تقييم كفاءة التمثيل الضوئي في الطفرات التنفسية الضوئية عن طريق تحليل الكلوروفيل الفلوري

Summary

وصفنا نهجا لقياس التغيرات في كفاءة التمثيل الضوئي في النباتات بعد المعالجة بانخفاض ثاني أكسيد الكربون₂ باستخدام مضان الكلوروفيل.

Abstract

يمثل البناء الضوئي والتنفس الضوئي أكبر تدفقات الكربون في التمثيل الغذائي الأولي للنبات وهما ضروريان لبقاء النبات. تمت دراسة العديد من الإنزيمات والجينات المهمة لعملية التمثيل الضوئي والتنفس الضوئي جيدا لعقود من الزمن ، ولكن بعض جوانب هذه المسارات الكيميائية الحيوية وحديثها المتبادل مع العديد من العمليات تحت الخلوية ليست مفهومة تماما بعد. تم إجراء الكثير من العمل الذي حدد الجينات والبروتينات المهمة في عملية التمثيل الغذائي للنبات في بيئات شديدة التحكم قد لا تمثل بشكل أفضل كيفية عمل التمثيل الضوئي والتنفس الضوئي في البيئات الطبيعية والزراعية. بالنظر إلى أن الإجهاد اللاأحيائي يؤدي إلى ضعف كفاءة التمثيل الضوئي ، فمن الضروري تطوير شاشة عالية الإنتاجية يمكنها مراقبة كل من الإجهاد اللاأحيائي وتأثيره على التمثيل الضوئي.

لذلك ، قمنا بتطوير طريقة سريعة نسبيا لفحص التغيرات الناجمة عن الإجهاد اللاأحيائي في كفاءة التمثيل الضوئي والتي يمكنها تحديد الجينات غير المميزة التي لها أدوار في التنفس الضوئي باستخدام تحليل مضان الكلوروفيل وفحص CO₂ المنخفض. يصف هذا البحث طريقة لدراسة التغيرات في كفاءة التمثيل الضوئي في طفرات خروج المغلوب المنقولة DNA (T-DNA) في Arabidopsis thaliana. يمكن استخدام نفس الطريقة لفحص الطفرات التي يسببها إيثيل ميثان سلفونات (EMS) أو فحص الكابت. يمكن أن يؤدي استخدام هذه الطريقة إلى تحديد الجينات المرشحة لمزيد من الدراسة في التمثيل الغذائي الأولي للنبات واستجابات الإجهاد اللاأحيائي. يمكن أن توفر البيانات من هذه الطريقة نظرة ثاقبة لوظيفة الجينات التي قد لا يتم التعرف عليها حتى التعرض لبيئات الإجهاد المتزايدة.

Introduction

يمكن أن تؤثر ظروف الإجهاد اللاأحيائي الشائعة في حقول المزارعين سلبا على غلة المحاصيل عن طريق تقليل كفاءة التمثيل الضوئي. يمكن أن تسبب الظروف البيئية الضارة مثل موجات الحرارة وتغير المناخ والجفاف وملوحة التربة ضغوطا غير أحيائية تغير توافر CO₂ وتقلل من استجابة النبات لإجهاد الضوء العالي. أكبر تدفقين للكربون الأرضي هما التمثيل الضوئي والتنفس الضوئي ، وهما ضروريان لنمو النبات وغلة المحاصيل. تم تمييز العديد من البروتينات والإنزيمات المهمة المشاركة في هذه العمليات في ظل ظروف المختبر وتم تحديدها على المستوى الجيني¹. على الرغم من إحراز تقدم كبير في فهم عملية البناء الضوئي والتنفس الضوئي ، إلا أن العديد من الخطوات ، بما في ذلك النقل بين عضيات النبات ، لا تزال غير مميزة ^2,3.

يبدأ التنفس الضوئي ، وهو ثاني أكبر تدفق كربوني في النباتات بعد عملية التمثيل الضوئي ، عندما يقوم إنزيم روبيسكو بتثبيت الأكسجين بدلا من ثاني أكسيد الكربون إلى ريبولوز 1,5 ثنائي الفوسفات (RuBP) ، مما يولد المركب المثبط 2-فوسفوجليكولات (2PG) ¹. لتقليل التأثيرات المثبطة ل 2PG وإعادة تدوير الكربون الثابت سابقا ، طورت نباتات C3 عملية التنفس الضوئي متعددة العضيات. يحول التنفس الضوئي جزيئين من 2PG إلى جزيء واحد من 3-فوسفوجليسرات (3PGA) ، والذي يمكن أن يدخل مرة أخرى في دورة تثبيت الكربون C3¹. وبالتالي ، فإن التنفس الضوئي يحول فقط 75٪ من الكربون الثابت سابقا من توليد 2PG ويستهلك ATP في هذه العملية. نتيجة لذلك ، فإن عملية التنفس الضوئي هي سحب كبير بنسبة 10٪ -50٪ على عملية التمثيل الضوئي ، اعتمادا على توافر المياه ودرجات حرارة موسم النمو⁴.

