Ferramenta de edição de genes CRISPR para análise de rede de cluster microrna

Resumo

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho de edição de genes de edição de genes (CRISPR) regularmente interespaçado de alto rendimento para análise de rede de clusters microRNA que permite a geração rápida de um painel de linhas celulares geneticamente modificadas carregando combinações únicas de exclusão de membros de cluster miRNA de até 35 kb dentro de um único experimento.

Resumo

MicroRNAs (miRNAs) surgiram como importantes reguladores celulares (supressores tumorais, fatores pró-oncogênicos) de câncer e metástase. A maioria dos estudos publicados se concentra em um único miRNA ao caracterizar o papel de pequenas RNAs no câncer. No entanto, ~30% dos genes miRNA humanos estão organizados em unidades agrupadas que são muitas vezes co-expressas, indicando um sistema complexo e coordenado de regulação de RNA não codificadora. Uma subescência mais clara de como as redes miRNA agrupadas funcionam cooperativamente para regular o crescimento do tumor, a agressividade do câncer e a resistência a medicamentos é necessária antes de traduzir pequenas RNAs não codificadas para a clínica.

O uso de um procedimento de edição de genes mediados regularmente interespaçoados (CRISPR) tem sido empregado para estudar o papel oncogênico de um aglomerado genômico de sete genes miRNA localizados dentro de um lócus de ~35.000 bp no contexto do câncer de próstata. Para esta abordagem, as linhas de células cancerígenas humanas foram infectadas com um vetor de lentivírus para doxycycline (DOX) indutível nuclease Cas9 cultivada em meio contendo DOX por 48 h. As células foram posteriormente co-transinfetadas com nICIR RNA (tracrRNA) sintético transativante (tracrRNA) complexados com oligonucleotídeos de RNA CRISPR (crRNA) específicos do local para permitir a rápida geração de linhas de células cancerosas carregando toda a exclusão do cluster miRNA e exclusões individuais ou combinadas do cluster genético miRNA dentro de um único experimento.

As vantagens deste sistema de edição de genes de alto rendimento são a capacidade de evitar subcloning vetorial de DNA demorado, a flexibilidade na transfectação de células com combinações de RNA guia única em um formato de 24 poços e a genotipagem pcr de menor custo usando lisatos de células brutas. Estudos que utilizam essa abordagem simplificada prometem descobrir redundâncias funcionais e interações sinérgicas/antagônicas entre membros do cluster miRNA, o que ajudará a caracterizar as complexas pequenas redes de RNA não codificadoras envolvidas em doenças humanas e informar melhor o design terapêutico futuro.

Introdução

São necessárias melhores ferramentas de pesquisa para investigar a contribuição de RNAs não codificadoras em doenças humanas. A distritação miRNA é frequentemente observada em distúrbios humanos, como o câncer, ao comparar os perfis de expressão desses pequenos RNAs não codificados nos tecidos e fluidos corporais (por exemplo, sangue, urina) de pacientes com câncer versus não-câncer, indivíduos saudáveis, empregando microarrays, PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR), e tecnologias de sequenciamento profundo de última geração ^1,2 . Trabalhos recentes caracterizaram um grande subconjunto desses miRNAs como supressor de tumor, fatores oncogênicos e metástases que controlam a formação do tumor, a progressão da doença e a resistência a medicamentos. Superexpressão experimental e/ou baixa regulação/perda de miRNAs resultam em consequências funcionais e pleiotrópicos na célula, refletindo a ampla gama de atividades associadas ao câncer que essas RNAs não codificadas coordenam - crescimento, apoptose, diferenciação, remodelação da cromatina, angiogênese, epitelial para transições mesenquimais (EMT) e MET transições, metabolismo e resposta imune³.

Os MiRNAs são codificados como genes únicos ou residem em aglomerados genômicos, que são transcritos no núcleo e extensivamente processados antes de gerar as espécies de nucleotídeos de ~22 nucleotídeos (nt) de nucleotídeos biologicamente maduros e de fio único (nt) localizadas no citoplasma⁴. Esses pequenos RNAs exercem seus efeitos pós-transcrição e agem como reguladores genéticos negativos que se ligam aos alvos do RNA mensageiro (mRNA) de forma específica para trazer o complexo de silenciamento catalítico induzido pelo RNA (RISC) para o site mRNA, resultando em degradação do mRNA e/ou um bloco na tradução de proteínas. MiRNAs são uma classe extremamente abundante de RNAs não codificadoras em sistemas animais, e existem 2.654 miRNAs maduras no genoma humano (versão miRBase 22.1)⁵. Os MiRNAs normalmente associam-se à complementaridade incompleta aos seus alvos mRNA⁴. Portanto, um único miRNA pode regular dezenas a centenas de alvos mRNA distintos e impactar funcionalmente uma grande variedade de vias biológicas. Para aumentar a complexidade dos mecanismos baseados em miRNA, um único mRNA pode ser regulado por múltiplos miRNAs distintos. É, portanto, desafiador investigar como a desregulação do miRNA interrompe o equilíbrio homeostático do corpo e leva à malignidade humana.

