엽록소 형광 분석에 의한 광호흡 돌연변이체의 광합성 효율 평가

요약

우리는 엽록소 형광을 사용하여 낮은_CO2 로 처리 한 후 식물에서 광합성 효율의 변화를 측정하는 접근법을 설명합니다.

초록

광합성과 광호흡은 식물의 1차 대사에서 가장 큰 탄소 플럭스를 나타내며 식물 생존에 필요합니다. 광합성과 광호흡에 중요한 많은 효소와 유전자는 수십 년 동안 잘 연구되어 왔지만 이러한 생화학 적 경로의 일부 측면과 여러 세포 하 과정과의 혼선은 아직 완전히 이해되지 않았습니다. 식물 대사에 중요한 유전자와 단백질을 확인한 많은 작업은 자연 및 농업 환경에서 광합성과 광호흡이 어떻게 기능하는지 가장 잘 나타내지 않을 수있는 고도로 통제 된 환경에서 수행되었습니다. 비생물적 스트레스가 광합성 효율을 손상시킨다는 점을 고려할 때, 비생물적 스트레스와 광합성에 미치는 영향을 모두 모니터링할 수 있는 고처리량 스크린의 개발이 필요합니다.

따라서, 우리는 엽록소 형광 분석 및 낮은_CO2 스크리닝을 사용하여 광호흡에서 역할을 하는 특성화되지 않은 유전자를 식별할 수 있는 비생물적 스트레스로 인한 광합성 효율의 변화를 스크리닝하는 비교적 빠른 방법을 개발했습니다. 이 논문은 애기장대 탈리아나에서 전달된 DNA(T-DNA) 녹아웃 돌연변이체의 광합성 효율 변화를 연구하는 방법을 설명합니다. 동일한 방법을 에틸 메탄술포네이트(EMS) 유도 돌연변이체 스크리닝 또는 억제기 스크리닝에 사용할 수 있습니다. 이 방법을 활용하면 식물 1 차 대사 및 비 생물 적 스트레스 반응에 대한 추가 연구를위한 유전자 후보를 식별 할 수 있습니다. 이 방법의 데이터는 증가 된 스트레스 환경에 노출 될 때까지 인식되지 않을 수있는 유전자 기능에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.

서문

농부의 밭에서 흔히 볼 수있는 비 생물 적 스트레스 조건은 광합성 효율을 감소시켜 작물 수확량에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 열파, 기후 변화, 가뭄 및 토양 염분과 같은 해로운 환경 조건은 CO₂ 가용성을 변경하고 높은 빛 스트레스에 대한 식물의 반응을 감소시키는 비 생물 적 스트레스를 유발할 수 있습니다. 가장 큰 두 개의 육상 탄소 플럭스는 식물 성장과 작물 수확량에 필수적인 광합성과 광호흡입니다. 이러한 과정에 관여하는 많은 중요한 단백질과 효소는 실험실 조건에서 특성화되었으며 유전 수준¹에서 확인되었습니다. 광합성과 광호흡을 이해하는 데 많은 진전이 있었지만 식물 세포 기관 간의 수송을 포함한 많은 단계가 특성화되지 않은 상태로 남아 있습니다 ^2,3.

광합성 후 식물에서 두 번째로 큰 탄소 플럭스 인 광호흡은 효소 Rubisco가 이산화탄소 대신 산소를 리불 로스 1,5 비스 포스페이트 (RuBP)에 고정시켜 억제 화합물 2- 포스 포 글리콜 레이트 (2PG)¹. 2PG의 억제 효과를 최소화하고 이전에 고정 된 탄소를 ....

프로토콜

1. 종자 준비 및 살균

알림: 종자 준비는 종자 흡수와 종자 살균으로 구성됩니다. 이러한 모든 단계는 멸균 상태를 유지하기 위해 층류 후드에서 수행되어야한다는 점에 유의해야합니다. 필요한 모든 재료, 시약 및 성장 배지는 오토클레이브되어야 합니다( 재료 표 참조).