كانت الإنزيمات المشاركة في التنفس الضوئي مجالا للتركيز البحثي لعقود ، ولكن تم تمييز عدد قليل فقط من بروتينات النقل على المستوى الجيني ، على الرغم من مشاركة 25 خطوة نقل على الأقل في العملية⁵،^6،7. بروتينا النقل اللذان يشاركان بشكل مباشر في حركة الكربون المتولد في عملية التنفس الضوئي هما ناقل الجليكولات / الجليسرات PLGG1 وحمض الصوديوم الصفراوي BASS6 ، وكلاهما يشارك في تصدير الجليكولات من البلاستيدات الخضراء ^5,6.

تحت المحيط [CO₂] ، يقوم Rubisco بتثبيت جزيء الأكسجين إلى RuBP حوالي 20٪ من الوقت¹. عندما تتعرض النباتات لانخفاض [CO 2] ، تزداد معدلات التنفس الضوئي ، مما يجعل انخفاض [CO₂] بيئة مثالية لاختبار الطفرات التي قد تكون مهمة في ظل ضغط التنفس الضوئي المرتفع. أدى اختبار خطوط T-DNA الإضافية المفترضة لبروتين نقل البلاستيدات الخضراء تحت CO₂ المنخفض لمدة 24 ساعة وقياس التغيرات في مضان الكلوروفيل إلى تحديد خطوط نبات bass6-1 التي أظهرت نمطا ظاهريا^{متحورا للتنفس الضوئي 5}. أظهر التوصيف الإضافي أن BASS6 هو ناقل جليكولات في الغشاء الداخلي للبلاستيدة الخضراء.

تصف هذه الورقة بالتفصيل بروتوكولا مشابها لما تم استخدامه في البداية لتحديد BASS6 كناقل للتنفس الضوئي ، والذي جاء من قائمة بروتينات النقل المفترضة الموجودة داخل غشاء البلاستيدات الخضراء⁸ يمكن استخدام هذا البروتوكول في تجربة عالية الإنتاجية تميز طفرات Arabidopsis T-DNA أو النباتات الطافرة الناتجة عن EMS كطريقة لتحديد الجينات المهمة للحفاظ على كفاءة التمثيل الضوئي تحت مجموعة من الضغوط اللاأحيائية مثل الحرارة ، الإجهاد العالي للضوء والجفاف وتوافر CO₂ . تم استخدام طفرات النباتات باستخدام مضان الكلوروفيل في الماضي لتحديد الجينات المهمة لعملية التمثيل الغذائي الأولي^{بسرعة 9}. مع وجود ما يصل إلى 30٪ من جينوم Arabidopsis الذي يحتوي على جينات ترمز لبروتينات ذات وظيفة غير معروفة أو سيئة التوصيف ، يمكن أن يوفر التحليل الناجم عن الإجهاد لكفاءة التمثيل الضوئي نظرة ثاقبة للوظائف الجزيئية التي لم يتم ملاحظتها في ظل ظروف خاضعة للرقابة في النباتات الطافرة¹⁰. الهدف من هذه الطريقة هو تحديد طفرات المسار التنفسي الضوئي باستخدام فحص CO₂ منخفض. نقدم طريقة لتحديد الطفرات التي تعطل التنفس الضوئي بعد التعرض لانخفاض ثاني أكسيد الكربون₂. ميزة هذه الطريقة هي أنها فحص عالي الإنتاجية للشتلات يمكن إجراؤه في فترة زمنية قصيرة نسبيا. توفر أقسام بروتوكول الفيديو تفاصيل حول تحضير البذور وتعقيمها ، ونمو النبات ومعالجة CO₂ المنخفضة ، وتكوين نظام التصوير الفلوري ، وقياس العائد الكمي للعينات المعالجة ، والنتائج التمثيلية ، والاستنتاجات.

Protocol

1. إعداد البذور والتعقيم

ملاحظة: يتكون تحضير البذور من تشرب البذور وتعقيم البذور. من المهم ملاحظة أن كل هذه الخطوات يجب تنفيذها في غطاء تدفق رقائقي للحفاظ على ظروف معقمة. يجب تعقيم جميع المواد والكواشف ووسائط النمو الضرورية (انظر جدول المواد).