A maioria dos estudos publicados se concentrou em um único miRNA ao caracterizar seu papel em eventos de doenças. No entanto, ~30% dos genes miRNA humanos estão organizados em unidades agrupadas (tipicamente ~10 quilobases [kb]) que são frequentemente transcritas na mesma orientação e co-expressas, indicando um sistema coordenado e complexo de regulação de RNA não codificação⁶. O maior aglomerado de miRNA humanos policistrônico é o cluster 14q32 composto por 54 precursores de miRNA. Uma das unidades de miRNA agrupadas mais bem estudadas associadas a cânceres humanos é o aglomerado policistrônico miR-17-92 composto por miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1 e miR-92-1 residindo dentro do intron 3 do RNA não codificador, c13orf25. O cluster miR-17-92 é frequentemente amplificado em malignidades hematopoiéticas e superexpresso em tumores sólidos e estabeleceu papéis oncogênicos na promoção da progressão do ciclo celular, apoptose e angiogênese⁷. Além disso, o tumor supressivo miR-15a e miR-16-1 localizados dentro do intron do gene não codificador Leu2 é frequentemente excluído em leucemias e rebaixado em uma grande gama de cânceres, funcionando para bloquear o crescimento do tumor, visando o gene antipoptótico BCL2 e genes adicionais de progressão do ciclo celular⁸. O cluster miR-888 é elevado em pacientes com câncer de próstata de alto grau e consiste em sete genes miRNA (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b e -891a) localizados no cromossomo humano Xq27.3 ^9,10.

O cluster miR-888 mapeia dentro do lócus HPCX1 (Câncer de Próstata Hereditário, X-ligado 1) abrangendo Xq27-2, que foi identificado pela análise de linkage dos pedigrees familiares de câncer de próstata hereditário 11,12,13,14,15,29. A caracterização funcional de membros individuais miR-888 agrupados usando ferramentas convencionais de misexpressão miRNA - miRNA imita e inibidores antissamerais - indicou que esses miRNAs desempenham papéis sobrepostos na regulação do crescimento do tumor de próstata e invasão ^9,10. No entanto, esses métodos experimentais não se prestam facilmente ao estudo de como vários membros miR-888 agrupados agem sinergicamente ou antagonistamente em uma rede de RNA não codificadora para controlar a homeostase tecidual e a progressão do câncer. Este protocolo simplificado descrito usando a tecnologia de edição de genes CRISPR de alto rendimento é modificado para dissecar molecularmente clusters miRNA associados a cânceres humanos (por exemplo, cluster miR-888) para preencher essa lacuna de conhecimento.

Genes bacterianos CRISPR e CRISPR (cas) mediam a imunidade adaptativa contra bacteriófagos¹⁶. A descoberta deste antigo sistema de vigilância procaryótica foi rapidamente adaptada como uma ferramenta científica eficiente para atingir facilmente qualquer lócus genômico desejado e fazer alterações de sequência de DNA dentro de uma grande variedade de sistemas animais e tipos de células, tanto in vitro quanto in vivo^16,17. Essa técnica tem grande promessa como método eficaz para interrogar redes miRNA no contexto da doença humana. Para isso, este protocolo de edição de genes CRISPR de alta produtividade para estudar o cluster miR-888 abrange ~35 kb no cromossomo X humano em linhas de células de câncer de próstata humanas imortalizadas (LNCaP, PC3-ML) é construído para interrogar como os membros do cluster coordenam caminhos de progressão do câncer. Essa abordagem pode ser aplicada à caracterização de qualquer cluster de miRNA e permite que os pesquisadores gerem rapidamente linhas celulares humanas carregando toda a exclusão do cluster miRNA e exclusões individuais e combinadas do cluster de genes miRNA dentro de um único experimento.

Neste procedimento, são estabelecidas linhas de células estáveis carregando um sistema de expressão lentiviral indutível doxycycline (DOX) que permite ao pesquisador controlar a expressão genética endonuclease associada ao Streptococcus pyogenes CRISPR Cas9 (csn1) através do promotor indutível DOX constitutivo TRE3G. O sistema bipartido Tet-On 3G envolve um fator de alongamento humano constitutivo 1 alfa (hEF1alpha) para conduzir a transcrição tanto do gene Tet-On 3G quanto do gene de resistência blasticidina (Blast^R) como uma transcrição bicistronic. A proteína transativadora Tet-On 3G só se liga ao promotor TRE3G na presença do DOX, resultando em uma transcrição robusta do Cas9. Na ausência do DOX, não há nenhuma expressão basal cas9 muito mínima. Portanto, o pesquisador pode induzir uma alta produção de proteínas Cas9 em células cultivadas em mídia suplementada com DOX durante as etapas de edição de genes CRISPR e controle para liberação rápida de proteína CAS9 após a retirada do DOX.

Este protocolo também descreve o design de oligonucleotídeos crispr sintéticos (crRNA) visando regiões que flanqueam todo o cluster miRNA, regiões individuais de grampo de cabelo miRNA (premiRNA) e/ou subconjuntos de genes miRNA dentro do cluster. Cada crRNA projetado contém uma sequência de guias única de 5'terminal 20 nt (complementar à sequência genômica de interesse a ser alvo), seguido por um invariante 22 nt S. sequência de repetição de pyogenes (5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUUAUGUAUGCUUUG-3') que permite o pareamento de base com o oligonucleotídeos CRISPR¹⁸ universal transativante. Juntos, o crRNA enaltado e tracrRNA (proporção 1:1 misto) funcionam como o RNA guia para este protocolo (Figura 1A). Em cada experimento, dois RNAs guia sintético são transfectados em células induzidas pelo DOX para associar e escoltar a proteína Cas9 bacteriana aos locais de DNA genômico (5' e 3') flanqueando a região do cluster miRNA destinada à remoção (Figura 1B).

