JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает высокопроизводительный процесс редактирования генов кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR) для анализа сети кластеров микроРНК, который позволяет быстро генерировать панель генетически модифицированных клеточных линий, несущих уникальные комбинации делеции членов кластера miRNA размером до 35 кб в рамках одного эксперимента.

Аннотация

МикроРНК (миРНК) стали важными клеточными регуляторами (супрессоры опухолей, проонкогенные факторы) рака и метастазирования. Большинство опубликованных исследований сосредоточены на одной миРНК при характеристике роли малых РНК в раке. Тем не менее, ~ 30% генов миРНК человека организованы в кластеризованные единицы, которые часто совместно экспрессируются, что указывает на сложную и скоординированную систему некодирующей регуляции РНК. Необходимо более четкое представление о том, как кластерные сети миРНК функционируют совместно для регулирования роста опухоли, агрессивности рака и лекарственной устойчивости, прежде чем переводить некодирующие малые РНК в клинику.

Использование высокопроизводительной кластеризованной регулярно интерраспространяемой процедуры редактирования генов, опосредованной короткими палиндромными повторами (CRISPR), было использовано для изучения онкогенной роли геномного кластера из семи генов миРНК, расположенного в локусе длиной ~ 35 000 bp в контексте рака предстательной железы. Для этого подхода линии раковых клеток человека были инфицированы лентивирусным вектором для доксициклина (DOX)-индуцируемого нуклеазы Cas9, выращенной в DOX-содержащей среде в течение 48 ч. Впоследствии клетки были совместно трансфектированы синтетической трансактивирующей CRISPR РНК (tracrRNA), комплексованной с геномными сайт-специфическими олигонуклеотидами CRISPR РНК (crRNA), чтобы обеспечить быструю генерацию линий раковых клеток, несущих всю кластерную делецию miRNA и индивидуальные или комбинированные кластерные делеции генов miRNA в рамках одного эксперимента.

Преимуществами этой высокопроизводительной системы редактирования генов являются способность избежать трудоемкого субклонирования векторов ДНК, гибкость в трансфекции клеток с уникальными комбинациями направляющих РНК в формате 24 лунки и более дешевое генотипирование ПЦР с использованием сырых лизатов клеток. Исследования, использующие этот оптимизированный подход, обещают выявить функциональные избыточности и синергетические / антагонистические взаимодействия между членами кластера миРНК, что поможет охарактеризовать сложные небольшие некодирующие сети РНК, участвующие в заболеваниях человека, и лучше информировать будущий терапевтический дизайн.

Введение

Необходимы более совершенные исследовательские инструменты для изучения вклада некодирующих РНК в заболевания человека. Дисрегуляция миРНК часто наблюдается при расстройствах человека, таких как рак, при сравнении профилей экспрессии этих небольших некодирующих РНК в тканях и жидкостях организма (например, крови, моче) больных раком с нераковыми, здоровыми людьми, использующими микрочипы, количественную ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) и технологии глубокого секвенирования следующего поколения 1,2 . Недавняя работа охарактеризовала большое подмножество этих миРНК как супрессор опухолей, онкогенные и метастазирующие факторы, которые контролируют образование опухоли, прогрессирование заболевания и лекарственную устойчивость. Экспериментальная сверхэкспрессия и/или понижающая регуляция/потеря миРНК приводят к функциональным и плейотропным последствиям в клетке, отражая широкий спектр связанных с раком действий, которые эти некодирующие РНК координируют - рост, апоптоз, дифференцировка, ремоделирование хроматина, ангиогенез, переходы эпителия в мезенхимальные (ЭМТ) и МЕТ, метаболизм и иммунный ответ3.

МиРНК кодируются как отдельные гены или находятся в геномных кластерах, которые транскрибируются в ядре и интенсивно обрабатываются перед генерацией биологически зрелых, одноцепочечных ~ 22 нуклеотидных (nt) видов миРНК, локализованных в цитоплазме4. Эти небольшие РНК оказывают свое действие посттранскрипционно и действуют как отрицательные регуляторы генов, которые связываются с мишенями матричной РНК (мРНК) специфическим для последовательности способом, чтобы привести каталитический РНК-индуцированный комплекс глушения (RISC) к сайту мРНК, что приводит к деградации мРНК и / или блоку в трансляции белка. МиРНК являются чрезвычайно распространенным классом некодирующих РНК в системах животных, и в геноме человека существует 2 654 зрелых миРНК (выпуск miRBase 22.1)5. МиРНК обычно ассоциируются с неполной комплементарностью к их мишеням мРНК4. Таким образом, одна миРНК может регулировать от десятков до сотен различных мишеней мРНК и функционально воздействовать на большой спектр биологических путей. Чтобы усложнить механизмы на основе миРНК, одна мРНК может регулироваться несколькими различными миРНК. Таким образом, сложно исследовать, как дисрегуляция миРНК нарушает гомеостатический баланс организма и приводит к злокачественным новообразованиям человека.

Большинство опубликованных исследований были сосредоточены на одной миРНК при характеристике их роли в событиях заболевания. Тем не менее, ~ 30% генов миРНК человека организованы в кластеризованные единицы (обычно ~ 10 килобаз [kb]), которые часто транскрибируются в одной и той же ориентации и совместно экспрессируются, что указывает на скоординированную и сложную систему некодирующей регуляции РНК6. Крупнейшим полицистронным кластером миРНК человека является кластер 14q32, состоящий из 54 предшественников миРНК. Одной из наиболее хорошо изученных кластеризованных единиц миРНК, связанных с раком человека, является полицистронный кластер miR-17-92, состоящий из miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1 и miR-92-1, находящихся в интроне 3 некодирующей РНК c13orf25. Кластер miR-17-92 часто усиливается при злокачественных новообразованиях кроветворения и чрезмерно экспрессируется в солидных опухолях и установил онкогенную роль в содействии прогрессированию клеточного цикла, апоптозу и ангиогенезу7. Кроме того, опухолевый супрессивный кластер miR-15a и miR-16-1, расположенный в интроне некодирующего гена Leu2, часто удаляется при лейкемиях и подавляется в большом диапазоне раковых заболеваний, функционируя для блокирования роста опухоли путем нацеливания на антиапоптотический ген BCL2 и дополнительные гены прогрессирования клеточного цикла8. Кластер miR-888 повышен у пациентов с раком предстательной железы высокой степени и состоит из семи генов миРНК (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b и -891a), расположенных на хромосоме человека Xq27.3 9,10.