1. تشرب البذور والتقسيم الطبقي
   ملاحظة: خطوط البذور المستخدمة هي plgg1-1 (salk_053463) ، abcb26 (salk_085232) ، والنوع البري (WT ، Col-0).
   1. الاستغناء عن البذور في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل. اشرب البذور في ماء معقم في غطاء تدفق رقائقي وطبقي عند 4 درجات مئوية في الظلام لمدة 2 أيام.
2. تعقيم البذور
   1. في ظل ظروف معقمة ، قم بإعداد 10 مل من محلول التبييض بنسبة 50٪ (v / v) وأضف حوالي 20 ميكرولتر من Tween 20. لتعقيم البذور ، قم بإزالة الماء من البذور المشبعة ، وأضف 1 مل من محلول التبييض في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
   2. قم بإزالة محلول التبييض باستخدام ماصة.
   3. شطف البذور في 1 مل من الماء المعقم لإنعاش. قم بإزالة الماء بمجرد أن تستقر البذور في القاع. كرر الخطوتين 1.6 و1.7 سبع مرات.
   4. إعادة تعليق البذور في محلول غاروز معقم 0.1 ٪.
3. تصفيح البذور
   1. اصنع حجما 1 لتر من Murashige & Skoog Basal Medium بالفيتامينات و 1.0 جم / لتر من 2- (N-morphonio) حمض إيثان سلفونيك (MS) بإضافة 5.43 جم من المسحوق إلى 500 مل من الماء المقطر. اضبط الرقم الهيدروجيني بين 5.6 إلى 5.8 باستخدام هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH). املأ إلى 1 لتر باستخدام الماء المقطر.
      1. قسم المحلول السائل إلى 500 مل وضع كل نصف في دورق سعة 1 لتر يحتوي على قضيب تحريك مغناطيسي. أضف 5 جم من مسحوق الأجار للحصول على محلول أجار 1٪ لكل قارورة.
      2. الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية و 15 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 30 دقيقة ؛ ثم ضعيها في درجة حرارة الغرفة مع التحريك ببطء. عندما تبرد ، صب 25 مل من أجار MS في طبق بتري مربع. اسمح لها بالتصلب.
         ملاحظة: تحتوي ألواح موراشيج وسكوج القاعدية المتوسطة على 1٪ MS متوسط مع الفيتامينات و 1٪ أجار لزراعة طفرات الاختبار.
   2. قطع طرف ماصة 200 ميكرولتر بشفرة حلاقة. ضع بذرة واحدة في وسط الشبكة المربعة المخصصة لكل طافرة اختبار أو نمط وراثي (1 سم² مربع) من لوحة MS مربعة (الشكل 1) باستخدام ماصة دقيقة 200 ميكرولتر.
      ملاحظة: تساعد الشبكة المربعة 1 سم × 1 سم في الحفاظ على مسافة موحدة بين الشتلات وتجنب التداخل ، الأمر الذي سيكون مهما في التصوير والتحليل الفلوري اللاحق.
   3. بمجرد طلاء البذور ، لفها بشريط جراحي حول الغطاء لإغلاقها ، وضعها في غرفة النمو في الظروف الموضحة أدناه.

2. نمو النبات وانخفاض CO₂ العلاج

1. تنمو النباتات لمدة 7-9 أيام عند 20 درجة مئوية تحت دورة ضوئية 8 ساعات من 120 μmol · m − ²s ^{− 1} و 16 ساعة من الظلام عند 18 درجة مئوية. تحقق من النباتات في اليوم 6th لتحديد ما إذا كانت كبيرة بما يكفي للتصوير. في اليوم الثامن بعد الطلاء ، قم بتعريض النباتات لثاني أكسيد الكربون_{المنخفض 2}.
2. علاج انخفاض CO₂
   1. بعد 7-9 أيام ، ضع أربعة من الألواح الثمانية من ظروف غرفة النمو المحيطة في ظروف الجهاز التنفسي الضوئي من 20 درجة مئوية ، ومستويات الضوء المستمر من 200 μmol · m − 2 s ^{− 1} ، وانخفاض CO ²لمدة 12 ساعة.
   2. قم ببناء حالة CO₂ المنخفضة باستخدام حاوية شفافة محكمة الإغلاق مع 100 غرام من جير الصودا الموضوعة في قاع الحاوية. ضع الحاوية داخل نفس غرفة النمو مثل عنصر التحكم. حافظ على محطات التحكم تحت 120 ميكرومول · م − ²ثانية ^{− 1} في ثاني أكسيد الكربون_{المحيط لمدة} 12 ساعة.