Uma sequência de motivo adjacente protoespaço (PAM) (5'-NGG-3' para tipo selvagem S. pyogenes Cas9) deve estar presente no genoma celular e localizada imediatamente adjacente à sequência de DNA de 20 nt alvo do guia RNA¹⁷. A sequência PAM serve como um sinal de ligação e posiciona a região catalítica da enzima endonuclease Cas9 no local de DNA genômico direcionado, posteriormente levando ao decote de DNA direcionado, de dupla-encalha (ds), localizado ~3 nt rio acima do PAM. O maquinário de reparação de DNA da célula repara as extremidades de DNA rachadas, o que pode resultar em ligadura perfeita, mas muitas vezes a junção final nonhomologous (NHEJ) ocorre, causando pequenas inserções ou exclusões (indels) no local de reparo. Uma vez que os miRNAs são genes não codificadores frequentemente localizados dentro de regiões intergênicas e intrônicas, esses indels têm um baixo risco de criar mutações indesejadas sem sentido/missense.

Ao empregar oligonucleotídeos RNA sintéticos (crRNA enlatado e tracrRNA, razão molar 1:1) codificação para o complexo RNA guia nesses experimentos, esta estratégia de eliminação genética evita o subcloamento vetorial de DNA demorado e permite uma enorme flexibilidade na transfeminação de combinações de RNA guia exclusivo para células em um formato de 24 poços. A preparação de lises de células brutas para a triagem do genótipo PCR também evita métodos caros e demorados de purificação de DNA, ao mesmo tempo em que permite a geração simplificada da linha celular de colônia única e a análise fenotípica. De fato, este protocolo de edição de genes CRISPR de alto rendimento tem sido usado com sucesso para transfetar linhas de células cancerígenas de próstata cultivadas (LNCaP, PC3-ML) com 32 combinações de RNA guia exclusivo em um único experimento e gerar linhas eliminatórias carregando exclusões para toda a região de cluster ~35 kb miR-888; combinações de exclusão menores para membros de cluster miR-888 pertencentes às famílias miR-743 e miR-891a; bem como exclusões para membros miRNA individuais dentro do cluster miR-888. Estudos como esses fornecerão uma subestagem mais clara de como os miRNAs agrupados funcionam cooperativamente para regular o crescimento do tumor, a agressividade e a resistência a medicamentos antes de traduzir miRNAs para a clínica como ferramentas terapêuticas e diagnósticas.