1. 종자 흡수 및 층화
   참고: 사용된 시드 라인은 plgg1-1 (salk_053463), abcb26 (salk_085232) 및 와일드형(WT, Col-0)입니다.
   1. 씨앗을 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 분주합니다. 층류 후드의 멸균 된 물에 씨앗을 흡수하고 어둠 속에서 4 ° C에서 2 일 동안 층화합니다.
2. 종자 살균
   1. 멸균 조건에서 50%(v/v) 표백제 용액 10mL를 준비하고 트윈 20 약 20μL를 추가합니다. 종자 살균을 위해 흡수 된 종자에서 물을 제거하고 표백제 용액 1mL를 미세 원심 분리기 튜브에 넣고 실온에서 5 분 동안 배양합니다.
   2. 피펫으로 표백제를 제거하십시오.
   3. 씨앗을 멸균수 1mL로 헹구어 재현탁합니다. 씨앗이 바닥에 가라 앉으면 물을....

결과

결과는 WT 및 시험 돌연변이체의 주변 및 낮은_CO2 스크리닝으로부터의 원시 및 형광 이미지의 플레이트 이미지를 보여준다. 각 묘목은 면적 번호로 표시되어 있으며 해당 형광 판독값은 QY로 제공됩니다. 데이터는 텍스트 파일로 내보내지고 분석을 위해 스프레드시트에서 열 수 있습니다(보충 표 S1 참조). 돌연변이 라인 plgg1-1 및 abcb26은 광호흡 스트레스와 관련된 .......

토론

이 백서에 설명된 실험 방법에는 몇 가지 장점과 한계가 있습니다. 한 가지 장점은이 방법이 많은 식물 묘목을 스크리닝 할 수 있다는 것입니다., 도금 및 성장 과정에서 식물 매체 플레이트의 오염을 방지하기 위해 몇 가지 예방 조치를 취해야합니다. 따라서 애기장대 판을 수술 용 테이프로 밀봉하는 것이 중요합니다. 이 실험의 또 다른 장점은 이전에 발표 된 작업⁸에 비해 12 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	VWR	10810-070	container for seed sterilization
agarose	VWR	9012-36-6	chemical used to suspend seeds for ease of plating
Arabidopsis thaliana seeds (abcb26)	ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_085232	arabidopsis seeds used as experimental group
Arabidopsis thaliana seeds (plgg1-1)	ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_053469C	parental arabidopsis seeds
Arabidopsis thaliana seeds (WT)	ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org	Col-0	arabidopsis wild type seeds used as a control group
bleach	clorox	generic bleach	chemical used to sterilize seeds
Carbolime absorbent	Medline products	S232-104-001	CO2 absorbent
Closed FluorCam	Photon Systems Instruments	FC 800-C	Fluorescence imager
FluoroCam FC 800-C	Photon Systems Instruments	Closed FluorCam FC 800-C/1010-S	Fluorescence imager
FluoroCam7	Photon Systems Instruments	Closed FluorCam FC 800-C/1010-S	Fluorescence image analysis software
Gelzan (plant agar)	Phytotech labs	71010-52-1	chemical used to solidify MS media as plates
glass flask 1 L	Fisherbrand	FB5011000	container for making and autoclaving MS media
growth chamber	caron	7317-50-2	growth chamber used to grow plants
Murashige & Skoog Basal Medium with Vitamins & 1.0 g/L MES (MS)	Phytotech labs	M5531	growth media for arabidopsis seedlings
potassium Hydroxide (KOH)	Phytotech labs	1310-58-3	make as 1 M solution for ph adjustment
spider lights	Mean Well Enterprises	XLG-100-H-AB	lights used in the light assay
Square Petri Dish with Grid, sterile	Simport Scientific	D21016	used to hold MS media for arabidopsis seedlings
surgical tape	3M	1530-1	tape used to seal plates
tween 20	biorad	9005-64-5	surfactant used to assist seed sterilization