Кластер miR-888 картирует локус HPCX1 (наследственный рак предстательной железы, X-linked 1), охватывающий Xq27-2, который был идентифицирован путем анализа связей наследственного рака предстательной железы семейства родословных 11,12,13,14,15,29. Функциональная характеристика отдельных членов кластеризации miR-888 с использованием обычных инструментов дезэкспрессии миРНК - имитаций миРНК и антисмысловых ингибиторов - показала, что эти миРНК играют перекрывающиеся роли в регуляции роста опухоли предстательной железы и инвазии 9,10. Однако эти экспериментальные методы не позволяют легко изучить, как несколько кластеризованных членов miR-888 действуют синергетически или антагонистично в некодирующей сети РНК для контроля гомеостаза тканей и прогрессирования рака. Этот описанный оптимизированный протокол с использованием высокопроизводительной технологии редактирования генов CRISPR модифицирован для молекулярного рассечения кластеров миРНК, связанных с раком человека (например, кластер miR-888), чтобы преодолеть этот пробел в знаниях.

Бактериальные гены CRISPR и CRISPR-ассоциированные (cas) опосредуют адаптивный иммунитет против бактериофагов16. Открытие этой древней системы наблюдения за прокариотами было быстро адаптировано в качестве эффективного научного инструмента для легкого нацеливания на любой желаемый геномный локус и изменения последовательности ДНК в большом диапазоне систем животных и типов клеток как in vitro, так и in vivo16,17. Этот метод имеет большие перспективы в качестве эффективного метода опроса сетей миРНК в контексте заболеваний человека. С этой целью этот высокопроизводительный протокол редактирования генов CRISPR для изучения кластера miR-888, охватывающий ~ 35 КБ на хромосоме X человека в увековеченных клеточных линиях рака предстательной железы человека (LNCaP, PC3-ML), построен для опроса о том, как члены кластера координируют пути прогрессирования рака. Этот подход может быть применен к характеристике любого кластера миРНК и позволяет исследователям быстро генерировать клеточные линии человека, несущие всю делецию кластера миРНК и индивидуальные и комбинированные делеции кластера генов миРНК в рамках одного эксперимента.

В этой процедуре устанавливаются стабильные клеточные линии, несущие доксициклин (DOX)-индуцируемую лентивирусную систему экспрессии, которая позволяет исследователю контролировать экспрессию гена Streptococcus pyogenes CRISPR-ассоциированной эндонуклеазы Cas9 (csn1) через конститутивный DOX-индуцируемый промотор TRE3G. Двудольная система Tet-On 3G включает в себя конститутивный промотор фактора удлинения человека 1 альфа (hEF1alpha) для управления транскрипцией как гена Tet-On 3G, так и гена резистентности к бластицидину (BlastR) в качестве бицистронного транскрипта. Белок трансактиватора Tet-On 3G связывается с промотором TRE3G только в присутствии DOX, что приводит к надежной транскрипции Cas9. При отсутствии DOX отсутствует или очень минимальная базальная экспрессия Cas9. Таким образом, исследователь может индуцировать высокую выработку белка Cas9 в клетках, выращенных в средах, дополненных DOX, на этапах редактирования гена CRISPR и контролировать быстрый клиренс белка CAS9 при отмене DOX.

Этот протокол также описывает разработку синтетических олигонуклеотидов CRISPR РНК (crRNA), нацеленных на области, фланкирующие весь кластер miRNA, отдельные области шпильки miRNA (premiRNA) и / или подмножества генов miRNA в кластере. Каждая разработанная цРНК содержит уникальную 5'-концевую 20-нтовую направляющую последовательность (комплементарную геномной последовательности, представляющую интерес для нацеливания), за которой следует инвариантная повторная последовательность 22 nt S. pyogenes (5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3'), которая позволяет спаривать основания с универсальными трансактивирующими CRISPR РНК (тракрРНК) олигонуклеотидами18. Вместе отожженные crRNA и tracrRNA (смешанное соотношение 1:1) функционируют в качестве направляющей РНК для этого протокола (рисунок 1A). В каждом эксперименте две синтетические направляющие РНК трансфектируются в клетки, индуцированные DOX, чтобы связать и сопровождать бактериальный белок Cas9 к геномным участкам ДНК (5' и 3'), фланкирующим область кластера миРНК, предназначенную для удаления (рисунок 1B).

Протоспейсерная смежная последовательность мотивов (PAM) (5'-NGG-3' для дикого типа S. pyogenes Cas9) должна присутствовать в геноме клетки и располагаться непосредственно рядом с последовательностью ДНК 20 нт, на которую нацелена направляющая РНК17. Последовательность PAM служит связующим сигналом и позиционирует каталитическую область фермента эндонуклеазы Cas9 на целевом геномном участке ДНК, что впоследствии приводит к направленному, двухцепочечному (ds) расщеплению ДНК, расположенному ~ 3 nt вверх по течению от PAM. Механизм репарации ДНК клетки восстанавливает расщепленные концы ДНК, что может привести к идеальной перевязке, но часто происходит негомологичное соединение конца (NHEJ), вызывая небольшие вставки или делеции (indels) в месте ремонта. Поскольку миРНК являются некодирующими генами, часто расположенными в межгенных и интронных областях, эти индели несут низкий риск создания нежелательных бессмысленных мутаций.

Используя синтетические олигонуклеотиды РНК (отожженные crRNA и tracrRNA, молярное соотношение 1:1), кодирующие комплекс направляющей РНК в этих экспериментах, эта стратегия нокаута генов позволяет избежать трудоемкого субклонирования векторов ДНК и обеспечивает огромную гибкость в трансфекции уникальных комбинаций направляющих РНК в клетки в формате 24 лунки. Подготовка сырых клеточных лизатов для скрининга генотипа ПЦР также позволяет избежать дорогостоящих и трудоемких методов очистки ДНК, обеспечивая при этом оптимизированную генерацию одноколониальных клеточных линий и фенотипический анализ. Действительно, этот высокопроизводительный протокол редактирования генов CRISPR был успешно использован для трансфекции культивируемых клеточных линий рака предстательной железы (LNCaP, PC3-ML) с 32 уникальными комбинациями направляющих РНК в одном эксперименте и генерации нокаутирующих линий, несущих делеции для всей кластерной области ~ 35 кб miR-888; меньшие комбинации делеций для членов кластера miR-888, принадлежащих к семействам miR-743 и miR-891a; а также делеции для отдельных членов miRNA в кластере miR-888. Подобные исследования обеспечат более четкое представление о том, как кластерные миРНК функционируют совместно для регулирования роста опухоли, агрессивности и лекарственной устойчивости, прежде чем переводить миРНК в клинику в качестве терапевтических и диагностических инструментов.

протокол

1. Подготовка к редактированию генов CRISPR и руководство проектированием РНК для генерации нокаутирующих клеточных линий кластера миРНК

  1. Создайте файл ДНК, содержащий полную геномную последовательность интересующей кластерной области миРНК (интергенной, интронной) и, по меньшей мере, 1 КБ окружающих геномных областей, используя программу19 для аннотирования последовательностей ДНК.
    1. Используйте инструмент редактирования признаков в созданном файле ДНК для маркировки целевого локуса кластера миРНК (интергенного, интронного) и каждой отдельной последовательности шпильки миРНК, принадлежащей кластеру миРНК, а также для обозначения других близлежащих кодирующих и некодирующих генов и/или регуляторных признаков 5,20,21,22.
    2. Убедитесь, что области миРНК, предназначенные для делеции, непреднамеренно не нарушают близлежащие гены, кодирующие белок, некодирующие гены или важные регуляторные элементы ДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрим геномную сложность (например, дупликации/слияния хромосом) клеточной линии, используемой в этом протоколе.
  2. Разработка синтетических crРНК, нацеленных на 20 nt геномной последовательности ДНК, фланкирующей весь кластер miRNA, отдельные области miRNA шпильки (pre-miRNA) и / или подмножеств генов miRNA в кластере, используя биоинформационный инструмент программного обеспечения для проектирования направляющей РНК (например,23). Убедитесь, что соответствующий фермент Cas9 отмечен в инструменте проектирования направляющей РНК (т.е. S. pyogenes Cas9).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Синтезированная crRNA будет содержать эту уникальную 5'-концевую 20 nt направляющую последовательность (комплементарную к мишени ДНК), за которой следует инвариант 22 nt S. pyogenes повторная последовательность для обеспечения спаривания оснований с синтезированным универсальным олигонуклеотидом тракрРНК. Отожженные вместе, они будут функционировать как направляющая РНК в этом протоколе.
    1. Ссылаясь на созданный файл ДНК (шаг 1.1.), введите ~150 нт последовательности ДНК, находящейся непосредственно вверх по течению (5') или вниз по течению (3') от заколки/локуса кластера миРНК, предназначенного для делеции, в биоинформационное руководство по проектированию РНК программного инструмента23.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инструмент проектирования будет идентифицировать уникальные 20-нтовые последовательности для конструкции олигонуклеотидов crRNA, которые находятся непосредственно рядом с последовательностью PAM (на нецелевой цепи ДНК) (например, S. pyogenes Cas9 PAM sequence NGG). Ниже приведен пример конструкции crRNA, нацеленной непосредственно на участок выше (5') локуса гена mir-891a (в частности, 5A(891a), обсуждаемый в разделе репрезентативных результатов и таблице 1).
      1. Откройте руководство по проектированию РНК программного инструмента23.
      2. Введите имя 5A(891a) в окне Введите имя .
      3. В окне Enter a DNA sequence (Введите последовательность ДНК ) введите 150 nt геномной последовательности, находящейся непосредственно выше (5') гена-предшественника mir-891a : 5'-AAGAAAATATACATGCTGATAGTTACACAGG
        TTGTGAATAGTAAATTAGTATGTCATTTATTT
        TAGGTATTCAATGTTGCATAGTCATATTATA
        ATTACGTAGCTTCTTTTTTTTTTTTTTTTCTAGGTT
        CCCAAAGAGTCTACAAATGTTGTCT-3'
      4. Установите флажок Включить проверку специфичности , чтобы исключить сайты, удаленные от таргетинга, обнаруженные программой с помощью вычислений. Выберите подходящий организм (т.е. Человека [Homo sapiens]).
      5. Укажите правильный фермент Cas9 PAM, используемый для исследований, в данном случае Streptococcus pyogenes Cas9-PAM:NGG, для генерации следующих настроек по умолчанию: PAM относительно цели: После; Повторная последовательность: GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG; Относительно направляющей: 3; Длина целевой последовательности: 20; Сокращение относительно начала мишени 5': Sense 17 Anti-sense 17.
      6. Нажмите кнопку Далее , чтобы просмотреть результаты синтеза синтетической crRNA.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере предлагаемая синтезируемая crRNA распознает ДНК-мишень ATACATGCTGATAGTTACAC и будет расположена рядом с PAM:AGG.
    2. Обратитесь к файлу ДНК (созданному на шаге 1.1.), чтобы определить наилучшие потенциальные целевые последовательности crRNA 20 nt, которые находятся ближе всего к локусу миРНК, подлежащему удалению, и обладают наивысшей специфичностью для предполагаемой геномной мишени.
      1. Используйте вычислительные инструменты анализа вне таргетинга для оценки специфичности креРНК-кандидата и прогнозирования потенциальных нецелевых участков в геномных локусах, не связанных с целевой областью кластера миРНК, представляющей интерес (например, 24,25,26,27).
      2. Запишите потенциальные результаты нецеленаправленности для последующего использования при генотипировании одноколониальных клональных клеточных линий CRISPR с помощью ПЦР (шаг 4.2.6.).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Степень комплементарности последовательностей, разделяемая между разработанным олигонуклеотидом crRNA и геномной целевой последовательностью, будет определять, насколько избирательно фермент Cas9 расщепляет геном в этом локусе. Поскольку направляющая РНК отжигается к геномной мишени в направлении от 3' до 5', несоответствия на 5' конце последовательности мишени ДНК (первые 8-10 оснований) часто блокируют Cas9-опосредованное расщепление. Если геномная целевая последовательность разделяет гомологию с другим геномным локусом, за исключением первых восьми оснований последовательности ДНК, прогнозируется, что эта направляющая РНК имеет низкую вероятность отклонения от нацеливания на этот участок.
      3. Разработать четыре уникальные crRNAs для каждого целевого локуса miRNA: два разработанных crРНК для нацеливания на комплементарные последовательности ДНК непосредственно 5' шпильки/кластера миРНК (5'A, 5'B) и две разработанные crРНК для нацеливания на комплементарные последовательности ДНК непосредственно 3' шпильки/кластера миРНК (3'A, 3'B).
        ПРИМЕЧАНИЕ: При выполнении трансфекции CRISPR (в разделе 3) четыре возможные комбинации 5' и 3' направляющих пар РНК (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B) будут протестированы для каждого целевого локуса микроРНК, чтобы увеличить вероятность генерации успешных делеций локуса микроРНК в одном эксперименте.
      4. Используйте инструмент редактирования функций в созданном файле ДНК (шаг 1.1.), чтобы пометить целевую последовательность ДНК (с соседним PAM) для каждой разработанной crRNA, подлежащей синтезу.
  3. Проектирование и синтез праймеров ПЦР (вперед, назад), фланкирующих целевые области кластера миРНК для генотипирования клеточных линий CRISPR (и маркировка праймеров в созданном файле ДНК).
    1. Для генотипирования клеточных линий, несущих небольшие геномные делеции для тесно сгруппированных или отдельных миРНК, разработают праймеры ПЦР (вперед, назад), расположенные примерно по 150 bp на каждой стороне участка расщепления Cas9 / области нокаута, которые позволят обнаружить как дикий тип (~ 600 bp), так и нокаут (~ 300 bp) фрагменты ДНК в одной реакции ПЦР с помощью гелевого электрофореза.
    2. Для генотипирования клеточных линий, несущих большие геномные делеции для комбинаций предшественников миРНК или всего кластера миРНК, снова разрабатывают праймеры ПЦР (вперед, назад), расположенные примерно 150 bp на каждой стороне сайта расщепления / нокаута Cas9. Обратите внимание, что, если целевая делеция кластера миРНК охватывает >4 кб в длину, реакция ПЦР, скорее всего, обнаружит только меньший (~ 300 bp) нокаутирующий фрагмент ДНК, но не фрагмент ДНК дикого типа. Поэтому разработайте дополнительные праймеры ПЦР (вперед, в обратном направлении), которые могут обнаруживать наличие или отсутствие внутренних генов кластера миРНК, чтобы помочь процессу скрининга и проверить гомозиготные нокаутирующие клеточные линии.

2. Генерация стабильных лентивирусных клеточных линий, несущих DOX-индуцируемую cassette Cas9

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните всю работу с клеточными культурами и вирусами в сертифицированном вытяжке биобезопасности с использованием процедур BSL2 и асептической техники.

  1. Определите подходящий тип клеточной линии для исследований CRISPR и предпочтительные питательные среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был разработан для клеточных линий рака предстательной железы человека LNCaP (предпочтительная среда: RPMI, 10% фетальная бычья сыворотка [FBS]) и PC3-ML (предпочтительная среда: DMEM, 10% FBS).
  2. Выполните кривую «смерти» бластицидина, чтобы определить оптимальную концентрацию препарата для выбора инфицированных лентивирусом клеток, несущих кассету гена резистентности к бластицидину (шаг 2.3.).
    1. Пластинчатые ячейки входят в 11 скважин 24-луночной плиты и растут при 37 °C, 5% CO2 в предпочтительной среде до приблизительно 75% слива.
    2. Бластицидин (рабочий материал 1 мг/мл) разбавляют в предпочтительной среде с конечной концентрацией в диапазоне от 0, 1 до 10 мкг/мл и разбавляют с шагом 1 мкг/мл.
    3. Маркируйте колодцы засеянной 24-луночной плитой от 1 до 11. Удалите питательную среду из скважин и замените соответствующими концентрациями бластицидина.
    4. Менять среду с соответствующими концентрациями бластицидина через день в течение 7-10 дней.
    5. Исследуйте клетки ежедневно в течение временного курса и определите минимальную концентрацию бластицидина, необходимую для уничтожения всех клеток в течение 5-7 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кривая «убийства» бластицидина должна быть выполнена для каждой конкретной клеточной линии, используемой для экспериментов по редактированию генов CRISPR.
  3. Инфицировать клетки лентивирусом, несущим DOX-индуцируемую cassette cassed Cas9, и выполнять отбор бластицидина с использованием оптимальной концентрации, определенной на этапе 2.2.
    1. В трех лунках 6-луночной пластины семена 5 × 104 ячейки на скважину и растут в предпочтительной среде при 37 °C, 5% CO2 в течение ночи (ON).
    2. На следующий день разморозьте вектор экспрессии лентивируса для DOX-индуцируемого Cas9 (Lenti-iCas9) на льду. Осторожно перемешать (не вихрять вирусные частицы).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните лентивирус в аликвотах при -80 °C, чтобы избежать многократных циклов замораживания/ оттаивания, которые уменьшат титры вируса и эффективность инфекции.
    3. Рассчитайте объем, необходимый для трансдукции 5 × 104 клеток с вирусом при кратности заражения 0,3 (MOI = 0,3) на основе концентрации вирусного титра.
    4. Пипетируйте соответствующий объем вируса в 250 мкл (на лунку) предпочтительной среды без сыворотки и антибиотиков, дополненной 0,8 мкг/мл гексадиметрина бромида. Аккуратно перемешать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гексадиметрин бромид представляет собой катионный полимер, который, как установлено, повышает адсорбцию вируса и эффективность инфекции.
    5. Извлеките носитель. Добавьте к клеткам 250 мкл подготовленной трансдукционной среды с вирусом Lenti-iCas9 (MOI = 0,3) и инкубируйте ON при 37 °C, 5% CO2. (Сократите время инкубации до 4-6 ч, если клетки проявляют токсические эффекты, связанные с вирусом.)
    6. Замените среду свежей предпочтительной средой и дайте клеткам восстановиться в течение 1-2 дней.
    7. Выполняйте отбор бластицидина на инфицированных клетках в течение 10-14 дней, используя оптимальную концентрацию бластицидина, полученную из кривой «убийства», описанной в шаге 2.2.
      1. Параллельно выращивайте неинфицированные клетки в среде с оптимальной концентрацией бластицидина, которая будет использоваться в качестве положительного контроля для вирусного отбора.
    8. Меняйте среду, дополненную оптимальной концентрацией бластицидина каждые 3 дня в течение курса времени отбора, чтобы удалить мертвые клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Только клетки, которые выдержат селекцию бластицидина, будут интегрировать лентивирусный вектор.
    9. Разверните выбранные бластицидином клеточные линии Lenti-iCas9.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Записывайте номер прохода ячейки при каждом расширении.
      1. Заморозьте часть клеток Lenti-iCas9 в предпочтительной среде, дополненной 10% диметилсульфоксидом (DMSO) для длительного криовиального хранения.
      2. Проанализируйте часть клеток Lenti-iCas9 с помощью западного пятна 9, чтобыопределить клеточную линию, демонстрирующую наиболее надежные уровни белка Cas9, индуцируемые DOX (см. Шаг 2.3.).
  4. Выполните кривую концентрации доксициклина на недавно установленных клеточных линиях Lenti-iCas9, чтобы определить оптимальные условия для индукции белка Cas9.
    1. Установите четыре независимые 6-луночные пластины для каждой тестируемой клеточной линии для выполнения этого курса времени концентрации DOX. Плита 5 × 104 ячейки на лунку каждой 6-луночной плиты и расти при 37 °C, 5% CO2 в предпочтительной среде в течение 24 ч.
    2. Разбавляют DOX (рабочий материал 1 мг/мл) в предпочтительной среде с конечной кривой концентрации DOX в диапазоне от 0, 50, 100, 150, 250 до 500 нг/мл.
    3. Маркируйте колодцы каждой засеянной 6-луночной плиты от 1 до 6. Удалите среду и замените соответствующими концентрациями DOX. Вырастите пластины за 1-4 до следующих временных интервалов: 24 ч, 48 ч и 72 ч индукции DOX; и 120-часовой выход из DOX (первоначально 72-часовой DOX-индуцированный).
    4. Заготавливайте колодцы плиты в каждый момент времени, используя соответствующие методы (например, трипсинизацию). Храните гранулы ячейки при -80 °C. Обработайте клеточные гранулы в буфере RIPA для выделения лизата и анализа западного блоттинга Cas9.
      1. Запустите 40 мкг клеточного лизата для каждого образца курса DOX-индукции с использованием денатурирующего 4%-12% геля Bis-Tris и перенесите белки на иммуноблочную мембрану.
      2. Гибридизируйте мембрану иммуноблота с первичным антителом против Cas9 для обнаружения белка 160 кДа. Нормализуйте уровень Cas9 с помощью гена домашнего хозяйства, такого как GAPDH (37 кДа).
    5. Основываясь на результатах вестерн-блоттинга, определите оптимальную концентрацию DOX для индуцирования Cas9 в клеточных линиях Lenti-iCas9.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этот раз курс также покажет, насколько жестко выражение Cas9 регулируется через 120 часов после удаления DOX.
    6. Создание одноклеточных колоний для клеточных линий Lenti-iCas9, демонстрирующих надежную экспрессию белка Cas9 для оптимизации трансфекции CRISPR (в разделе 3).

3. Выполнение реакций CRISPR путем индукции Cas9 и трансфекции синтетической направляющей РНК клеток с использованием высокопроизводительного формата

ПРИМЕЧАНИЕ: Схема рабочего процесса показана на рисунке 1.

  1. На бумаге наметьте комбинации пар crRNA, которые будут трансфектированы в каждую лунку 24-луночной пластины, нацеленной на весь кластер miRNA, различные кластерные комбинации генов miRNA, а также отдельные члены кластера miRNA.
    1. На карте обозначьте четыре лунки на целевой локус миРНК. Каждая скважина представляет трансфекционную реакцию, с двумя уникальными crРНК, расположенными в 5' и 3' желаемого нокаутирующего геномного локуса миРНК и тракрРНК (отожженное молярное соотношение 1:1).
    2. Убедитесь, что каждая из четырех меченых скважин представляет собой уникальную пару crRNA для трансфекции (например, 5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конструкция двух 5' crRNAs и двух 3' crRNAs, фланкирующих каждый целевой локус миРНК (Секция 1), позволяет генерировать четыре возможные 5' и 3' направляющие пары РНК в трансфекционной реакции.
  2. Обложите клеточную линию Lenti-iCas9 при 5 x 104 ячейках/лунке 24-луночной пластины в предпочтительной среде, содержащей оптимизированную концентрацию DOX (определенную на этапе 2.4.). Выращивайте клетки в течение 24-48 ч при 37 °C, 5% CO2 , чтобы индуцировать экспрессию белка Cas9.
  3. Трансфектируйте клетки Lenti-iCas9 с помощью подготовленных 5' и 3' направляющих РНК.
    1. Восстанавливают синтезированные олигонуклеотиды крРНК и тракрРНК без нуклеазной водой до концентрации запаса 10 мкМ. Хранить при -80 °C в течение длительного времени.
    2. Пометить четыре 1,5 мл микроцентрифужных трубки на целевой локус миРНК на основе экспериментальной карты, разработанной на этапе 3.1., представляющей четыре возможные комбинации пар 5' и 3' crRNA (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B).
    3. В каждой пробирке смешайте молярное соотношение тракрРНК и уникальных crРНК (5' и 3') вместе, чтобы сформировать комплекс направляющей РНК 2 мкМ, используя следующую реакцию (конечный объем 10 мкл):
      1. Добавьте 2,5 мкл тракрРНК (запас 10 мкМ), 1,25 мкл 5' позиционированной crРНК (запас 10 мкМ), 1,25 мкл 3'позиционированной crРНК (10 мкМ запас) и 5 мкл 10 мМ TRIS-HCL pH 7,5 к 1,5 мл центрифужной трубки. Микроцентрифуга в течение 30 с при 16 000 × г для смешивания. Инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение 5 мин.
    4. К каждой пробирке добавляют 40 мкл восстановленной сывороточной среды (например, Opti-MEM) к 10 мкл комплексной реакции направляющей РНК (общий объем 50 мкл). Аккуратно перемешайте, пипеткой вверх и вниз.
    5. В чистой центрифужной трубке объемом 1,5 мл смешайте 2 мкл трансфекционного реагента28 (см. ПРИМЕЧАНИЕ 3.3.5.1.) и 48 мкл восстановленной сывороточной среды (например, Opti-MEM, конечный объем 50 мкл) путем пипетирования вверх и вниз. Инкубировать на RT в течение 5 мин.
      1. Приготовьте мастер-смесь трансфекционного реагента путем умножения количества реагента (2 мкл) и восстановленной сывороточной среды (например, Opti-MEM, 48 мкл) на количество скважин, подлежащих трансфекции, плюс 10% дополнительного объема с учетом незначительных неточностей пипетирования.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите трансфекционный реагент, оптимизированный для малых РНК и CRISPR РНК олигонуклеотидных трансфектов, а также для клеточной линии типа28.
    6. К каждой пробирке, содержащей 50 мкл смеси направляющей РНК (из стадии 3.3.4.), добавляют 50 мкл разбавленного трансфекционного реагента (из стадии 3.3.5.). Пипетка смеси медленно вверх и вниз один раз, чтобы перемешать. Инкубировать в RT в течение 20 мин.
    7. Добавьте 400 мкл среды без антибиотиков, дополненной DOX (оптимальная концентрация), в каждую пробирку, содержащую 100 мкл направляющей смеси РНК/трансфекции. Пипетку аккуратно перемешать.
  4. Удалите среду из DOX-индуцированных клеток Lenti-iCas9 (шаг 3.2.). Добавьте 500 мкл смеси среды/ДОКС/направляющей РНК/трансфекции на основе экспериментальной карты 24-луночной пластины (Шаг 3.1.). Инкубируют трансфектированные клетки в течение 48 ч при 37 °C, 5% CO2.
  5. Замените среду свежей предпочтительной средой без DOX (чтобы очистить клетки белок Cas9). Дайте клеткам восстановиться еще 24-48 ч при 37 °C, 5% CO2.
  6. Собирают трансфектированные клетки (трипсинизация) и готовят к генотипированию и одноклеточным разведениям.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки представляют собой смешанную популяцию, содержащую трансфектированные генами CRISPR и нетрансфектированные клетки дикого типа. Этот шаг определит эффективность редактирования CRISPR перед инвестированием времени / ресурсов в расширение одноклеточной колонии.
    1. Промыть клетки 1 раз 1 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS). Инкубируют клетки в 100 мкл трипсина в течение 5 мин при 37 °C, 5% CO2 и переносят клетки в чистую центрифужную трубку объемом 1,5 мл, содержащую 1 мл среды.
    2. Инвертировать для смешивания и микроцентрифугирования клеток в течение 5 мин при 200 × г при 20 °C. Удалите среду и повторно суспендируйте ячейку гранулы в 1 мл PBS.
    3. Микроцентрифугируют промытые клетки в течение 5 мин при 200 × г при 20 °C. Удалите PBS и повторно суспендируйте ячейку гранулы в 150 мкл предпочтительной среды.
  7. Определите количество клеток на микролитр из 150 мкл повторно суспендированных клеток с помощью гемоцитометра или автоматизированного прибора для подсчета клеток.
  8. Разделите 150 мкл ресуспендированных клеток на три части.
    1. Заморозить 1/3 трансфектированных клеток (50 мкл) в среде плюс 10% ДМСО (конечный объем 150 мкл) в криовиалах для будущего расширения/длительного хранения.
    2. Переведите 1/3 трансфектированных клеток (50 мкл) в чистую ПЦР-трубку 0,2 мл для генотипирования.
      1. Микроцентрифугируют клетки в течение 5 мин при 200 × г при 4 °C и удаляют среду.
      2. Повторное суспендирование клеточной гранулы в 100 мкл PBS.
      3. Микроцентрифугируют клетки в течение 5 мин при 200 × г при 4 °C и удаляют PBS. Храните гранулы клеток смешанной популяции в течение длительного времени при -80 °C.
      4. Обработайте гранулу ячейки для генотипирования, используя рабочий процесс, описанный в разделе 4.
    3. Подготовьте конечную 1/3 клеток (50 мкл) для разбавления и покрытия в 96-луночном пластинчатом формате для получения одноклеточных колоний.
      1. Основываясь на количестве ячеек на этапе 3.7, рассчитайте разбавления, необходимые для достижения 10, 5, 2 и 1 ячейки (ячеек) в 100 мкл среды на скважину 96-луночной пластины.
      2. Используя 12-канальный мультипипетатор и стерильный резервуар реагентов, добавьте 100 мкл разбавленных ячеек на скважину в два ряда пластины (всего 24 скважины) для каждого разбавления (10, 5, 2 или 1 ячейка на скважину). Дайте 4-6 недель, чтобы клетки выросли до слияния для расширения одноклеточной колонии. Наблюдайте за клетками еженедельно под световым микроскопом и отмечайте, представляют ли колонии одно- или многоклеточные колонии.
      3. Соберите ~10-15 одноклеточных колоний для генотипирования (раздел 4). Определите, по крайней мере, три независимые, нокаутирующие, одноклеточные колониальные линии для каждого целевого локуса миРНК. Сохраняйте одноклеточные линии дикого типа в качестве элементов управления.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Количество скрининга будет зависеть от типа клеточной линии и влияния фенотипа нокаута миРНК на рост/жизнеспособность клеток.

4. Генотипирование ПЦР клеточных линий CRISPR с использованием сырых клеточных лизатов

