Rapid evolution of an X-linked microRNA cluster in primates. Genome Research. 17 (5), 612-617 (2007).
  29. Ohnuki, Y., Marnell, M. M., Babcock, M. S., Lechner, J. F., Kaighn, M. E. Chromosomal analysis of human prostatic adenocarcinoma cell lines. Cancer Research. 40 (3), 524-534 (1980).
  30. Beheshti, B., Karaskova, J., Park, P. C., Squire, J. A., Beatty, B. G. Identification of a high frequency of chromosomal rearrangements in the centromeric regions of prostate cancer cell lines by sequential giemsa banding and spectral karyotyping. Molecular Diagnosis. 5 (1), 23-32 (2000).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 182CRISPRind klenebilir Cas9mikroRNA nakavtmiR 888 k mesi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır