用于微RNA簇网络分析的CRISPR基因编辑工具

摘要

该协议描述了用于microRNA聚类网络分析的高通量簇规则间隔短回文重复（CRISPR）基因编辑工作流程，允许在单个实验中快速生成一组携带独特miRNA簇成员缺失组合的转基因细胞系。

摘要

微RNA（miRNA）已成为癌症和转移的重要细胞调节因子（肿瘤抑制因子，促致癌因子）。大多数已发表的研究在表征小RNA在癌症中的作用时都集中在单个miRNA上。然而，约30%的人miRNA基因被组织在通常共表达的簇状单元中，表明非编码RNA调控系统复杂且协调。在将非编码小RNA翻译到临床之前，需要更清楚地说明簇状miRNA网络如何协同工作以调节肿瘤生长，癌症侵袭性和耐药性。

使用高通量簇有规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）介导的基因编辑程序已被用于研究位于前列腺癌背景下长度约为35，000 bp的位点内的七个miRNA基因的基因组簇的致癌作用。对于这种方法，人类癌细胞系被多西环素（DOX）诱导的Cas9核酸酶的慢病毒载体感染，该载体在含DOX的培养基中生长48小时。随后，这些细胞与合成的反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）共转染，并与基因组位点特异性CRISPR RNA（crRNA）寡核苷酸复合，以允许在单个实验中快速产生携带整个miRNA簇缺失和单个或组合miRNA基因簇缺失的癌细胞系。

这种高通量基因编辑系统的优点是能够避免耗时的DNA载体亚克隆，灵活地以24孔格式使用独特的引导RNA组合转染细胞，以及使用粗细胞裂解物进行低成本的PCR基因分型。使用这种简化方法的研究有望揭示miRNA集群成员之间的功能冗余和协同/拮抗相互作用，这将有助于表征涉及人类疾病的复杂小型非编码RNA网络，并更好地为未来的治疗设计提供信息。

引言

需要更好的研究工具来研究非编码RNA对人类疾病的贡献。在比较癌症患者组织和体液（例如血液、尿液）中这些小的非编码RNA的表达谱与非癌、健康个体的表达谱时，通常观察到MiRNA失调，采用微阵列、定量实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和下一代深度测序技术^1，2.最近的工作将这些miRNA的很大一部分表征为肿瘤抑制因子，致癌因子和转移因子，可控制肿瘤形成，疾病进展和耐药性。miRNA的实验性过表达和/或下调/丢失导致细胞中的功能性和多效性后果，反映了这些非编码RNA协调的广泛癌症相关活动 - 生长，细胞凋亡，分化，染色质重塑，血管生成，上皮至间充质（EMT）和MET过渡，代谢和免疫反应³。

MiRNA被编码为单个基因或驻留在基因组簇中，这些基因组簇在细胞核中转录并广泛处理，然后产生生物成熟的单链~22个核苷酸（nt）miRNA物种，这些物种位于细胞质⁴中。这些小RNA在转录后发挥其作用，并充当负基因调节剂，以序列特异性方式与信使RNA（mRNA）靶标结合，将催化RNA诱导的沉默复合物（RISC）带到mRNA位点，导致mRNA降解和/或蛋白质翻译中的阻断。MiRNA是动物系统中一类极其丰富的非编码RNA，人类基因组中存在2，654个成熟的miRNA（miRBase版本22.1）⁵。MiRNA通常与它们的mRNA靶标⁴的不完全互补性相关。因此，单个miRNA可以调节数十到数百个不同的mRNA靶标，并在功能上影响大范围的生物途径。为了增加基于miRNA的机制的复杂性，单个mRNA可以由多个不同的miRNA调节。因此，研究miRNA失调如何破坏身体的稳态平衡并导致人类恶性肿瘤是具有挑战性的。

大多数已发表的研究在表征其在疾病事件中的作用时都集中在单个miRNA上。然而，约30%的人miRNA基因以簇状单元（通常为~10千碱基酶[kb]）组织，这些单元通常以相同的方向转录并共表达，表明非编码RNA调节的协调和复杂系统⁶。最大的多cistronic人miRNA簇是14q32簇，由54个miRNA前体组成。与人类癌症相关的最充分研究的簇状miRNA单元之一是miR-17-92多cistronic簇，由miR-17，miR-18a，miR-19a，miR-20a，miR-19b-1和miR-92-1组成，位于非编码RNA的内含子3 c13orf25内。miR-17-92簇在造血恶性肿瘤中频繁扩增，在实体瘤中过表达，在促进细胞周期进展、细胞凋亡和^{血管生成7}中已确立致癌作用。此外，位于非编码基因Leu2内含子内的肿瘤抑制性miR-15a和miR-16-1簇在白血病中常被删除，在大范围的癌症中下调，通过靶向抗凋亡基因BCL2和附加细胞周期进展基因⁸来阻断肿瘤生长。miR-888簇在高级别前列腺癌患者中升高，由位于人染色体Xq27.3^9，10上的七个miRNA基因（miR-892c，-890，-888，-892a，-892b，-891b和-^891a）组成。

HPCX1位点（遗传性前列腺癌，X连锁1）内的miR-888簇图谱跨越Xq27-2，通过对遗传性前列腺癌家族谱系^{11，12，13，14，15，29}的连锁分析确定。使用常规miRNA错表达工具（miRNA模拟物和反义抑制剂）对单个miR-888聚集成员的功能表征表明，这些miRNA在调节前列腺肿瘤生长^和侵袭方面起着重叠的作用9^，10。然而，这些实验方法并不容易研究多个miR-888簇成员如何在非编码RNA网络中协同作用或拮抗作用以控制组织稳态和癌症进展。使用高通量CRISPR基因编辑技术对所述简化方案进行修改，以分子解剖与人类癌症相关的miRNA簇（例如，miR-888簇），以弥合这一知识差距。

细菌脆皮和清脆皮相关（cas）基因介导对噬菌体的适应性免疫¹⁶。这种古老的原体细胞监测系统的发现很快被改编为一种有效的科学工具，可以轻松靶向任何所需的基因组位点，并在体外和体内的各种动物系统和细胞类型中进行DNA序列改变^16，17。这项技术作为在人类疾病背景下询问miRNA网络的有效方法，具有很大的前景。为此，构建了这种高通量CRISPR基因编辑方案，用于研究未朽人类前列腺癌细胞系（LNCaP，PC3-ML）中人类染色体X上跨越约35 kb的miR-888簇，以询问集群成员如何协调癌症进展途径。这种方法可以应用于表征任何miRNA簇，并允许研究人员在单个实验中快速生成携带整个miRNA簇缺失以及单个和组合miRNA基因簇缺失的人类细胞系。

在此过程中，建立携带多西环素（DOX）诱导的慢病毒表达系统的稳定细胞系，该系统使研究人员能够通过组成性DOX诱导启动子TRE3G控制化脓性链球菌CRISPR相关内切酶Cas9（csn1）基因的表达。Tet-On 3G 二分系统涉及一个构成性人类伸长因子 1α （hEF1α） 启动子，以驱动 Tet-On 3G 基因和抗坏死因子基因 （Blast^R） 作为双子转录本的转录。Tet-On 3G 反式激活蛋白仅在 DOX 存在下与 TRE3G 启动子结合，从而产生强大的 Cas9 转录。在没有 DOX 的情况下，没有或非常小的基础 Cas9 表达。因此，研究人员可以在CRISPR基因编辑步骤期间诱导在补充DOX的培养基中生长的细胞中产生高Cas9蛋白，并在DOX戒断时控制快速清除CAS9蛋白。

该协议还描述了合成CRISPR RNA （crRNA）寡核苷酸的设计，靶向整个miRNA簇两侧的区域，单个miRNA发夹（premiRNA）区域和/或簇内miRNA基因的子集。每个设计的crRNA都包含一个独特的5'-末端20 nt引导序列（与目标目标基因组序列互补），然后是一个不变的22 nt 化脓性链球菌 重复序列（5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUUAGAGAAUCUUUUG-3'），可实现与通用反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）寡核苷酸¹⁸的碱基配对。退火的crRNA和曲克RNA（混合1:1比例）一起作为该方案的指导RNA（图1A）。在每个实验中，将两个合成引导RNA转染到DOX诱导的细胞中，以将细菌Cas9蛋白结合并护送到基因组DNA位点（5'和3'），位于靶向去除的miRNA簇区域的两侧（图1B）。

原空间器相邻基序（PAM）序列（5'-NGG-3'，用于野生 化脓性链球菌 Cas9）必须存在于细胞基因组中，并且位于指南RNA¹⁷靶向的20 nt DNA序列附近。PAM序列作为结合信号，并将内切酶Cas9酶的催化区域定位在靶向的基因组DNA位点上，随后导致位于PAM上游约3 nt的定向双链（ds）DNA切割。细胞的DNA修复机制修复切割的DNA末端，这可能导致完美的连接，但通常发生非同源末端连接（NHEJ），导致修复位点的小插入或缺失（插入）。由于miRNA是非编码基因，通常位于基因间和内源性区域，因此这些插入基因产生不需要的无意义/错义突变的风险很低。

通过在这些实验中采用合成RNA寡核苷酸（退火crRNA和tracrRNA，1:1摩尔比）编码引导RNA复合物，这种基因敲除策略避免了耗时的DNA载体亚克隆，并允许在将独特的引导RNA组合转染为24孔格式的细胞时具有极大的灵活性。制备用于PCR基因型筛选的粗细胞裂解物还避免了昂贵且耗时的DNA纯化方法，同时允许简化单集落细胞系生成和表型分析。事实上，这种高通量CRISPR基因编辑方案已成功用于在单个实验中转染具有32种独特引导RNA组合的培养前列腺癌细胞系（LNCaP，PC3-ML），并生成带有整个~35 kb miR-888簇区域缺失的敲除线;属于 miR-743 和 miR-891a 家族的 miR-888 集群成员的较小删除组合;以及 miR-888 簇中单个 miRNA 成员的缺失。像这样的研究将更清楚地说明聚集性miRNA如何合作调节肿瘤生长，侵袭性和耐药性，然后再将miRNA作为治疗和诊断工具转移到临床。

研究方案

1. 制备CRISPR基因编辑并指导RNA设计以生成miRNA簇敲除细胞系

1. 使用DNA序列注释软件程序¹⁹创建包含感兴趣的miRNA簇区域（基因间，内旋）和至少1 kB周围基因组区域的完整基因组序列的DNA文件。
   1. 使用创建的DNA文件中 的特征 编辑工具标记目标miRNA簇位点（基因间，导入）和属于miRNA簇的每个单独的miRNA发夹序列，并记录其他附近的编码和非编码基因和/或调节特征^{5，20，21，22}。
   2. 确保靶向删除的miRNA区域不会无意中破坏附近的蛋白质编码基因、非编码基因或重要的调节DNA元件。
      注意:考虑本方案中使用的细胞系的基因组复杂性（例如，染色体重复/融合）。
2. 使用生物信息学指南 RNA 设计软件工具（例如，²³).确保在指南RNA设计工具中标注适当的Cas9酶（即 S. pyogenes 卡斯9）。
   注意:合成的crRNA将包含这个独特的5'端20 nt引导序列（与DNA靶标互补），后跟不变的22 nt S. pyogenes 重复序列以允许与合成的通用tracrRNA寡核苷酸进行碱基配对。一起退火，它们将作为该协议中的指导RNA。
   1. 引用创建的DNA文件（步骤1.1.），输入位于miRNA发夹/簇位点的上游（5'）或下游（3'）的约150 nt DNA序列，以靶向删除到生物信息学指南RNA设计软件工具²³中。
      注意:该设计工具将识别用于crRNA寡核苷酸设计的唯一20 nt序列，这些序列位于PAM序列（非靶向DNA链上）附近（例如， 化脓性链 炎Cas9 PAM序列NGG）。下面提供的是针对 mir-891a 基因位点（特别是代表性结果部分和表1中讨论的5A（891a））上游（5'）位点的crRNA设计 示例。
      1. 打开指南RNA设计软件工具²³。
      2. 在"输入名称"窗口中输入名称 5A（891a）。
      3. 在 "输入 DNA 序列 "窗口中，输入位于 mir-891a 前体基因上游 （5'） 的 150 nt 基因组序列: 5'-阿加阿塔塔卡特加塔塔卡格
         TTGTGAATAGTAAATTAGTATGTCATTTATTT
         TAGGTTAATCAATGTTGCATATCATATTATA
         ATTACGTAGCTTCTTGTTTTTTTCTAGGTT
         CCCAAAGATCTACAAATGTTGTCT-3'
      4. 选中标记为 启用特异性检查 的框，以排除程序在计算上检测到的定位外网站。选择合适的生物体（即 人类 [智人]）。
      5. 指定用于研究的正确Cas9酶PAM，在这种情况下， 化脓性链球菌 Cas9-PAM:NGG，以生成以下默认设置:PAM相对于目标:之后;重复序列:咕咕咕相对于指南: 3;靶序列长度:20;相对于目标 5' 开始的切口:感觉 17 反感觉 17。
      6. 单击" 下一步 "按钮查看合成crRNA合成的结果。
         注意:在本例中，建议合成的 crRNA 将识别 DNA 靶标 ATACATGT加塔塔塔卡， 并将位于 PAM:AGG 附近。
   2. 参考DNA文件（在步骤1.1中创建）以确定最靠近要删除的miRNA位点的最佳候选crRNA 20 nt靶序列，并且对预期的基因组靶标具有最高的特异性。
      1. 使用计算脱靶分析工具评估候选crRNA特异性，并预测与目标miRNA聚类感兴趣区域无关的基因组位点中的潜在脱靶位点（例如，²⁴，^25，26，27）。
      2. 记录潜在的脱靶结果，以便以后在通过PCR对单菌落CRISPR克隆细胞系进行基因分型时参考（步骤4.2.6.）。
         注意:设计的crRNA寡核苷酸和基因组靶序列之间共享的序列互补性程度将决定Cas9酶在该位点切割基因组的选择性。由于引导RNA在3'到5'的方向上退火到基因组靶标，因此DNA靶标序列5'末端的不匹配（前8-10个碱基）通常会阻断Cas9介导的裂解。如果基因组靶序列与另一个基因组位点具有同源性，除了在DNA序列的前八个碱基内，则预计本指南RNA在该位点的脱靶率较低。
      3. 为每个靶向的miRNA位点设计四个独特的crRNA:两个设计的crRNA立即靶向互补的DNA序列，5'A，5'B）和两个设计的crRNA直接靶向互补的DNA序列，以立即靶向miRNA发夹/簇（3'A，3'B）的互补DNA序列。
         注意:在进行CRISPR转染（第3节）时，将针对每个靶向的miRNA位点测试四种可能的5'和3'指导RNA对组合（5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B），以增加在单个实验中产生miRNA位点成功缺失的可能性。
      4. 使用创建的DNA文件中 的特征 编辑工具（步骤1.1）标记每个要合成的crRNA的DNA靶序列（带有相邻的PAM）。
3. 设计和合成PCR引物（正向，反向）位于靶向miRNA簇区域的两侧，用于基因分型CRISPR细胞系（并在创建的DNA文件中标记引物）。
   1. 对于携带紧密簇状或单个miRNA的小基因组缺失的细胞系的基因分型细胞系，设计位于Cas9切割位点/敲除区域两侧约150 bp的PCR引物（正向，反向），以便能够通过凝胶电泳在单个PCR反应中检测野生型（~600 bp）和敲除（~300 bp）DNA片段。
   2. 对于携带miRNA前体组合或整个miRNA簇的大基因组缺失的细胞系的基因分型，再次设计位于Cas9裂解/敲除位点每侧约150 bp的PCR引物（正向，反向）。请注意，如果靶向miRNA簇缺失的长度跨越>4 kb，则PCR反应可能仅检测较小的（~300 bp）敲除DNA片段，而不会检测到野生型DNA片段。因此，设计额外的PCR引物（正向，反向）可以检测是否存在内部miRNA簇基因，以帮助筛选过程并验证纯合敲除细胞系。

2. 生成携带 DOX 诱导 Cas9 表达盒的稳定慢病毒细胞系

注意:使用BSL2程序和无菌技术在经过认证的生物安全罩中执行所有细胞培养和病毒工作。

1. 确定CRISPR研究和首选生长培养基的合适细胞系类型。
   注意:该方案是为人类前列腺癌细胞系LNCaP（首选培养基:RPMI，10%胎牛血清[FBS]）和PC3-ML（首选培养基:DMEM，10%FBS）开发的。
2. 执行卵泡肽"死亡"曲线，以确定为携带原始细胞灭虫素抗性基因盒的慢病毒感染细胞选择的最佳药物浓度（步骤2.3）。
   1. 将细胞板放入24孔板的11孔中，并在37°C，5%CO₂ 中优选培养基中生长，直到约75%汇合。
   2. 在优选培养基中稀释卵泡肽（工作储备1 mg / mL），最终浓度范围为0，1至10μg/ mL，并以1μg/ mL的增量稀释。
   3. 标记播种的24孔板的孔从1到11。从孔中取出生长培养基，并用适当的生黄溶蛋白浓度代替。
   4. 每隔一天用适当的生黄肽浓度更换培养基，持续7-10天。
   5. 在时间过程中每天检查细胞，并确定在5-7天内杀死所有细胞所需的最小卵泡肽浓度。
      注意:需要对用于CRISPR基因编辑实验的每种特定细胞系进行原始细胞蛋白"杀伤"曲线。
3. 用携带DOX诱导的Cas9表达盒的慢病毒感染细胞，并使用步骤2.2中确定的最佳浓度进行卵泡肽选择。
   1. 在6孔板的三个孔中，接种5×每孔10⁴ 个细胞，并在37°C，5%CO₂ 过夜（ON）的优选培养基中生长。
   2. 第二天，将 DOX 诱导的 Cas9 （Lenti-iCas9） 的慢病毒表达载体解冻在冰上。轻轻混合（不要涡旋病毒颗粒）。
      注意:将慢病毒在-80°C下等分试样储存，以避免多次冻融循环，这会降低病毒滴度和感染效率。
   3. 根据病毒滴度浓度，计算以0.3（MOI = 0.3）的感染多重度转导5×^{10 4} 个病毒细胞所需的体积。
   4. 将适当的病毒体积移液到250μL（每孔）无血清和无抗生素的首选培养基中，并补充0.8μg/ mL六聚二甲基溴化物。轻轻混合。
      注意:溴化六己二甲嘧啶是一种阳离子聚合物，可提高病毒吸附和感染效率。
   5. 取出培养基。将制备的250μL具有Lenti-iCas9病毒（MOI = 0.3）的转导培养基加入细胞中，并在37°C，5%CO₂下孵育。（如果细胞表现出与病毒相关的毒性作用，则将孵育时间缩短至4-6小时。
   6. 用新鲜的首选培养基替换培养基，让细胞恢复1-2天。
   7. 使用从步骤2.2中描述的"杀死"曲线衍生的最佳早稻肽浓度对受感染的细胞进行10-14天的先子糖选择。
      1. 同时，在具有最佳生毒肽浓度的培养基中生长未感染的细胞，以用作病毒选择的阳性对照。
   8. 在选择时间过程中每3天更换一次补充最佳卵泡肽浓度的培养基，以除去死细胞。
      注意:只有从卵泡糖选择中存活下来的细胞才会整合慢病毒载体。
   9. 扩展选择的原始细胞素的伦蒂-iCas9细胞系。
      注意:每次扩增时记录细胞传代数。
      1. 将一部分Lenti-iCas9细胞冷冻在优选的培养基中，补充10%二甲基亚砜（DMSO）用于长期冷冻储存。
      2. 通过蛋白质印迹9分析一部分Lenti-iCas9细胞，以鉴定表现出最稳定的DOX诱导Cas9蛋白水平的细胞系（参见步骤2.3）。
4. 在新建立的Lenti-iCas9细胞系上进行多西环素浓度曲线，以确定Cas9蛋白诱导的最佳条件。
   1. 为测试的每个细胞系设置四个独立的6孔板，以执行此DOX浓度时间过程。板5×每个6孔板的每孔10⁴ 个细胞，并在37°C，5%CO₂ 在优选培养基中生长24小时。
   2. 在首选培养基中稀释 DOX（工作储备 1 mg/mL），最终 DOX 浓度曲线范围为 0、50、100、150、250 至 500 ng/mL。
   3. 标记每个接种的6孔板的孔，从1到6。取出培养基，并更换为适当的 DOX 浓度。生长板1-4直到以下时间点:24小时，48小时和72小时DOX诱导;和DOX退出后120小时（最初72小时DOX诱导）。
   4. 使用适当的方法（例如胰蛋白酶消化）在每个时间点收获板的孔。将细胞沉淀储存在-80°C。 在 RIPA 缓冲液中处理细胞沉淀，用于裂解物分离和 Cas9 蛋白质印迹分析。
      1. 使用变性的4%-12%Bis-Tris凝胶为DOX诱导时间过程的每个样品运行40μg细胞裂解物，并将蛋白质转移到免疫印迹膜中。
      2. 将免疫印迹膜与针对Cas9的一抗杂交以检测160 kDa蛋白。使用管家基因（如 GAPDH （37 kDa））使Cas9水平正常化。
   5. 根据蛋白质印迹结果，确定在伦蒂-iCas9细胞系中诱导Cas9的最佳DOX浓度。
      注意:这一次的课程还将揭示Cas9表达在DOX移除后120小时受到的严格控制。
   6. 为显示稳健的 Cas9 蛋白表达的 Lenti-iCas9 细胞系建立单细胞集落，以优化 CRISPR 转染（第 3 部分）。

3. 使用高通量形式通过Cas9诱导和合成引导RNA转染细胞进行CRISPR反应

注意:工作流关系图如图 1 所示。

1. 在纸上，绘制出将转染到24孔板的每个孔中的crRNA对组合，靶向整个miRNA簇，各种簇状miRNA基因组合以及单个miRNA簇成员。
   1. 在地图上，标记每个靶向miRNA位点四个孔。让每个孔代表一个转染反应，将两个独特的crRNA定位为5'和3'的所需miRNA敲除基因组位点和traccrRNA（退火1:1摩尔比）。
   2. 确保四个标记孔中的每一个都代表一个用于转染的唯一crRNA对（例如，5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B）。
      注意:设计两个5'crRNA和两个3'crRNA位于每个靶向miRNA位点的两侧（第1部分），可以在转染反应中产生四个可能的5'和3'引导RNA对。
2. 将Lenti-iCas9细胞系置于含有优化DOX浓度（在步骤^2.4中测定）的首选培养基中的24孔板的5×10 4个细胞/孔中。在37°C，5%CO 2下培养细胞24-48小时以诱导Cas9蛋白表达。
3. 用制备的5'和3'引导RNA转染伦蒂-iCas9细胞。
   1. 用无核酸酶的水将合成的crRNA和traccrRNA寡核苷酸重构至10μM的储备浓度。
   2. 根据步骤3.1中设计的实验图谱，为每个靶向miRNA位点标记四个1.5 mL微量离心管，代表四种可能的5'和3'crRNA对组合（5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B）。
   3. 在每个试管中，使用以下反应（最终体积为10μL）将1:1摩尔比的tracrRNA和独特的crRNA（5'和3'）混合在一起，形成2μM引导RNA复合物:
      1. 将 2.5 μL 曲克RNA（10 μM 储备品）、1.25 μL 5' 定位的 crRNA（10 μM 储备品）、1.25 μL 3' 定位的 crRNA（10 μM 储备品）和 5 μL 10 mM TRIS-HCL pH 7.5 加入 1.5 mL 离心管中。微量离心30秒，以16，000× g 混合。在室温（RT）下孵育5分钟。
   4. 向每个试管中，向10μL引导RNA复合物反应（总体积50μL）中加入40μL还原血清培养基（例如Opti-MEM）。通过上下移液轻轻混合。
   5. 在干净的1.5 mL离心管中，通过上下移液轻轻混合2μL转染试剂²⁸（参见注3.3.5.1）和48μL还原血清培养基（例如Opti-MEM，最终体积为50μL）。在室温下孵育5分钟。
      1. 通过将试剂（2 μL）和减少的血清培养基（例如Opti-MEM，48 μL）量乘以要转染的孔数，加上10%的额外体积以考虑轻微的移液不准确，来制备转染试剂的预混液。
         注意:选择针对小RNA和CRISPR RNA寡核苷酸转染以及²⁸型细胞系进行优化的转染试剂。
   6. 向每个含有50μL引导RNA混合物的试管（从步骤3.3.4开始），加入50μL稀释的转染试剂（从步骤3.3.5开始）。将混合物缓慢上下移液一次以混合。在室温下孵育20分钟。
   7. 向含有100μL引导RNA/转染混合物的每个管中加入400μL补充有DOX（最佳浓度）的无抗生素培养基。轻轻移液以混合。
4. 从DOX诱导的伦蒂-iCas9细胞中取出培养基（步骤3.2.）。根据24孔板实验图谱（步骤3.1）加入500μL培养基/ DOX /指导RNA /转染混合物。将转染的细胞在37°C，5%CO₂下孵育48小时。
5. 用不含DOX的新鲜首选培养基替换培养基（以清除细胞中的Cas9蛋白）。让细胞在37°C，5%CO₂下再恢复24-48小时。
6. 收获转染的细胞（胰蛋白酶消化）并准备进行基因分型和单细胞稀释。
   注意:细胞代表包含转染的CRISPR基因编辑和未转染的野生型细胞的混合群体。此步骤将确定在投入时间/资源进行单细胞菌落扩增之前CRISPR编辑的效率。
   1. 用1mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞1x。将细胞在100μL胰蛋白酶中在37°C，5%CO₂ 下孵育5分钟，并将细胞转移到含有1mL培养基的干净的1.5mL离心管中。
   2. 反转以混合并在20°C下以200× g 微量离心细胞5分钟。 取出培养基并将细胞沉淀重悬于1mL PBS中。
   3. 在20°C下以200× g 微量离心洗涤的细胞5分钟。 除去PBS并将细胞沉淀重悬于优选培养基的150μL中。
7. 使用血细胞计数器或自动细胞计数仪确定150μL重悬细胞的每微升细胞数。
8. 将150μL重悬的细胞分成三部分。
   1. 在培养基中冷冻1/3转染细胞（50μL）加上10%DMSO（最终体积为150μL）在冷冻管中，以便将来扩增/长期储存。
   2. 将转染细胞的1/3（50μL）转移到干净的0.2mL PCR管中进行基因分型。
      1. 在4°C下以200× g 微量离心细胞5分钟并除去培养基。
      2. 将细胞沉淀重悬于100μLPBS中。
      3. 在4°C下以200× g 微量离心细胞5分钟并除去PBS。将混合群体细胞沉淀长期储存在-80°C。
      4. 使用第4节中的工作流程处理细胞沉淀以进行基因分型。
   3. 准备最终的1/3细胞（50μL）进行稀释并以96孔板形式接种以产生单细胞菌落。
      1. 根据步骤3.7.中的细胞计数，计算在96孔板的每孔100μL培养基中达到10，5，2和1个细胞所需的稀释度。
      2. 使用12通道多移液器和无菌试剂储液器，每次稀释（每孔10，5，2或1个细胞）将每孔100μL稀释细胞加入板的两排（总共24孔）。允许4-6周的细胞生长到汇合处以进行单细胞集落扩增。每周在光学显微镜下观察细胞，并注意菌落是否代表单细胞或多细胞集落。
      3. 收集约10-15个单细胞菌落进行基因分型（第4部分）。为每个靶向miRNA位点鉴定至少三个独立的敲除性单细胞集落系。保留野生型单细胞系作为对照。
         注意:筛选数量将取决于细胞系类型和miRNA敲除表型对细胞生长/活力的影响。