Protocolo

1. Preparação para edição de genes CRISPR e guiar o design do RNA para gerar linhas de células knockout de cluster miRNA

1. Crie um arquivo de DNA contendo a sequência genômica completa da região de interesse do cluster miRNA (intergênica, intronic) e pelo menos 1 kB de regiões genômicas circundantes usando um programa de software de anotação de sequência de DNA¹⁹.
   1. Use uma ferramenta de edição de recursos no arquivo de DNA criado para marcar o lócus de cluster miRNA (intergênico, intronic) e cada sequência individual de grampo de cabelo miRNA pertencente ao cluster miRNA, além de notar outros genes de codificação e não codificação próximos e/ou recursos regulatórios 5,20,21,22.
   2. Certifique-se de que as regiões miRNA destinadas à exclusão não interrompam inadvertidamente genes de codificação de proteínas próximos, genes não codificadores ou elementos importantes de DNA regulatório.
      NOTA: Considere a complexidade genômica (por exemplo, duplicações/fusões de cromossomo) da linha celular utilizada neste protocolo.
2. Projete crRNAs sintéticas visando 20 nt de sequência de DNA genômico flanqueando todo o cluster miRNA, regiões individuais de grampo de cabelo miRNA (pré-miRNA) e/ou subconjuntos de genes miRNA dentro do cluster usando uma ferramenta de software de design de RNA guia bioinformática (por exemplo,²³). Certifique-se de que a enzima Cas9 apropriada seja notada na ferramenta de design RNA guia (ou seja, S. pyogenes Cas9).
   NOTA: O crRNA sintetizado conterá esta sequência de guia única de 5'terminais de 20 nt (complementar ao alvo de DNA) seguida por um invariante 22 nt S. pyogenes sequência de repetição para permitir o emparelhamento de base com o oligonucleotídeo tracrRNA universal sintetizado. Juntos, eles funcionarão como o RNA guia neste protocolo.
   1. Referindo-se ao arquivo de DNA criado (Passo 1.1.), digite ~150 nt de sequência de DNA residindo imediatamente rio acima (5') ou rio abaixo (3') do lócus de pino/cluster miRNA direcionado para exclusão na ferramenta de software de design RNA guia bioinformática²³.
      NOTA: A ferramenta de design identificará sequências únicas de 20 nt para o design de oligonucleotídeos crRNA que residem imediatamente adjacentes à sequência PAM (na cadeia de DNA não-alvo) (por exemplo, S. pyogenes Cas9 PAM sequência NGG). Fornecido abaixo é um exemplo de design de crRNA direcionado a um site imediatamente upstream (5') do lócus gene mir-891a (especificamente 5A(891a) discutido na seção de resultados representativos e tabela 1).
      1. Abra a ferramenta de software de design RNA^{guia 23}.
      2. Digite o nome 5A(891a) na janela Enter Name .
      3. Na janela Enter a DNA sequence window, digite 150 nt de sequência genômica residente imediatamente upstream (5') do gene precursor mir-891a : 5'-AAGAAAATATACATGATAGCTGATAGTTACACAGG
         TTGTGAATAGTAAAATTAGTATGTCATTTATTT
         TAGGTATTCAATGTTGCATAGTCATATTATA
         ATTACGTAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
         CCCAAAGAGTCTACAAATGTTGTCT-3'
      4. Verifique a caixa marcada Ativar verificação de especificidade para excluir sites fora de segmentação detectados computacionalmente pelo programa. Escolha o organismo apropriado (ou seja, Humano [Homo sapiens]).
      5. Especifique a enzima Pam correta empregada para os estudos, neste caso, Streptococcus pyogenes Cas9-PAM:NGG, para gerar as seguintes configurações padrão: PAM relativa ao alvo: Depois; Sequência repetida: GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUG; Relativo ao Guia: 3; Comprimento da sequência do alvo: 20; Corte em relação ao início do alvo 5': Sentido 17 Anti-sentido 17.
      6. Clique no botão Próximo para ver os resultados da síntese de crRNA sintética.
         NOTA: Neste exemplo, o crRNA sugerido a ser sintetizado reconhecerá o alvo de DNA ATACATGCTGATAGTTACAC e será localizado ao lado de PAM:AGG.
   2. Faça referência ao arquivo de DNA (criado na Etapa 1.1.) para determinar as sequências de alvos crRNA 20 nt mais próximas do lócus miRNA a serem excluídas e possuam a maior especificidade para o alvo genômico pretendido.
      1. Use ferramentas de análise de off-targeting computacionais para avaliar a especificidade do crRNA do candidato e prever potenciais sites fora do alvo em loci genômicos não relacionados com a região de interesse do cluster miRNA alvo (por exemplo, 24,25,26,27).
      2. Regisso potencial de resultados fora do alvo para referência posterior quando genotipagem linhas de células clonais CRISPR de uma única colônia por PCR (Passo 4.2.6.).
         NOTA: A extensão da complementaridade da sequência compartilhada entre o oligonucleotídeo crRNA projetado e a sequência de alvos genômica ditará o quão seletivamente a enzima Cas9 corta o genoma naquele lócus. Uma vez que o guia RNA se refere ao alvo genômico em uma direção de 3' a 5', os desencontros no final da sequência de alvos de DNA de 5'' (as primeiras bases 8-10) muitas vezes bloqueiam o decote mediado por Cas9. Se a sequência genômica de alvos compartilhar a hologia com outro lócus genômico, exceto dentro das oito primeiras bases da sequência de DNA, este RNA guia é previsto para ter uma baixa chance de off-targeting neste local.
      3. Projete quatro crRNAs exclusivos para cada lócus miRNA direcionado: dois crRNAs projetados para atingir sequências complementares de DNA imediatamente 5' do grampo/cluster miRNA (5'A, 5'B) e dois crRNAs projetados para atingir sequências complementares de DNA imediatamente 3' do grampo/cluster miRNA (3'A, 3'B).
         NOTA: Ao realizar as transfecções CRISPR (na Seção 3), quatro combinações possíveis de pares de RNA guia 5' e 3' (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B) serão testadas para cada lócus miRNA direcionado para aumentar a probabilidade de gerar loções de mirna bem sucedidas em um único experimento.
      4. Use uma ferramenta de edição de recursos no arquivo de DNA criado (Passo 1.1.) para marcar a sequência de alvo de DNA (com PAM adjacente) para que cada crRNA projetado seja sintetizado.
3. Projete e sintetize primers PCR (para frente, para trás) flanqueando as regiões de cluster miRNA direcionadas para genotipagem de linhas celulares CRISPR (e rotular os primers no arquivo de DNA criado).
   1. Para as linhas celulares genotipadas que carregam pequenas exclusões genômicas para miRNAs estreitamente agrupadas ou individuais, projete primers PCR (para a frente, reverso) residentes aproximadamente 150 bp em cada lado da região de cleavage Cas9/knockout que permitirá a detecção tanto do tipo selvagem (~600 bp) quanto de fragmentos de DNA knockout (~300 bp) em uma única reação pcr via eletrofose gel.
   2. Para as linhas celulares genotipagem que carregam grandes exclusões genômicas para combinações precursoras de miRNA ou todo o cluster miRNA, projete novamente primers PCR (para frente, reverso) residindo aproximadamente 150 bp em cada lado do site de decote/nocaute Cas9. Observe que, se a exclusão do cluster miRNA alvo se estender >4 kb de comprimento, a reação do PCR provavelmente só detectará o fragmento menor (~300 bp) de DNA de nocaute, mas não o fragmento de DNA do tipo selvagem. Portanto, projete primers PCR adicionais (para frente, reverso) que possam detectar a presença ou ausência de genes internos de cluster miRNA para ajudar no processo de triagem e validar para linhas celulares de nocaute homozigos.

2. Geração de linhas de células lentivirais estáveis carregando o de expressão Cas9 indutível do DOX

NOTA: Realize todo o trabalho de cultura celular e vírus em uma capa de biossegurança certificada usando procedimentos BSL2 e técnica asséptica.

1. Determine o tipo de linha celular apropriada para os estudos CRISPR e mídia de crescimento preferencial.
   NOTA: Este protocolo foi desenvolvido para as linhas de células cancerígenas da próstata humana LNCaP (meio preferencial: RPMI, 10% soro bovino fetal [FBS]) e PC3-ML (meio preferencial: DMEM, 10% FBS).
2. Realize uma curva de "morte" blasticidina para determinar a concentração ideal de drogas para selecionar para células infectadas por lentivírus que carregam o gene de resistência blasticidin (Passo 2.3.).
   1. As células da placa em 11 poços de uma placa de 24 poços e crescem a 37 °C, 5% de CO₂ no meio preferido até aproximadamente 75% confluentes.
   2. Diluir o blasticidina (estoque de trabalho 1 mg/mL) no meio preferencial com uma concentração final variando de 0, 1, a 10 μg/mL e diluído em incrementos de 1 μg/mL.
   3. Rotule os poços da placa semeada de 24 poços de 1 a 11. Remova o meio de crescimento dos poços e substitua-se pelas concentrações blasticidina apropriadas.
   4. Troque o meio com as concentrações apropriadas de blasticidin a cada dois dias durante 7-10 dias.
   5. Examine as células diariamente durante o curso de tempo e determine a concentração mínima de blasticidina necessária para matar todas as células dentro de 5-7 dias.
      NOTA: Uma curva blasticidin "kill" precisará ser realizada para cada linha celular específica empregada para os experimentos de edição de genes CRISPR.
3. Infecte as células com lentivírus carregando o de expressão Cas9 indutível do DOX e realize a seleção blasticidina usando a concentração ideal determinada na Etapa 2.2.
   1. Em três poços de placa de 6 poços, a semente 5 × 10⁴ células por poço e cresce no meio preferido a 37 °C, 5% de CO₂ durante a noite (ON).
   2. No dia seguinte, descongele o vetor de expressão de lentivírus para Cas9 indutível do DOX (Lenti-iCas9) no gelo. Misture suavemente (não partículas de vírus vórtices).
      NOTA: Armazene o lentivírus em alíquotas a -80 °C para evitar múltiplos ciclos de congelamento/degelo, o que diminuirá os títulos virais e a eficiência da infecção.
   3. Calcule o volume necessário para transduzir 5 × 10⁴ células com vírus em uma multiplicidade de infecção de 0,3 (MOI = 0,3) com base na concentração de titer viral.
   4. Pipet o volume de vírus apropriado em 250 μL (por poço) de meio preferencial livre de soro e sem antibióticos complementado com brometo hexadimetrino de 0,8 μg/mL. Misture suavemente.
      NOTA: Brometo de hexadimetrina é um polímero cationic encontrado para aumentar a adsorção viral e eficiência de infecção.
   5. Remova o meio. Adicione os 250 μL de meio de transdução preparado com o vírus Lenti-iCas9 (MOI = 0,3) às células e incubar ON a 37 °C, 5% de CO₂. (Encurtar o tempo de incubação para 4-6 h se as células apresentarem efeitos tóxicos relacionados ao vírus.)
   6. Substitua o meio por meio preferencial fresco e permita que as células se recuperem por 1-2 dias.
   7. Realize a seleção de blasticidin nas células infectadas por 10-14 dias usando a concentração ideal de blasticidina derivada da curva "kill" descrita no Passo 2.2.
      1. Em paralelo, cresçam as células não infectadas em meio com a concentração ideal de blasticidina para serem usadas como um controle positivo para a seleção viral.
   8. Altere o meio complementado com a concentração ideal de blasticidina a cada 3 dias durante o curso de tempo de seleção para remover células mortas.
      NOTA: Somente as células que sobreviverem à seleção blasticidina terão integrado o vetor lentiviral.
   9. Expanda as linhas celulares Lenti-iCas9 selecionadas por blasticidina.
      NOTA: Registo o número da passagem do celular em cada expansão.
      1. Congele uma porção das células Lenti-iCas9 em meio preferencial suplementado com sulfóxido de dimetil de 10% (DMSO) para armazenamento criovial de longo prazo.
      2. Analise uma porção das células Lenti-iCas9 por mancha ocidental⁹ para identificar a linha celular que exibe os níveis de proteína Cas9 indutíveis do DOX mais robustos (ver Passo 2.3.).
4. Realize uma curva de concentração de doxiciclina em linhas celulares Lenti-iCas9 recém-estabelecidas para determinar as condições ideais para a indução da proteína Cas9.
   1. Configure quatro placas independentes de 6 poços para cada linha celular testada para realizar este curso de tempo de concentração do DOX. Placa 5 × 10⁴ células por poço de cada placa de 6 poços e crescem a 37 °C, 5% de CO₂ no meio preferido por 24 h.
   2. Diluir DOX (estoque de trabalho 1 mg/mL) no meio preferencial com uma curva de concentração do DOX final variando de 0, 50, 100, 150, 250 a 500 ng/mL.
   3. Rotule os poços de cada placa semeada de 6 poços de 1 a 6. Remova o meio e substitua-o pelas concentrações DOX apropriadas. Cultivar placas 1-4 até os seguintes pontos de tempo: 24 h, 48 h e indução DOX 72 h; e 120 h pós retirada do DOX (inicialmente 72 h induzida por DOX).
   4. Colher os poços da placa em cada ponto de tempo usando métodos apropriados (por exemplo, trippsinização). Armazene as pelotas de celular a -80 °C. Processe as pelotas de célula no buffer RIPA para isolamento de liseto e análise de manchas ocidentais Cas9.
      1. Execute 40 μg de lise celular para cada amostra do curso de tempo de indução do DOX usando um gel Bis-Tris desnaturing de 4%-12% e transfira as proteínas para uma membrana imunoblot.
      2. Hibridize a membrana do imunobloto com um anticorpo primário contra Cas9 para detectar a proteína de 160 kDa. Normalize os níveis de Cas9 usando um gene de limpeza como GAPDH (37 kDa).
   5. Com base nos resultados da mancha ocidental, determine a concentração ideal do DOX para induzir Cas9 nas linhas celulares Lenti-iCas9.
      NOTA: Este curso de tempo também revelará o quão rigorosamente a expressão Cas9 é regulada após a remoção do DOX pós 120 h.
   6. Estabeleça colônias unicelulares para as linhas celulares Lenti-iCas9 mostrando uma expressão robusta de proteína Cas9 para otimizar as transfecções CRISPR (na Seção 3).

3. Realizando reações CRISPR por indução Cas9 e transfecção de RNA guia sintético de células usando um formato de alto rendimento

NOTA: Um diagrama de fluxo de trabalho é mostrado na Figura 1.

1. No papel, mapeie as combinações de pares de crRNA que serão transfeinadas em cada poço de uma placa de 24 poços visando todo o cluster miRNA, várias combinações de genes miRNA agrupados, bem como membros individuais do cluster miRNA.
   1. No mapa, rotule quatro poços por lócus miRNA direcionado. Cada um bem representa uma reação de transfecção, com dois crRNAs únicos posicionados 5' e 3' do lócus genômico miRNA desejado e o tracrRNA (razão molar 1:1).
   2. Certifique-se de que cada um dos quatro poços rotulados represente um par de crRNA exclusivo para transfecção (por exemplo, 5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B).
      NOTA: O design de dois crRNAs de 5' e dois crRNAs de 3' flanqueando cada lócus miRNA (Seção 1) permite a geração de quatro possíveis pares de RNA guia de 5' e 3' na reação de transfecção.
2. Emplaque a linha celular Lenti-iCas9 em 5 x 10⁴ células/poço de uma placa de 24 poços no meio preferido contendo a concentração OTIMIZAda DOX (determinada na Etapa 2.4.). Cresça as células por 24-48 h a 37 °C, 5% de CO₂ para induzir a expressão proteica Cas9.
3. Transfeito as células Lenti-iCas9 com os RNAs guias preparados de 5' e 3'.
   1. Reconstitua os oligonucleotídeos de crRNA e tracrRNA sintetizados com água sem nuclease a uma concentração de estoque de 10 μM. Armazenar a -80 °C a longo prazo.
   2. Rotule quatro tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL por locus miRNA direcionado com base no mapa experimental projetado na Etapa 3.1., representando as quatro combinações possíveis de pares de crRNA de 5' e 3' (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B; 5'B + 3'B).
   3. Em cada tubo, misture uma razão molar de 1:1 de tracrRNA e crRNAs únicas (5' e 3') para formar o complexo de RNA guia de 2 μM usando a reação seguinte (volume final de 10 μL):
      1. Adicionar 2,5 μL de tracrRNA (10 μM de estoque), 1,25 μL do crRNA posicionado de 5''(10 μM de estoque), 1,25 μL do crRNA de 3' posicionado (10 μM de estoque) e 5 μL de 10 mM TRIS-HCL pH 7,5 a um tubo centrífuga de 1,5 mL. Microcentrifuuge para 30 s a 16.000 × g para misturar. Incubar em temperatura ambiente (RT) por 5 min.
   4. A cada tubo, adicione 40 μL de meio de soro reduzido (por exemplo, Opti-MEM) aos 10 μL de reação complexa RNA guia (volume total de 50 μL). Misture suavemente por pipetting para cima e para baixo.
   5. Em um tubo de centrífugas de 1,5 mL limpo, misture 2 μL do reagente de transfecção²⁸ (ver NOTA 3.3.5.1.) e 48 μL de meio soro reduzido (por exemplo, Opti-MEM, volume final de 50 μL) suavemente por tubulação para cima e para baixo. Incubar na RT por 5 min.
      1. Prepare uma mistura mestre do reagente de transfecção multiplicando o reagente (2 μL) e o meio sérico reduzido (por exemplo, Opti-MEM, 48 μL) pelo número de poços a serem transfecidos, além de 10% de volume extra para contabilizar pequenas imprecisões de tubulação.
         NOTA: Selecione um reagente de transfecção otimizado para pequenas transfecções de oligonucleotídeos de RNA e RNA CRISPR, bem como para a linha celular tipo²⁸.
   6. A cada tubo contendo os 50 μL de guia RNA mix (a partir da etapa 3.3.4.), adicione os 50 μL do reagente de transfecção diluído (da Etapa 3.3.5.). Enconca a mistura lentamente para cima e para baixo uma vez para misturar. Incubar na RT por 20 minutos.
   7. Adicione 400 μL de meio livre de antibióticos complementados com DOX (concentração ideal) em cada tubo contendo os 100 μL da mistura guia RNA/transfecção. Pipeta suavemente para misturar.
4. Remova o meio das células Lenti-iCas9 induzidas pelo DOX (Passo 3.2.). Adicione 500 μL de media/DOX/guia RNA/transfecção com base no mapa experimental da placa de 24 poços (Passo 3.1.). Incubar as células transfeinadas por 48 h a 37 °C, 5% de CO₂.
5. Substitua o meio pelo meio preferido fresco sem DOX (para limpar a proteína Cas9 das células). Deixe as células se recuperarem por mais 24-48 h a 37 °C, 5% de CO₂.
6. Colher as células transfeinadas (trippsinização) e preparar-se para genotipagem e diluições unicelulares.
   NOTA: As células representam uma população mista contendo células do tipo selvagem editadas e não transtravadas por genes CRISPR. Esta etapa determinará a eficiência da edição crispr antes de investir tempo/recursos na expansão de colônias unicelulares.
   1. Lave as células 1x com 1 mL de soro fisiológico tamponado por fosfato (PBS). Incubar as células em 100 μL de trippsina por 5 min a 37 °C, 5% DE CO₂ e transferir as células para um tubo de centrífuga de 1,5 mL limpo contendo 1 mL de meio.
   2. Inverta para misturar e microcentificar as células por 5 min a 200 × g a 20 °C. Remova o meio e resuspende a pelota da célula em 1 mL de PBS.
   3. Microcentrifuugar as células lavadas por 5 min a 200 × g a 20 °C. Remova o PBS e resuspense a pelota da célula em 150 μL do meio preferido.
7. Determine o número celular por microliter dos 150 μL de células resuspended usando um hemocitómetro ou instrumento automatizado de contagem de células.
8. Separe os 150 μL de células resuspended em três partes.
   1. Congelar 1/3 de células transfeinadas (50 μL) em média mais 10% DMSO (volume final de 150 μL) em criovials para expansão futura/armazenamento a longo prazo.
   2. Transfira 1/3 de células transfeinadas (50 μL) em um tubo PCR limpo de 0,2 mL para genotipagem.
      1. Microcentrize as células por 5 min a 200 × g a 4 °C e remova o meio.
      2. Resuspense a pelota de célula em 100 μL de PBS.
      3. Microcentrar as células por 5 min a 200 × g a 4 °C e remover o PBS. Armazenar pelotas de células de população mista a longo prazo a -80 °C.
      4. Processe a pelota celular para genotipagem usando o fluxo de trabalho na Seção 4.
   3. Prepare o 1/3 final das células (50 μL) para diluição e revestimento em um formato de placa de 96 poços para gerar colônias unicelulares.
      1. Com base na contagem de células da etapa 3.7., calcule as diluições necessárias para atingir 10, 5, 2 e 1 células(s) em 100 μL de médio por poço de uma placa de 96 poços.
      2. Utilizando um multi-tubulator de 12 canais e um reservatório de reagente estéril, adicione 100 μL de células diluídas por poço a duas fileiras da placa (24 poços no total) para cada diluição (10, 5, 2 ou 1 célula por poço). Permita que 4-6 semanas para as células cresçam para confluência para a expansão de colônias unicelulares. Observe as células semanalmente sob um microscópio leve e observe se as colônias representam colônias de células únicas ou múltiplas.
      3. Colete ~10-15 colônias unicelulares para genotipagem (Seção 4). Identifique pelo menos três linhas independentes, eliminatórias, colônias unicelulares para cada lócus miRNA direcionado. Mantenha linhas de célula única tipo selvagem como controles.
         NOTA: O número de triagem dependerá do tipo de linha celular e do impacto do fenótipo de nocaute miRNA no crescimento/viabilidade celular.

4. Genotipagem pcr de linhas celulares CRISPR usando lises de células brutas

1. Colher colônias individuais de células únicas de poços quase confluentes de uma placa de 96 poços.
   NOTA: A remoção do meio/PBS descrito nessas etapas pode ser realizada manualmente usando um aspirador de vácuo no gabinete de biossegurança, mas tenha cuidado para evitar contaminação cruzada. Use uma nova ponta pipetman "amarela" estéril de 200 μL para cada poço da placa de 96 poços ao aspirar, na qual cada ponta amarela trocada é firmemente colocada na extremidade de uma pipeta de pasto de vidro estéril presa ao aspirador de vácuo.
   1. Lave os poços 1x com 100 μL de PBS. Aspire a PBS.
   2. Adicione 50 μL de trippsina e incubar por 2-5 min a 37 °C, 5% de CO₂.
   3. Tubo suavemente para cima e para baixo e transfira as células resuspended em um tubo centrífugo de 1,5 mL contendo 1 mL de meio.
   4. Inverta para misturar e dotecer suavemente as células em uma microcentrifusagem por 5 min a 200 × g a 20 °C.
   5. Retire o meio e adicione 1 mL de PBS. Gire suavemente o tubo para interromper a pelota e inverta várias vezes para misturar.
   6. Microcentrifuuge por 5 min a 200 × g a 20 °C para pelotar as células.
   7. Remova o PBS e resuspense a pelota em 300 μL de PBS fresco.
   8. Divida a amostra de 300 μL em duas partes.
      1. Transfira 200 μL das células (2/3 da pelota) para um poço de uma placa de 24 poços contendo 1 mL do meio preferido. Uma vez validado o genótipo, use essas células para expandir as linhas de células de nocaute mediadas pelo CRISPR para análise funcional.
      2. Transfira 100 μL das células (1/3 da pelota) para um tubo PCR de 0,2 mL. Microcentrifuuge por 5 min a 3.000 x g a 4 °C. Remova o PBS. Armazene a pelota a -80 °C.
2. Prepare as células brutas para genotipagem e análise de sequência usando os primers PCR projetados na Etapa 1.3. Inclua os lises celulares preparados a partir de células não transtravas nesses experimentos para usar como controles positivos do tipo selvagem.
   1. Resuspenque a pelota celular em 4 μL de tampão de polimerase de DNA 5x (ver a Tabela de Materiais, concentração final 1x), 1 μL de Proteinase K (20 ng/mL estoque), 1 μL de RNase A (10 ng/mL estoque) e água sem nuclease até um volume total de 20 μL.
   2. Lise as células em um termociclador usando um programa PCR: 56 °C para 30 min e 96 °C por 5 min. Armazene as células a -20 °C.
   3. Execute uma reação pcr usando os primers PCR projetados (para frente, para trás) que flanqueiam os locais-alvo do guia RNA 5' e 3' (Tabela 1).
      NOTA: As condições do tampão de polimerase de DNA e do termociclador dependerão da enzima de polimerase de DNA Taq usada para a reação pcr. Este protocolo foi otimizado para uma Polimerase de DNA Phusion HF.
      1. Configure a mistura de reação pcr no gelo: 5 μL de 5x buffer de polimerase de DNA, 0,5 μL de primer PCR dianteiro (10 μM de estoque), 0,5 μL de primer PCR reverso (10 μM de estoque), 0,5 μL de 10 mM dNTPs, 0,25 μL de DNA Polymerase, 1-4 μL de liseto celular e água sem nuclease até um volume total de 25 μL.
      2. Execute a reação pcr em um termociclador usando o programa: 98 °C para 3 min, e 35 ciclos de 98 °C para 10 s, 62 °C para 15 s, 72 °C para 15 s e depois 72 °C para 10 min. Mantenha por 4 °C. Consulte o NOTE 4.2.3. acima.
   4. Coloque os produtos PCR em um gel de 1% de agarose para análise de eletroforese.
   5. Extrair DNA dos fragmentos isolados de PCR do tamanho molecular previsto para os genótipos de nocaute (e tipo selvagem). Prepare as amostras para sequenciamento de DNA.
   6. Valide que a reação CRISPR foi bem sucedida e realize o sequenciamento de DNA dos fragmentos de PCR isolados para identificar o local do decote Cas9 e confirmar a exclusão do lócus miRNA.
      1. Isole pelo menos três linhas de células knockout independentes para cada lócus miRNA alvo do CRISPR. Reter linhas celulares tipo selvagem (e heterozigoso) para usar como controles em estudos funcionais a jusante.
      2. Realize a análise qRT-PCR ou northern blot para confirmar que as linhas de células knockout não expressam miRNA maduro para o lócus excluído.
         NOTA: O sequenciamento do genoma inteiro (WGS) é o método mais definitivo para validar a edição e o off-targeting de genes CRISPR.
      3. Teste para efeitos crispr fora de segmentação por PCR, que foram previstos computacionalmente (Passo 1.2.3.) 24,25,26,27.
      4. Se a triagem extensiva de colônias unicelulares resultar apenas em genótipos heterozigosos, repita a transfecção guia do RNA nas linhas heterozigógenas unicelulares.
         NOTA: A incapacidade de obter linhas celulares homozigos podem indicar efeitos letais devido à perda de miRNA ou à complexidade genômica inerente (por exemplo, duplicações/fusões de cromossomo) da linha celular parental que requerem uma análise mais aprofundada.

Resultados

Este protocolo de exclusão CRISPR de alta produtividade foi empregado com sucesso usando transfecção de linhas de células cancerígenas humanas Indutíveis Cas9 e PC3-ML com guia de oligonucleotídeo sintético RNAs visando o cluster miR-888, que foram estudados no contexto do câncer de próstata. O cluster miR-888 foi inicialmente identificado em uma tela de perfil de expressão como sendo elevado em pacientes com câncer de próstata com doença de alto grau em comparação com pacientes de baixo grau e

Discussão

Este procedimento de edição de genes CRISPR permite que o investigador gere rapidamente um painel inteiro de linhas celulares carregando combinações únicas de exclusão de cluster miRNA. A transfecção de RNAs guia sintéticos compostas por crRNAs genômicas de 5' e 3' genômicas com tracrRNA sintética (razão molar 1:1) neste protocolo evita o subcloamento de vetores plasmídeos demorados e permite um design experimental mais flexível e de alto rendimento usando um formato de 24 poços. A geração de linhas cel...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tubes, flat cap	Fisher	14-230-225	Plasticware
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Seal-Rite	1615-5500	Plasticware
24-well tissue culture plate	Corning Costar	09761146	Plasticware
5x Phusion HF Buffer	Thermo Scientific	F-518L	PCR reagent, genotyping
6-well tissue culture plate	Fisher	FB012927	Plasticware
96-well tissue culture plate	Falcon	08-772-2C	Plasticware
Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonal	AbCam	ab191468	Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco	15240062	Tisuue culture reagent
BLAST nucleotide search engine	National Center for Biotechnology Information	NA	Freeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov
Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenes	Calbiochem	CAS 589205	CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water
Countess 3 Automated Cell Counter	Invitrogen	A50298	Equipment; Cell counter
Cryogenic tubes	Thermo Scientific	50001012	Plasticware
Dharmacon CRISPR Design Tool	Horizon Discovery Ltd.	NA	Freeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer
DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2	Dharmacon, Inc.	T-2002-02	Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher	BP231100	Tisuue culture reagent
DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Corning	MT10013CV	Tisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells
Doxycycline Hydrochloride, Ready Made Solution	Sigma-Aldrich	D3072-1ML	CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144	Tisuue culture reagent
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designed	Dharmacon, Inc.	U-002005-20	CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides
Edit-R Modified Synthetic crRNA, desalted/deprotected, 2 nmol	Dharmacon, Inc.	crRNA-460XXX	CRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides
EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 μL, 107 TU/mL	Dharmacon, Inc.	VCAS11227	CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system
Ensembl genomic viewer	Ensembl	NA	Freeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences.
GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonal	Santa Cruz Biotechnology	sc25778	Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500
Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit	IBI Scientific	IB47010	Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Gibco Fetal Bovine Serum, certified	Gibco	16000044	Tisuue culture reagent
Hexadimethrine bromide	MilliporeSigma	H9268	CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL
Immobilon-FL PVDF Membrane	MilliporeSigma	IPFL10100	Western blot reagent; nitrocellulose
Intercept (TBS) Blocking Buffer	LI-COR	927-60001	Western blot reagent
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-68070	Western blot reagent
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-32211	Western blot reagent
Microcentrifuge	Eppendorf	5425 R	Plasticware
miRBase microRNA viewer	miRBase	NA	Freeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb.
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well	Invitrogen	NP0321BOX	Western blot reagent
Odyssey CLx Imaging System	LI-COR	CLx	Equipment; Western blot imaging
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Gibco	31985062	Transfection reagent
Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis System	Owl	D2-BP	Equipment; Nucleic acid gel electrophoresis system
PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides)	Integrated DNA Technology	NA	PCR reagent, genotyping
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL)	Thermo Scientific	F530S	PCR reagent, genotyping
RIPA Lysis Buffer 10x	MilliporeSigma	20-188	Western blot reagent
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade	Invitrogen	25530049	PCR reagent, genotyping
RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL)	Thermo Scientific	EN0531	PCR reagent, genotyping
RPMI 1640 Medium	Gibco	MT10041CV	Tisuue culture reagent; Media for LNCaP cells
SnapGene Viewer	Snap Gene	NA	Freeware; website: [snapgene.com] Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which  highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features
TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red	Gibco	12563029	Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500100	Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler	ThermoFisher Scientific	4375305	Equipment
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System	Invitrogen	EI0001	Equipment; Protein gel electrophoresis system