  1. Добывайте отдельные, одноклеточные колонии из почти сливающихся колодцев плиты из 96 лунок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление среды/PBS, описанное на этих этапах, может быть выполнено вручную с использованием вакуумного аспиратора в шкафу биобезопасности, но будьте осторожны, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Используйте новый стерильный «желтый» 200-мкл пипетманный наконечник для каждой скважины 96-луночной пластины при аспирации, в котором каждый замененный желтый наконечник прочно помещается на конце стерильной стеклянной пастбищной пипетки, прикрепленной к вакуумному аспиратору.
    1. Промывайте колодцы 1x со 100 мкл PBS. Аспирировать PBS.
    2. Добавьте 50 мкл трипсина и инкубируйте в течение 2-5 мин при 37 °C, 5% CO2.
    3. Осторожно пипетируйте вверх и вниз и перенесите повторно суспендированные ячейки в центрифужную трубку объемом 1,5 мл, содержащую 1 мл среды.
    4. Инвертировать, чтобы перемешать и аккуратно гранулировать клетки в микроцентрифуге в течение 5 мин при 200 × г при 20 °C.
    5. Извлеките носитель и добавьте 1 мл PBS. Осторожно проведите трубкой, чтобы разрушить гранулу, и переверните несколько раз, чтобы перемешать.
    6. Микроцентрифугу в течение 5 мин при 200 × г при 20 °С гранулировать клетки.
    7. Удалите PBS и повторно суспендируйте гранулу в 300 мкл свежего PBS.
    8. Разделите образец объемом 300 мкл на две части.
      1. Перенесите 200 мкл клеток (2/3 гранулы) в скважину из 24-луночной пластины, содержащей 1 мл предпочтительной среды. Как только генотип будет проверен, используйте эти клетки для расширения CRISPR-опосредованных линий нокаут-клеток для функционального анализа.
      2. Переложите 100 мкл клеток (1/3 гранулы) в ПЦР-трубку 0,2 мл. Микроцентрифуга в течение 5 мин при 3 000 х г при 4 °C. Удалите PBS. Хранить гранулы при -80 °C.
  2. Подготовьте неочищенные клеточные лизаты для генотипирования и анализа последовательностей с помощью праймеров ПЦР, разработанных на этапе 1.3. Включите клеточные лизаты, приготовленные из нетрансфицированных клеток, в эти эксперименты для использования в качестве положительного контроля дикого типа.
    1. Повторно суспендируют клеточную гранулу в 4 мкл 5x ДНК-полимеразного буфера (см. Таблицу материалов, конечная концентрация 1x), 1 мкл протеиназы K (запас 20 нг/мл), 1 мкл РНКазы А (запас 10 нг/мл) и безнуклеазную воду до общего объема 20 мкл.
    2. Лизируйте клетки в термоциклере с помощью программы ПЦР: 56 °C в течение 30 мин и 96 °C в течение 5 мин. Хранить лизаты клеток при -20 °C.
    3. Выполняют реакцию ПЦР с использованием разработанных праймеров ПЦР (прямых, обратных), которые обрамляют направляющие РНК 5' и 3' направляющие РНК-таргетные участки (табл. 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Условия буфера ДНК-полимеразы и термоциклера будут зависеть от фермента ДНК-полимеразы Taq, используемого для реакции ПЦР. Этот протокол был оптимизирован для ДНК-полимеразы Phusion HF.
      1. Настройте реакционную смесь ПЦР на льду: 5 мкл 5x ДНК-полимеразного буфера, 0,5 мкл прямого ПЦР-праймера (запас 10 мкМ), 0,5 мкл праймера обратной ПЦР (запас 10 мкМ), 0,5 мкл 10 мМ дНТП, 0,25 мкл ДНК-полимеразы, 1-4 мкл клеточного лизата и безнуклеазная вода до общего объема 25 мкл.
      2. Запустите реакцию ПЦР в термоциклере с помощью программы: 98 °C в течение 3 мин и 35 циклов 98 °C в течение 10 с, 62 °C в течение 15 с, 72 °C в течение 15 с, а затем 72 °C в течение 10 мин. Держите при температуре 4 °C. ПРИМЕЧАНИЕ 4.2.3. над.
    4. Загрузите продукты ПЦР на 1% агарозный гель для анализа электрофореза.
    5. Извлеките ДНК из изолированных фрагментов ПЦР прогнозируемого молекулярного размера для нокаутных (и диких) генотипов. Подготовьте образцы для секвенирования ДНК.
    6. Подтвердите, что реакция CRISPR была успешной, и выполните секвенирование ДНК изолированных фрагментов ПЦР для идентификации места расщепления Cas9 и подтверждения делеции локуса миРНК.
      1. Изолируйте по крайней мере три независимые нокаутирующие клеточные линии для каждого локуса микроРНК, на который нацелен CRISPR. Сохраняйте клеточные линии дикого типа (и гетерозиготные) для использования в качестве контроля в последующих функциональных исследованиях.
      2. Выполните qRT-PCR или анализ северного пятна, чтобы подтвердить, что нокаутирующие клеточные линии не экспрессируют зрелую миРНК для удаленного локуса.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Секвенирование всего генома (WGS) является наиболее окончательным методом проверки редактирования генов CRISPR и нецеленаправленности.
      3. Тест на эффекты CRISPR с помощью ПЦР, которые были предсказаны вычислительно (Шаг 1.2.3.) 24,25,26,27.
      4. Если обширный скрининг одноклеточной колонии приводит только к гетерозиготным генотипам, повторите направляющую трансфекцию РНК в одноклеточных гетерозиготных линиях.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Невозможность получения гомозиготных нокаутных клеточных линий может указывать на летальные эффекты из-за потери миРНК или присущей ей геномной сложности (например, дупликации/слияния хромосом) родительской клеточной линии, которые требуют дальнейшего анализа.

Результаты

Этот высокопроизводительный протокол делеции CRISPR был успешно использован с использованием трансфекции Cas9-индуцируемых LNCaP и PC3-ML линий раковых клеток человека с синтетическими олигонуклеотидными направляющими РНК, нацеленными на кластер miR-888, которые были изучены в контексте рака пр?...

Обсуждение

Эта процедура редактирования генов CRISPR позволяет исследователю быстро генерировать целую панель клеточных линий, несущих уникальные комбинации делеции кластеров миРНК. Трансфекция синтетических направляющих РНК, состоящих из 5' и 3' геномных сайт-специфических цРНК, отожженных синте?...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Клеточные линии PC3-ML были любезно предоставлены Марком Стерном (Медицинский колледж Университета Дрекселя). Джастин Токси помогал в генотипировании ПЦР. Эта работа была поддержана грантом Фонда Бридана Адамса, Фондом трансляционных исследований Райана и грантом Совета по исследованиям в области здравоохранения Содружества (CHRB-274-11-20) для AE-K.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 mL PCR tubes, flat capFisher14-230-225Plasticware
1.5 mL Microcentrifuge TubesSeal-Rite1615-5500Plasticware
24-well tissue culture plateCorning Costar 09761146Plasticware
5x Phusion HF BufferThermo ScientificF-518LPCR reagent, genotyping
6-well tissue culture plateFisherFB012927Plasticware
96-well tissue culture plateFalcon08-772-2CPlasticware
Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonalAbCamab191468Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200
Antibiotic-Antimycotic (100x)Gibco15240062Tisuue culture reagent
BLAST nucleotide search engineNational Center for Biotechnology InformationNAFreeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov
Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenesCalbiochemCAS 589205CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water
Countess 3 Automated Cell CounterInvitrogenA50298Equipment; Cell counter
Cryogenic tubesThermo Scientific50001012Plasticware
Dharmacon CRISPR Design ToolHorizon Discovery Ltd.NAFreeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer
DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2Dharmacon, Inc.T-2002-02Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher BP231100Tisuue culture reagent
DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium PyruvateCorningMT10013CVTisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells
Doxycycline Hydrochloride, Ready Made SolutionSigma-AldrichD3072-1MLCRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water
DPBS, no calcium, no magnesiumGibco14190144Tisuue culture reagent
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designedDharmacon, Inc.U-002005-20CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides
Edit-R Modified Synthetic crRNA,
desalted/deprotected, 2 nmol		Dharmacon, Inc.crRNA-460XXXCRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides
EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 μL, 107 TU/mLDharmacon, Inc.VCAS11227CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system
Ensembl genomic viewerEnsemblNAFreeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences.
GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonalSanta Cruz Biotechnologysc25778Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500
Gel/PCR DNA Fragment Extraction KitIBI ScientificIB47010Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Gibco Fetal Bovine Serum, certifiedGibco16000044Tisuue culture reagent
Hexadimethrine bromideMilliporeSigmaH9268CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL
Immobilon-FL PVDF MembraneMilliporeSigmaIPFL10100Western blot reagent; nitrocellulose
Intercept (TBS) Blocking BufferLI-COR927-60001Western blot reagent
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary AntibodyLI-COR926-68070Western blot reagent
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary AntibodyLI-COR926-32211Western blot reagent
MicrocentrifugeEppendorf 5425 RPlasticware
miRBase microRNA viewermiRBaseNAFreeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb.
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-wellInvitrogenNP0321BOXWestern blot reagent
Odyssey CLx Imaging SystemLI-CORCLxEquipment; Western blot imaging
Opti-MEM Reduced Serum MediumGibco31985062Transfection reagent
Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis SystemOwlD2-BPEquipment; Nucleic acid gel electrophoresis system
PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides)Integrated DNA TechnologyNAPCR reagent, genotyping
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL)Thermo ScientificF530SPCR reagent, genotyping
RIPA Lysis Buffer 10xMilliporeSigma20-188Western blot reagent
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA gradeInvitrogen25530049PCR reagent, genotyping
RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL)Thermo ScientificEN0531PCR reagent, genotyping
RPMI 1640 MediumGibcoMT10041CVTisuue culture reagent; Media for LNCaP cells
SnapGene ViewerSnap GeneNAFreeware; website: [snapgene.com] Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which  highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features
TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol redGibco12563029Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin
UltraPure AgaroseInvitrogen16500100Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Veriti 96-Well Fast Thermal CyclerThermoFisher Scientific4375305Equipment
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis SystemInvitrogenEI0001Equipment; Protein gel electrophoresis system