4. 使用粗细胞裂解物对CRISPR细胞系进行PCR基因分型

1. 从96孔板的近融合孔中收获单个单细胞菌落。
   注意:这些步骤中描述的介质/ PBS的去除可以使用生物安全柜中的真空吸气器手动进行，但要小心避免交叉污染。吸气时，对96孔板的每个孔使用新的无菌"黄色"200μL移液器吸头，其中每个交换的黄色吸头牢固地放置在连接到真空吸管的无菌玻璃牧场移液管的末端。
   1. 用100μLPBS洗涤孔1x。吸出公共广播公司。
   2. 加入50μL胰蛋白酶，并在37°C，5%CO 2下孵育_2-5分钟。
   3. 轻轻地上下移液，并将重悬的细胞转移到含有1mL培养基的1.5 mL离心管中。
   4. 倒置以混合并在20°C下以200× g 在微量离心机中轻轻沉淀细胞5分钟。
   5. 取出培养基并加入 1 mL PBS。轻轻轻拂管以破坏颗粒并反转几次以混合。
   6. 在20°C下以200× g 微量离心5分钟以沉淀细胞。
   7. 取出PBS并将沉淀重悬于300μL新鲜PBS中。
   8. 将300μL样品分成两部分。
      1. 将200μL细胞（沉淀的2/3）转移到含有1mL优选培养基的24孔板的孔中。一旦基因型被验证，使用这些细胞来扩展CRISPR介导的敲除细胞系以进行功能分析。
      2. 将100μL细胞（沉淀的1/3）转移到0.2mL PCR管中。在4°C下以3，000× g 微量离心5分钟。 删除公共广播公司。将沉淀储存在-80°C。
2. 使用步骤1.3中设计的PCR引物制备用于基因分型和序列分析的粗细胞裂解物。在这些实验中包括从未转染细胞制备的细胞裂解物，以用作野生型阳性对照。
   1. 将细胞沉淀重悬于4μL5x DNA聚合酶缓冲液（参见 材料表，终浓度1x），1μL蛋白酶K（20ng / mL储备），1μLRNase A（10ng / mL储备）和无核酸酶水，总体积为20μL。
   2. 使用PCR程序在热循环仪中裂解细胞:56°C持续30分钟，96°C持续5分钟。将细胞裂解物储存在-20°C。
   3. 使用设计的PCR引物（正向，反向）进行PCR反应，该引物位于引导RNA 5'和3'引导RNA靶向位点的两侧（表1）。
      注意:DNA聚合酶缓冲液和热循环仪条件将取决于用于PCR反应的Taq DNA聚合酶。该方案针对普西翁HF DNA聚合酶进行了优化。
      1. 在冰上设置PCR反应混合物:5μL 5x DNA聚合酶缓冲液，0.5μL正向PCR引物（10μM储备），0.5μL反向PCR引物（10μM储备），0.5μL10mM dNTPs，0.25μL DNA聚合酶，1-4μL细胞裂解物和无核酸酶水，总体积为25μL。
      2. 使用程序在热循环仪中运行PCR反应:98°C 3分钟，98°C循环35次10秒，62°C循环15秒，72°C15秒，然后72°C循环10分钟。保持4°C。 见注4.2.3。以上。
   4. 将PCR产物上样到1%琼脂糖凝胶上进行电泳分析。
   5. 从分离的PCR片段中提取DNA，该片段具有敲除（和野生型）基因型的预测分子大小。准备用于 DNA 测序的样品。
   6. 验证CRISPR反应是否成功，并对分离的PCR片段进行DNA测序，以鉴定Cas9裂解位点并确认miRNA位点缺失。
      1. 为CRISPR靶向的每个miRNA位点分离至少三个独立的敲除细胞系。保留野生型（和杂合子）细胞系，用作下游功能研究的对照。
      2. 进行qRT-PCR或北印迹分析，以确认敲除细胞系不表达缺失位点的成熟miRNA。
         注意:全基因组测序（WGS）是验证CRISPR基因编辑和脱靶的最明确方法。
      3. 通过PCR测试CRISPR脱靶效应，这是通过计算预测的（步骤1.2.3）。^{24，25，26，27}.
      4. 如果广泛的单细胞集落筛选仅导致杂合基因型，请在单细胞杂合子系中重复引导RNA转染。
         注意:无法获得纯合敲除细胞系可能表明由于miRNA丢失或亲本细胞系固有的基因组复杂性（例如染色体重复/融合）而需要进一步分析的致死作用。

结果

这种高通量CRISPR缺失方案成功地使用了Cas9诱导的LNCaP和PC3-ML人癌细胞系的转染，以及靶向miR-888集群的合成寡核苷酸指南RNA，这些RNA在前列腺癌的背景下进行了研究。miR-888簇最初在表达分析筛选中被鉴定为在患有高级别疾病的前列腺癌患者中升高，而低级别和非癌症患者^为9，10。miR-888簇跨越35，124 bp，由人类染色体Xq27.3上的七个miRNA（miR-892c，-890，-888，...

讨论

这种CRISPR基因编辑程序允许研究人员快速生成带有独特miRNA簇缺失组合的整个细胞系组合。由5'和3'基因组位点特异性crNA组成的合成引导RNA的转染与合成tracrRNA（1:1摩尔比）退火，在该方案中避免了耗时的质粒载体亚克隆，并允许使用24孔格式进行更灵活和高通量的实验设计。携带 DOX 诱导的 Cas9 慢病毒盒的细胞系的生成可在引导 RNA 的细胞转染期间实现严格 DOX 调节和稳健的 Cas9 表达，并在后续步?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tubes, flat cap	Fisher	14-230-225	Plasticware
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Seal-Rite	1615-5500	Plasticware
24-well tissue culture plate	Corning Costar	09761146	Plasticware
5x Phusion HF Buffer	Thermo Scientific	F-518L	PCR reagent, genotyping
6-well tissue culture plate	Fisher	FB012927	Plasticware
96-well tissue culture plate	Falcon	08-772-2C	Plasticware
Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonal	AbCam	ab191468	Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco	15240062	Tisuue culture reagent
BLAST nucleotide search engine	National Center for Biotechnology Information	NA	Freeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov
Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenes	Calbiochem	CAS 589205	CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water
Countess 3 Automated Cell Counter	Invitrogen	A50298	Equipment; Cell counter
Cryogenic tubes	Thermo Scientific	50001012	Plasticware
Dharmacon CRISPR Design Tool	Horizon Discovery Ltd.	NA	Freeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer
DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2	Dharmacon, Inc.	T-2002-02	Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher	BP231100	Tisuue culture reagent
DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Corning	MT10013CV	Tisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells
Doxycycline Hydrochloride, Ready Made Solution	Sigma-Aldrich	D3072-1ML	CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144	Tisuue culture reagent
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designed	Dharmacon, Inc.	U-002005-20	CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides
Edit-R Modified Synthetic crRNA, desalted/deprotected, 2 nmol	Dharmacon, Inc.	crRNA-460XXX	CRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides
EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 μL, 107 TU/mL	Dharmacon, Inc.	VCAS11227	CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system
Ensembl genomic viewer	Ensembl	NA	Freeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences.
GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonal	Santa Cruz Biotechnology	sc25778	Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500
Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit	IBI Scientific	IB47010	Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Gibco Fetal Bovine Serum, certified	Gibco	16000044	Tisuue culture reagent
Hexadimethrine bromide	MilliporeSigma	H9268	CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL
Immobilon-FL PVDF Membrane	MilliporeSigma	IPFL10100	Western blot reagent; nitrocellulose
Intercept (TBS) Blocking Buffer	LI-COR	927-60001	Western blot reagent
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-68070	Western blot reagent
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-32211	Western blot reagent
Microcentrifuge	Eppendorf	5425 R	Plasticware
miRBase microRNA viewer	miRBase	NA	Freeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb.
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well	Invitrogen	NP0321BOX	Western blot reagent
Odyssey CLx Imaging System	LI-COR	CLx	Equipment; Western blot imaging
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Gibco	31985062	Transfection reagent
Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis System	Owl	D2-BP	Equipment; Nucleic acid gel electrophoresis system
PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides)	Integrated DNA Technology	NA	PCR reagent, genotyping
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL)	Thermo Scientific	F530S	PCR reagent, genotyping
RIPA Lysis Buffer 10x	MilliporeSigma	20-188	Western blot reagent
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade	Invitrogen	25530049	PCR reagent, genotyping
RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL)	Thermo Scientific	EN0531	PCR reagent, genotyping
RPMI 1640 Medium	Gibco	MT10041CV	Tisuue culture reagent; Media for LNCaP cells
SnapGene Viewer	Snap Gene	NA	Freeware; website: [snapgene.com] Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which  highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features
TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red	Gibco	12563029	Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500100	Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler	ThermoFisher Scientific	4375305	Equipment
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System	Invitrogen	EI0001	Equipment; Protein gel electrophoresis system