3. تكوين نظام التصوير الفلوري

1. ضع لوحة اختبار (معدة وفقا للقسم 1 والقسم 2) في منتصف الكاميرا على مسافة ثابتة في نظام التصوير الفلوري.
2. داخل برنامج الجهاز ، انتقل إلى النافذة الحية وحدد المربع ومضات لتشغيل ومضات القياس غير النشطة.
3. انقر فوق أدوات التكبير والتركيز حتى تظهر صورة كاملة وحادة. تحقيقا لهذه الغاية ، استخدم مرحلة أو رف لضبط المسافة بين النباتات والكاميرا. حافظ على ثبات التكبير/التصغير والتركيز البؤري والمسافة من الكاميرا طوال التجربة بأكملها.
4. اضبط قيمة El. Shutter على 0 واضبط الحساسية للحصول على إشارة فلورسنت في نطاق 200-500 وحدة رقمية.
   ملاحظة: ستضمن قيمة الغالق El. الأقل (0-1) أن ومضات القياس غير أكتينية ، بينما ستعمل القيمة الأعلى (2) على تحسين دقة الصورة.
5. ضع مقياس الضوء في نفس الموضع المستخدم لضبط إعدادات الكاميرا.
6. في Live Window ، حدد المربع Super لبدء نبضة مشبعة تدوم لمدة 800 مللي ثانية. تذكر أن تضع علامة في المربع في كل مرة للحصول على نبض جديد.
7. استخدم شريط التمرير لضبط النسبة المئوية للطاقة النسبية للنبضة الفائقة حتى يقرأ مقياس الضوء 6000-8000 ميكرومول · م − ²ثانية ^{− 1}.

4. تصميم برنامج العائد الكمي

1. استيراد أدوات التشغيل القياسية لنظام التصوير.
   تضمين default.inc
   تضمين light.inc
   ملاحظة: بناء جملة البرنامج المستخدم كمرجع في هذه التجربة هو لنظام التصوير FluorCam.
2. حدد المتغيرات العامة التالية وفقا لإعدادات الإضاءة التي تم تكوينها:
   الغالق = 0
   الحساسية = 40
   سوبر = 65
3. قم بتضمين الخطوة الزمنية لتسجيل البيانات:
   TS = 20 مللي ثانية
4. اجمع قياس Fo عن طريق أخذ عينات مضان في حالة متكيفة مع الظلام.
   F0المدة = 2 ثانية ؛
   F0الفترة = 200 مللي ثانية ؛
   ملاحظة: يحدد F0duration النطاق الزمني الذي يتم خلاله تسجيل التألق المتكيف مع الظلام. تحدد F0period الفاصل الزمني الذي يتكرر خلاله قياس التألق المتكيف مع الظلام.
5. سجل قياسات Fo في جداول البيانات.
   <0,F0الفترة.. F0duration>=>mfmsub
   <0s>->checkpoint,"startFo"
   =>نقطة تفتيش,"endFo";
   حيث < ، يمثل > مجموعة قيم التألق المفهرسة حسب الوقت ؛ => يخزن القياسات في ملف النظام ؛ يمثل MFMSUB مجموعة البيانات الكاملة للتجربة ؛ ونقطة تفتيش ينشئ مجموعة فرعية لبيانات قياسات محددة مثل startFo.
6. جمع وتخزين قياس FM عن طريق أخذ عينات مضان بعد نبضة مشبعة.
   مدة النبض = 960 مللي ثانية ؛ ##
   a1 = F0المدة + 40 مللي ثانية
   A2 = A1 + 480 مللي ثانية ؛
   =>SatPulse(PulseDuration);
   = >mfmsub
   = > mfmsub ؛
   =>checkpoint,"startFm"
   = >نقطة تفتيش ، "endFm"
   =>checkpoint,"timeVisual";
   حيث a1 و a2 متغيران لتنسيق وقت أخذ العينات مع النبضة المشبعة ؛ يمثل a1 وقت بدء قياس Fm ؛ ويمثل A2 وقت منتصف نقطة النبض.

5. قياس العائد الكمي للعينات المعالجة

1. بعد العلاج مباشرة ، قم بتغطية الألواح بورق الألمنيوم لمدة 15 دقيقة للتكيف الداكن. قم بإزالة الرقاقة لقياس العائد الكمي للنظام الضوئي الثاني باستخدام مقياس فلوري معدل سعة النبضة. بعد ذلك ، ضع لوحة الشتلات مباشرة تحت الكاميرا وقم بتشغيل بروتوكول العائد الكمي الموجود في مستودع GitHub.
2. قم بتنزيل بروتوكول quantum_yield من GitHub (https://github.com/South-lab/fluorescent-screen) أو استخدم برنامجا مصمما بشكل مشابه من القسم 4. استخدم برنامج مقياس الفلور لفتح ملف البرنامج بالنقر فوق رمز المجلد والانتقال إلى موقع الملف.
3. قم بتشغيل برنامج العائد الكمي بالنقر فوق رمز البرق الأحمر.
4. بعد اكتمال البروتوكول ، انتقل إلى نافذة التحليل المسبق . قسم اللوحة إلى شتلات فردية باستخدام أدوات التحديد لتمييز كل وحدات البكسل لكل شتلة على صورة اللوحة. انقر فوق استبعاد الخلفية لإزالة أي وحدات بكسل خلفية مميزة، مع ترك منطقة الشتلات فقط.
5. انقر فوق تحليل لإنشاء بيانات مضان لكل شتلة على صورة اللوحة. اضبط نطاق قيمة التألق يدويا لعرض قيم دنيا وقصوى متسقة بين جميع اللوحات.
6. انقر فوق المتوسط العددي من علامة التبويب | التجربة تصدير | رقمي. حدد جميع البيانات وحسب العمود وانقر فوق موافق لإنشاء ملف نصي يحتوي على قياسات QY لكل شتلة.

6. فتح ملف البيانات

1. افتح الملف النصي في جدول بيانات لتحليله. من العناوين التي تظهر رقم المنطقة وحجم وحدات البكسل و Fm و Ft و Fq و QY ، حدد رقم المنطقة للنمط الجيني الأساسي (WT أو متحولة الاختبار) و QYmax. قم بإجراء اختبار t زوجي فيما يتعلق بالنوع البري لتحديد الأهمية. يتم تفسير البيانات على أنها مختلفة بشكل كبير عندما تكون قيم p أقل من 0.05.

النتائج

تظهر النتائج صور لوحة من الصور الخام والفلورية من فحص CO₂ المحيط والمنخفض ل WT واختبار الطفرات. يتم تمييز كل نبتة برقم المنطقة ، مع قراءات مضان مقابلة تعطى على أنها QY. يتم تصدير البيانات كملف نصي ويمكن فتحها في جدول بيانات لتحليلها (انظر الجدول التكميلي S1). تم اختيار الخطوط الطا...

Discussion

تأتي الطرق التجريبية الموضحة في هذه الورقة مع بعض المزايا والقيود. تتمثل إحدى المزايا في أن هذه الطريقة يمكنها فحص العديد من شتلات النباتات ، على الرغم من أنه يجب اتخاذ بعض الاحتياطات لمنع تلوث لوحة وسائط النبات أثناء عملية الطلاء والنمو. لذلك ، من الأهمية بمكان ختم ألواح Arabidopsis بشريط جراح...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	VWR	10810-070	container for seed sterilization
agarose	VWR	9012-36-6	chemical used to suspend seeds for ease of plating
Arabidopsis thaliana seeds (abcb26)	ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_085232	arabidopsis seeds used as experimental group
Arabidopsis thaliana seeds (plgg1-1)	ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_053469C	parental arabidopsis seeds
Arabidopsis thaliana seeds (WT)	ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org	Col-0	arabidopsis wild type seeds used as a control group
bleach	clorox	generic bleach	chemical used to sterilize seeds
Carbolime absorbent	Medline products	S232-104-001	CO2 absorbent
Closed FluorCam	Photon Systems Instruments	FC 800-C	Fluorescence imager
FluoroCam FC 800-C	Photon Systems Instruments	Closed FluorCam FC 800-C/1010-S	Fluorescence imager
FluoroCam7	Photon Systems Instruments	Closed FluorCam FC 800-C/1010-S	Fluorescence image analysis software
Gelzan (plant agar)	Phytotech labs	71010-52-1	chemical used to solidify MS media as plates
glass flask 1 L	Fisherbrand	FB5011000	container for making and autoclaving MS media
growth chamber	caron	7317-50-2	growth chamber used to grow plants
Murashige & Skoog Basal Medium with Vitamins & 1.0 g/L MES (MS)	Phytotech labs	M5531	growth media for arabidopsis seedlings
potassium Hydroxide (KOH)	Phytotech labs	1310-58-3	make as 1 M solution for ph adjustment
spider lights	Mean Well Enterprises	XLG-100-H-AB	lights used in the light assay
Square Petri Dish with Grid, sterile	Simport Scientific	D21016	used to hold MS media for arabidopsis seedlings
surgical tape	3M	1530-1	tape used to seal plates
tween 20	biorad	9005-64-5	surfactant used to assist seed sterilization