Ссылки

  1. Hasegawa, T., Lewis, H., Esquela-Kerscher, A., Laurence, J. . Translating MicroRNAs to the Clinic. , 329-369 (2017).
  2. Lewis, H., Esquela-Kerscher, A., Thiagalingam, S. . Systems Biology of Cancer. , 134-153 (2015).
  3. Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs - microRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
  4. Breving, K., Esquela-Kerscher, A. The complexities of microRNA regulation: mirandering around the rules. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (8), 1316-1329 (2010).
  5. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, 154-158 (2008).
  6. Kabekkodu, S. P., et al. Clustered miRNAs and their role in biological functions and diseases. Biological Reviews. 93 (4), 1955-1986 (2018).
  7. Xiang, J., Wu, J. Feud or friend? The role of the miR-17-92 cluster in tumorigenesis. Current Genomics. 11 (2), 129-135 (2010).
  8. Aqeilan, R. I., Calin, G. A., Croce, C. M. miR-15a and miR-16-1 in cancer: discovery, function and future perspectives. Cell Death & Differentiation. 17 (2), 215-220 (2010).
  9. Hasegawa, T., et al. Characterization and evidence of the miR-888 cluster as a novel cancer network in prostate. Molecular Cancer Research. , (2018).
  10. Lewis, H., et al. miR-888 is an expressed prostatic secretions-derived microRNA that promotes prostate cell growth and migration. Cell Cycle. 13 (2), 227-239 (2014).
  11. Xu, J., et al. Evidence for a prostate cancer susceptibility locus on the X chromosome. Nature Genetics. 20 (2), 175-179 (1998).
  12. Schleutker, J., et al. A genetic epidemiological study of hereditary prostate cancer (HPC) in Finland: frequent HPCX linkage in families with late-onset disease. Clinical Cancer Research. 6 (12), 4810-4815 (2000).
  13. Farnham, J. M., Camp, N. J., Swensen, J., Tavtigian, S. V., Albright, L. A. Confirmation of the HPCX prostate cancer predisposition locus in large Utah prostate cancer pedigrees. Human Genetics. 116 (3), 179-185 (2005).
  14. Brown, W. M., et al. Hereditary prostate cancer in African American families: linkage analysis using markers that map to five candidate susceptibility loci. British Journal Of Cancer. 90 (2), 510-514 (2004).
  15. Bochum, S., et al. Confirmation of the prostate cancer susceptibility locus HPCX in a set of 104 German prostate cancer families. Prostate. 52 (1), 12-19 (2002).
  16. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
  17. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  18. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  19. . SnapGene® software (from Insightful Science; available at snapgene.com) Available from: https://www.snapgene.com (2022)
  20. . Ensembl Release 104 genome browser (from EMBL-EBI) Available from: https://www.ensembl.org (2022)
  21. Howe, K. L., et al. Ensembl 2021. Nucleic Acids Research. 49, 884-891 (2021).
  22. . miRBase: the microRNA database, Release 22.1 (from Griffiths-Jones laboratory) Available from: https://www.mirbase.org (2022)
  23. . Dharmacon CRISPR Design Tool (from Dharmacon) Available from: https://www.horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer (2022)
  24. . Off-Spotter (Venetia Pliatsika & Isidore Rigoutsos of the Jefferson Computational Medicine Center) Available from: https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/ (2022)
  25. Bao, X. R., Pan, Y., Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. Tools for experimental and computational analyses of off-target editing by programmable nucleases. Nature Protocols. 16 (1), 10-26 (2021).
  26. . Dharmacon DharmaFECT Transfection Reagent Cell Type Guide. Choose Dharmacon DharmaFECT 1, 2, 3, or 4 for optimal transfection of siRNA or miRNA reagents Available from: https://horizondiscovery.com/-/media-Files/Horizon/resources/Selection-guides/dharmafect-cell-type-guidelines.pdf (2022)
  27. Baffoe-Bonnie, A. B., et al. A major locus for hereditary prostate cancer in Finland: localization by linkage disequilibrium of a haplotype in the HPCX region. Human Genetics. 117 (4), 307-316 (2005).
  28. Zhang, R., Peng, Y., Wang, W., Su, B. Rapid evolution of an X-linked microRNA cluster in primates. Genome Research. 17 (5), 612-617 (2007).
  29. Ohnuki, Y., Marnell, M. M., Babcock, M. S., Lechner, J. F., Kaighn, M. E. Chromosomal analysis of human prostatic adenocarcinoma cell lines. Cancer Research. 40 (3), 524-534 (1980).
  30. Beheshti, B., Karaskova, J., Park, P. C., Squire, J. A., Beatty, B. G. Identification of a high frequency of chromosomal rearrangements in the centromeric regions of prostate cancer cell lines by sequential giemsa banding and spectral karyotyping. Molecular Diagnosis. 5 (1), 23-32 (2000).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

182CRISPRCas9miR 888

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены